上海市臨檢中心 PCR培訓(xùn)班 如何解讀肝炎病毒核酸定量檢測(cè)結(jié)果

如何解讀肝炎病毒核酸定量檢測(cè)結(jié)果瑞金醫(yī)院

感染科張欣欣乙型肝炎病毒核酸HBVDNAPrevalence

ofHBsAginChinaSero-epidemiologicalSurvey2006

81,775

personssurveyed

in

160registries

in31provinces;

HBsAg

prevalence:

7.18%(9.72%in

1992)Liang

XF

etal.

Vaccine,2009,6550-6557HBV基因組Hunt

etal.

Hepatology

2000;

31:1037.乙型肝炎實(shí)驗(yàn)室診斷Markers

ofthevirusAntibodies

tothevirus

Anti-HBc,

Anti-HBc-IgM

Anti-HBe

HBV

DNA

HBeAg

HBsAg

Anti-HBs

cccDNASeverity

ofliver

damage

BilirubinMarkers

ofliver

damage

ALT

Albumin

AST

Prothrombintime

Bilirubin5HBV

DNA定量的臨床意義

病毒復(fù)制的指標(biāo)

長(zhǎng)期感染臨床轉(zhuǎn)歸預(yù)測(cè)

抗病毒治療指征

抗病毒治療應(yīng)答評(píng)估，及時(shí)調(diào)整治療方案

隱匿性乙肝病毒感染的診斷

病毒變異的提示慢性

HBV

感染自然過程ImmuneToleranceImmuneClearanceLow

ReplicativePhaseReactivationPhaseHBeAg-/anti-HBe+(precore/core

promoter

variants)HBeAg+<><>>

2000

IU/mL<

2000

IU/mLHBVDNA2

x

108-2

x

1011

IU/mL200,000

-2x

109IU/mLALTNormal/mildCHModerate/severe

CHCirrhosisNormal/mild

CHModerate/severe

CHCirrhosisInactive

cirrhosisHBeAg+chronic

hepatitisInactive-carrier

stateHBeAg-chronic

hepatitis7Slide

courtesy

of

A.S.F.

Lok,

MD.HBV病毒載量與肝硬化、肝癌發(fā)生顯著相關(guān)R.E.V.E.A.L.各指南抗病毒治療適應(yīng)癥對(duì)照20052007200820082009中國(guó)指南AASLDAPASLKeeffeEASLHBeAg(+)

HBVDNAHBVHBVHBV≥105cp/mLDNA>20,000

DNA>20,000

DNA>20,000CHB患者HBVDNA>2,000HBVDNA>2,000

IU/mLIU/mLHBVIU/mLHBVIU/mLHBeAg(-)

HBVDNA≥104cp/mLDNA>2,000

DNA>2,000

IU/mLIU/mL

IU/mLCHB患者ALT≥2ULN或ALT

ALT>2ULN

ALT>2ULN，

ALT>ULN，

或

和/或血清或年齡>40

ALT正常但年齡

ALT>ULN且歲且ALT接

>35-40歲，證

肝組織活檢<2ULN，但肝組織學(xué)顯示Knodell

HAI≥4或≥G2炎癥壞死或ALT<2ULN肝活檢顯示中重度炎癥或顯著纖維化近ULN的患實(shí)有組織學(xué)病

或有效的非者，建議進(jìn)

變行肝活檢創(chuàng)傷性指標(biāo)≥MetavirA2F2中國(guó)慢乙肝防治指南對(duì)口服抗病毒藥物治療慢乙肝療程的建議HBeAg（+）:

≥1年HBV

DNA轉(zhuǎn)陰、ALT復(fù)常且發(fā)生e抗原血清轉(zhuǎn)換后繼續(xù)治療12月（

≥2年

）HBeAg（-）:

≥1年HBV

DNA轉(zhuǎn)陰、ALT復(fù)常后繼續(xù)治療18月（≥2.5年)慢性乙型肝炎防治指南

Chinese

Hepatology

,Dec

2005

,Vol

10

,No.

4：348～3572009EASL指南推薦的治療終點(diǎn)對(duì)于

HBeAg(+)

及

HBeAg(-)患者，理想的治療終點(diǎn)是持久的HBsAg轉(zhuǎn)陰

(不論是否伴隨血清轉(zhuǎn)換至

anti-HBs)對(duì)于

HBeAg(+)

患者，持久的

HBeAg血清轉(zhuǎn)換是令人滿意的終點(diǎn)對(duì)于尚未達(dá)到

HBeAg血清轉(zhuǎn)換的

HBeAg(+)

患者、及HBeAg(-)患者，基本的治療終點(diǎn)是

HBVDNA

持續(xù)處于不可測(cè)水平EASL.

J

Hepatol

2009;50:227–242.根據(jù)HBV

DNA的應(yīng)答調(diào)整治療方案12周評(píng)估原發(fā)無應(yīng)答24周評(píng)估早期療效預(yù)測(cè)因素完全應(yīng)答PCR檢測(cè)HBVDNA

陰性部分應(yīng)答HBVDNA不充分應(yīng)答HBVDNA

≥2000IU/mL60到

<2000

IU/mL繼續(xù)治療每6個(gè)月監(jiān)測(cè)增加另一種沒有交叉耐藥的藥物,

或者繼續(xù)每3個(gè)月監(jiān)測(cè)增加另一種沒有交叉耐藥的藥物或換成另一種更強(qiáng)效的藥物,

并且每3個(gè)月監(jiān)測(cè)1.YFLiaw.

Antiviral

therapy

2009

14:

13-222.Keeffe

E,etal.

ClinGastroenterol

Hepatol.

2006;6:1315-41治療中DNA監(jiān)測(cè)對(duì)持續(xù)應(yīng)答的預(yù)測(cè)LAM

治療52周1ETV治療52周2LdT治療52周1HBeAg+95HBeAg+HBeAg+9610084806040200503320=146317160

153203

255<QL≥QL<QL

≥QL<QL≥QLHBV

DNA水平1.

Zeuzem

Setal.

JHepatol;

2009;

51:

11–20;2.

Yurdaydin

Cetal.

JHepatol

2006;

44

(Suppl

2):

S36.

Abstract

80.HBVDNAandHBsAg

arekeytodiagnosis

andmonitoringof

CHBHBsAg

andHBVDNA

provide

different

butcomplementary

informationPresence

ofHBsAginserum

for>6monthsdefinesCHBBrunetto

Editorial.

JHepatol

2010HBV

DNA

and

HBsAg:Complementarymarkers

formonitoringCHB

patientsInhibitViralReplicationEstablishImmune

ControlQuantitativeHBV

DNAQuantitativeHBsAgOptimize

HBV

Treatment

andImprovePatient

OutcomesHBsAg

levelsprovidesseparationbetween

relapsersand

respondersHBeAg-positive

patients

treated

with

PEG-IFN-2b

+/-

lamivudine

for

52

weeksSustainedresponders(N=12)*8Relapsers(N=18)**4Non-responders

(N=18)7654323211TreatmentperiodTreatmentperiod12

24Time(weeks)00012244872960487296Time(weeks)*HBV

DNAundetectable

byPCR1

yearpost-treatment**HBV

DNAundetectableat

EOTbut

detected

infollowing

24weeksMoucari

et

al.

Hepatology

2009Different

tests

provide

different

levelsofinformation

oninfection

andresponsetotherapyDemonstrate

sustainedresponse/indicate

immunityAnti-HBsPredictsustainedresponseQuantHBsAgIdentify

initialresponseHBeAg,

HBV

DNAHBVDNA,

ALTInitiatetherapyHBsAg,

HBeAg,anti-HBe,anti-HBc

IgMDiagnoseModified

from

Pawlotsky

et

al.

Gastroenterol

2008野生型病毒及其變異株自然界物種普遍存在變異，變異是生物適應(yīng)環(huán)境謀求生存的重要方式，對(duì)遺傳進(jìn)化有重要意義。

野生型病毒包括多種有差異的毒株，表現(xiàn)為不同的基因型、亞型

病毒變異是指基因型以外的改變

變異類型：點(diǎn)突變、重組、移框突變病毒變異的結(jié)果

負(fù)性選擇：發(fā)生對(duì)病毒自身是致死性的或有害的改變

適應(yīng)性選擇：復(fù)制能力增強(qiáng)

逃避免疫清除：一處或多處氨基酸替代改變了病毒表位

耐藥逃逸：病毒基因序列中有效靶位的改變,停藥后野毒株可重新成為優(yōu)勢(shì)株，抗藥性可以消失PreC突變和HBeAg陰性的慢性乙型肝炎（A）（B）ATGATGTAGATGDNAATGTAGDNAP25e終止密碼內(nèi)質(zhì)網(wǎng)？可變裂解部位血清固定裂解部位P15-18e組裝病毒P21CP21C組裝病毒ATG啟動(dòng)密碼子，TAG終止密碼子。單線表示DNA，條帶表示抗原蛋白，灰?guī)П硎拘盘?hào)肽。由第一個(gè)（前C）ATG編碼HBeAg的前體P25e，裂解為HBeAg（P15-18e）；由第二個(gè)（C基因）ATG編碼HBcAg（P21C）。前C區(qū)A83變異使HBeAg

缺失。P25e的殘端作用不明。Precore

mutations

are

morelikely

withHBV

genotypes

B,

C,D,ELoopLoopBulgeBulgeStem

IIStem

II1858TG18961858TA1896Stem

IStem

IEnhancedstability

basepairingWild

TypePrecoreMutantHBVVariantsandHBeAg

Titre

invivoPC/BCP

variants

reduce

HBeAgtitre1600014000120001000080006000400020000WildtypeBCPPCMann-WhitneyU-Test

p<0.05HBeAgcorrelatedweaklywith

serumHBV

DNAHBeAg

:

V

iral

lo

adr=0.35p

=0.0015.E+004.E+004.E+003.E+003.E+002.E+002.E+001.E+005.E-010.E+00024681012Log

VL

(copies/ml)Prevalence

of

HBeAg-ve

CHB

AmongHBsAg

Carriers

in

AsiaJapan19%China

21%Taiw

an20%11%India16%Hong

KongIn

Asia

amedian

of50%(range

19-100%)

of

HBeAg-ve

CHB

patients

have

precoremutantsHBsAg突變的產(chǎn)生及其臨床意義

Naturally

occurring

(variations)

Vaccination

Injections

of

HBIG

Mutations

inthe

overlapping

polymerasegene

(antiviral-drug

-associated

)Mutant

virusesmayescapedetectionbycertaincommercial

HBsAgkits

Mutations

identifiedfromthe

“a”determinant(124aa-147aa)

to

the

majorhydrophilicregion(MHR,99aa-169aa)

Naturallyoccurring

orcaselection

pressureHBsAg

negative

hepatitisB(OcculthepatitisBinfection,OBI

)PatholBiol

(Paris).

2010

Mar18.

[Epub

aheadofprint]Copyright

?2009

BlackwellPublishing

Ltd隱匿性乙肝Anti-HBc滴度與HBV載量關(guān)系（s陰性獻(xiàn)血員）Copyright

?2009

BlackwellPublishing

Ltd核苷(酸)類似物作用靶點(diǎn)及RT區(qū)基因突變拉米夫定阿德福韋恩替卡韋替比夫定有感染性的乙肝病毒顆粒有感染性的乙肝病毒顆粒HBsAg衣殼DNA多聚酶RT部分雙鏈DNA(-)-DNA被包裹的前基因組mRNAA(n)mRNAcccDNAAntiviral-drug

–associatedpotentialvaccine

mutants

(ADAPVMs)0耐藥突變的檢測(cè)方法

Sequences

analysis

Lineprobeassay

PCR-RFLPanalysis

Real-timePCR

DNAchip

質(zhì)譜測(cè)定法(MALDI-TOF

MS)

高通量測(cè)序檢測(cè)方法敏感度影響臨床判斷1098野生型病毒耐藥病毒76543Amplicor

HBV監(jiān)測(cè)?

V2.021抗病毒治療持續(xù)時(shí)間Roche

Amplicor

HBVMonitor?

productinformation

()丙型肝炎病毒核酸HCV

RNA我國(guó)人群血清HCV抗體的陽性率0.58%我國(guó)六大省市血清HCV抗體陽性率源自:2007年P(guān)LoS

ONE0.72%推測(cè)上海自然人口血清HCV抗體陽性率源自：黃翀、仇德琪、張欣欣，2009，肝臟2007年瑞金醫(yī)院各科室患者HCV抗體陽性檢測(cè)出率HCV

感染實(shí)驗(yàn)診斷

血清學(xué)特異性抗

HCV抗體

(anti-HCV)檢測(cè)方法:酶免法，化學(xué)發(fā)光法確認(rèn)實(shí)驗(yàn)

(RIBA

=recombinantimmunoblot

assay)HCV核心抗原(HCVcoreAg)

核酸檢測(cè)HCV-RNA

PCR基因型及亞型檢測(cè)DNA序列分析，芯片丙型肝炎病毒基因組及其編碼的蛋白HCV

RNA定量的臨床意義

病毒復(fù)制的指標(biāo)

診斷病毒感染，縮短窗口期

抗病毒治療指征

抗病毒治療應(yīng)答評(píng)估，及時(shí)調(diào)整治療方案HCV

感染血清學(xué)75%左右急性感染進(jìn)展為慢性感染15%左右急性感染痊愈癥狀

±抗-HCV抗-HCV癥狀±HCV-RNAHCV-RNAHCV核心抗原HCV核心抗原ALTALT正常正常月年月年暴露后時(shí)間暴露后時(shí)間病毒核酸及抗原檢測(cè)可縮短窗口期早期發(fā)現(xiàn)感染，早期治療HCV

RNAHCV

抗原感染日：0HCV

RNA：12天HCV抗原：12~15天抗HCV：30~70天HCV

抗體0102030405060708090100第三代抗體檢測(cè)第一代抗體檢測(cè)HCV抗原HCV

RNA第二代抗體檢測(cè)40丙肝抗體檢測(cè)結(jié)果可能與臨床不符HCV

抗原HCVRNA抗HCV說明陰性陽性陰性未感染陽性活動(dòng)性感染（急性或慢性）早期感染陰性陽性陽性陰性免疫抑制患者的慢性感染既往感染假抗HCV反應(yīng)性結(jié)果“被動(dòng)”

獲得的抗體抗病毒治療目的

清除或持續(xù)抑制體內(nèi)HCV，獲得持續(xù)病毒學(xué)應(yīng)答(SVR)

穩(wěn)定或減輕肝損害、防止進(jìn)展為肝硬化、肝衰竭或HCC

改善患者的生活質(zhì)量抗病毒治療應(yīng)答的定義Marc

G.Ghany

etal,AASLD

2009根據(jù)HCV

RNA定量結(jié)果決定抗病毒治療療程（RGT策略）影響抗病毒治療療效的因素

治療因素：

宿主因素：?

藥物類型?

肥胖?

患者依從性?

不良反應(yīng)處理?

年齡?

合并感染?

合并慢性病?

應(yīng)答情況

應(yīng)答快慢

應(yīng)答程度

疾病進(jìn)展：?

纖維化/肝硬化?

感染時(shí)間?

基因型?

病毒載量?

病毒準(zhǔn)種Ferenci

P.

SeminLiver

Dis.2004;24:25-31.NIH

Consensus

Development

Conference

Statement.Gastroenterology.

2002;123:2082-2099.HCV分為6個(gè)基因型QuasispeciesHCV感染宿主后，經(jīng)一定時(shí)期，在感染者體內(nèi)形成以一個(gè)優(yōu)勢(shì)株為主的相關(guān)突變株病毒群，稱為準(zhǔn)種Geographic

distributionofHCVgenotypes

inChinaOther

genotypesGenotype6a1.8%6.5%(149/2281)(42/2281)Genotype2a14.3%(327/2281)Genotype177.3%(1763/2281)Chen

etal,HBPDInt2002,;

1:194-201基線因素對(duì)SVR率具有顯著影響派羅欣+RBV;

*p<0.0577*76*8070605040302010070*69*67*64*6