上海市臨檢中心 二代測序NGS 1-NGS在腫瘤和遺傳性疾病診斷中的應用

生物科學與技術研究所

教授

博導上海市遺傳學會常務理事中國遺傳學會理事翼和生物

首席科學家201

年

月

重慶目錄NGS簡介NGS在腫瘤診斷中的應用

遺傳性腫瘤突變檢測

腫瘤個體化醫(yī)療

腫瘤異質性的解決方案NGS在遺傳性疾病診斷中的應用

遺傳疾病篩查

無創(chuàng)產(chǎn)前診斷

胚胎植入前基因診斷/篩查兩種擴增子建庫的新方案簡介NGS簡介二代測序的特征：高通量?在成百萬、上千萬、數(shù)十億個物理位置，同時進行大規(guī)模的并行測序。?位置的識別：微孔（Life

PGM平臺）；DNA芯片（

Illumina平臺）2代測序的支撐：精密加工能力、創(chuàng)新的實驗原理、大規(guī)模數(shù)據(jù)處理的能力NGS簡介二代測序的測序結果：獲得樣本中每個DNA模板分子的單分子序列信息?

二代測序的原始結果，以reads形式呈現(xiàn)?

一個read就是一個模板DNA分子的序列信息?

覆蓋一個位置的reads個數(shù)，就是該位置的測序深度。PGM平臺：每個微球只包含一個模板DNA分子的擴增產(chǎn)物NGS簡介二代測序的技術流程核酸樣本建庫測序生信分析樣本：DN，RN必須反轉錄成

DNA測序引物測序引物

barcode插入片段barcode建庫產(chǎn)物測序平臺：PG、Mise、HISE

、X10等；試劑盒：2*150,2*30

等數(shù)據(jù)分析：Mappin

，突變等序列變化的檢出；或序列denovo組裝NGS簡介各類建庫方案的特點及應用二大建庫策略：

全基因組的打斷建庫:

可以獲得樣本基因組的所有序列信息。測序費用高、不適合大量樣本的分析。全基因組碎片化

目標區(qū)段捕獲測序：測有限目標區(qū)段（外顯子、候選基因等）的序列。費用低，可以開展大量樣本的分析。目標區(qū)段直接捕獲NGS簡介目標區(qū)段捕獲測序的建庫方案總覽雜交法固相捕獲芯片液相捕獲芯片MIPS（分子倒置探針連接測序）法暫無商業(yè)公司使用該技術多重PCR擴增法采用該技術的公司有翼和、Illumina、LifeNGS簡介目標區(qū)段捕獲測序雜交捕獲測序目標區(qū)段擴增捕獲測序優(yōu)點：可以捕獲大片段DNA，甚至可以捕獲全基因組中的全部外顯子區(qū)段的DNA。優(yōu)點：操作簡單、方便，探針雜交PCR擴增，將目標區(qū)段擴增

價格相對便宜。并加上建庫引物和BARCODE捕獲DNA打斷缺點：技術要求高、不能捕獲片段不能太多，太多不合算。一般建議測序總長控制在100kb以內。缺點：操作相對繁瑣、難度大、費用較高（捕獲探針定制費用，每個樣本數(shù)百元的建庫試劑費用）建庫測序測序目前主流的擴增技術：修飾引物的擴增NGS在腫瘤診斷中的應用?

遺傳性腫瘤突變檢測-預防和評估?

腫瘤個體化醫(yī)療-精準治療?

腫瘤組織異質性的解決方案-預后和預防三類樣本:?

基因組DNA樣本（血液、口腔式子）?

腫瘤組織DNA樣本?

血液中循環(huán)腫瘤細胞DNA（ctDNA）遺傳性腫瘤突變檢測?

在所有的腫瘤中，有

90%-95%是由基因突變與環(huán)境共同作用而引發(fā)的，是屬于“后天獲得”。而有

5%~10%

的腫瘤是由遺傳性的基因突變引起的，也就是說這部分人天生就有較高的腫瘤發(fā)病風險。通過全基因組測序或者全基因組外顯子測序能夠對癌癥相關基因進行深度測序和全面分析，實現(xiàn)對個人基因組信息的詳細解讀。腫瘤個體化醫(yī)療?

每位腫瘤患者攜帶的突變

基因、突變位點不同，導致了患者對腫瘤藥物的反應各不相同。?

基因檢測通過高通量測序技術

,檢測和分析靶向藥物相關

基因的突變狀態(tài)

,從而幫助醫(yī)生為患者篩選出最可能從中受益的靶向藥物。?

以非小細胞肺癌的靶向治療為例，吉非替尼對于EGFR基因突變陽性的患者具有較好的療效，而對于不攜帶這一突變的患者療效不佳。腫瘤個體化醫(yī)療精準醫(yī)療FoundationFocus

CDxBRCA?

FDA

批準

FoundationFocus

CDxBRCA

伴隨診斷檢測與

Rubraca

一起使用，它是

FDA

批準的首個基于新一代基因測序（NGS）的伴隨診斷檢測。?

美國

FDA

加速批準

Rubraca（rucaparib）用于治療患有某種類型卵巢癌的婦女。Rubraca

被批準用于腫瘤攜帶一種特定基因突變（有害的

BRCA），且已使用兩種或多種化療藥物治療過的晚期卵巢癌女性。?

Rubraca與FoundationFocus?

CDxBRCA的這一種Codevelopment也是FDA批準CDx的典型代表，即藥物與診斷同步研發(fā)、同步提交、同步獲批。?

技術方案：雜交捕獲測序(平臺為illumina

Hiseq4000），測序目標基因BRCA1和BRCA2，平均測序深度大于500X，99%的外顯子測序深度大于100X。Oncomine

DX

Target

Test?

FDA批準Oncomine

DX

Target

Test則標志著FDA在監(jiān)管理念上的一大突破，即突破了原有的“One

CDx,OneTreatment”升級為“One

CDx,Three

Treatments”。?

Oncomine

DxTarget

Test同時評估臨床上與非小細胞肺癌相關的23個基因。分析結果可用來確定患者是否有資格接受以下治療，包括：阿斯利康的EGFR抑制劑Iressa、輝瑞的ALK和ROS1抑制劑Xalkori，以及諾華的MEK抑制劑Mekinist和RAF抑制劑Tafinlar組合。?

技術方案：擴增子建庫，Ion

torrent平臺ExtendedRASPanel?

Illumina公司與安進公司共同開發(fā)了一個伴隨診斷檢測試劑盒，可檢測KRAS和NRAS基因中的56個變異。臨床醫(yī)師可以鑒別那些可能得益于通過Vectibix進行治療的具有野生型RAS基因的患者。?

技術方案：雜交捕獲后、連接、擴增子建庫。（

MiseqDX平臺）。?

檢測樣本：腫瘤組織。MSK-IMPACT?

2017年11月15日，美國FDA正式批準了紀念斯隆凱特琳癌癥研究中心（MSK）的癌癥基因檢測分析平臺MSK-IMPACT用于腫瘤基因檢測。?

MSK-IMPACTTM可快速檢測與癌癥相關的468個獨特基因上的所有蛋白質編碼突變、拷貝數(shù)變異、啟動子突變以及結構重排。不同于常規(guī)檢測，MSK-IMPACTTM適用于任何腫瘤類型。?

技術方案：利用羅氏固相芯片雜交捕獲測序，測序平臺為illumina

的Hiseq2500?；颊叩难簶颖咀鳛檎NA的來源，測序后作為對照序列。FoundationOne

CDx?

2017年11月30日，F(xiàn)DA批準了FoundationMedicine的旗艦產(chǎn)品FoundationOne

CDx，用于非小細胞肺癌、黑色素瘤、乳腺癌、結直腸癌、以及卵巢癌的臨床診療。?

該檢測分析實體瘤患者FFPE樣本的324個基因多種突變及特定融合，并進一步分析兩個基因組學特征——微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（MSI）和腫瘤突變負荷（TMB），檢測結果可用于指導15種靶向藥物的臨床使用。?

技術方案：雜交捕獲(測序平臺Hiseq4000)。腫瘤異質性的解決方案：獨特分子標簽（

UMI）?

由體細胞突變驅動的腫瘤疾病中，腫瘤是高度異質性的，由于背景噪音的存在，標準的二代測序技術難以檢測突變頻率低于1%的異質化樣本。?

獨特分子標簽(unique

molecularidentifiers,

UMI)的存在可以提高低頻突變檢測的準確度。?

UMI是一類寡核苷酸的統(tǒng)稱，通常被設計為長度在12到14堿基的一串隨機序列(比如NNNNNNN)，或者簡并堿基序列(比如NNNRNYN)

。?

在一個反應體系中，UMI的序列種類數(shù)遠超模板分子數(shù)，這樣保障每個模板分子加上一個特異序列的標簽。獨特分子標簽（

UMI）的分析原理：區(qū)分真實突變和PCR擴增及測序帶來的假陽性突變獨特分子標簽（

UMI

）的添加方案

：選擇性環(huán)化捕獲?

安捷倫公司以選擇性環(huán)化捕獲為基礎，針對目標區(qū)段低頻率突變檢測推出了HaloPlexHS。首先將模板片段化，隨后利用選擇性環(huán)化捕獲將目標區(qū)段捕獲，與傳統(tǒng)的選擇性環(huán)化捕獲不同的是，HaloPlexHS的捕獲探針攜帶有分子標簽(molecular

marcodes)，通過環(huán)化捕獲，樣本被添加上UMI序列。獨特分子標簽（

UMI

）的添加方案

：單鏈擴增?

Qiagen公司利用連接后單鏈擴增進行文庫富集和添加UMI序列，推出了QIAseq

Targeted

DNA/RNAPanels試劑盒

。腫瘤異質性的解決方案?

在2015年的中國臨床腫瘤學會(CSCO)

大會上，貝瑞和康推出了自主研發(fā)的游離DNA富集技術，環(huán)化單分子擴增和重測序技術（Circulating

Single-Molecule

Amplification

andResequencing

Technology，cSMART）。腫瘤異質性的解決方案?

在2015年的中國臨床腫瘤學會(CSCO)

大會上，貝瑞和康推出了自主研發(fā)的游離DNA富集技術，環(huán)化單分子擴增和重測序技術（Circulating

Single-Molecule

Amplification

andResequencing

Technology，cSMART）。腫瘤異質性的解決方案：

“Firefly?”?

2016年的CSCO大會，安可濟公司推出自主研發(fā)的“Firefly?”游離DNA靶向測序技術，采用單鏈環(huán)化DNA滾環(huán)復制串聯(lián)重復確認法

。?

線性富集始終保持以原始DNA為模板，某次合成出現(xiàn)的突變不會繼承傳遞；所以，借助線性擴增，聚合酶的合成錯誤不會因為指數(shù)擴增而被無限放大。NGS在遺傳性疾病診斷中的應用?

遺傳性疾病的種類超過5000種，有單基因遺傳病，也有包括常見的高血壓、糖尿病和血脂異常等多基因相關疾病。遺傳病具有先天性，終生性，家族性、病種多和發(fā)病率高等特點。遺傳疾病篩查?

利用目標區(qū)域捕獲高通量測序技術，一次性檢測多種常見單基因遺傳病，針對育齡夫婦進行遺傳性疾病篩查或者對新生兒進行遺傳代謝疾病篩查。遺傳疾病篩查?

通過采集受檢者外周血、足跟血或唾液樣本，對樣本中的DNA進行測序和生物信息分析，得出受檢者是否攜帶遺傳性疾病。無創(chuàng)產(chǎn)前診斷(NIPT)?

1997年，香港中文大學的盧煜明教授第一次在孕婦外周血中發(fā)現(xiàn)了胎兒的游離DNA。這一發(fā)現(xiàn)與NGS結合，發(fā)明了無創(chuàng)DNA產(chǎn)前檢測。僅需采取孕婦靜脈血，并對母體外周血漿中的游離DNA片段（包含胎兒游離DNA）進行測序，并將測序結果進行生物信息分析，可以從中得到胎兒的遺傳信息，從而檢測胎兒是否患三大染色體疾病。NIPT?

唐氏綜合征又稱為三體綜合征、先天愚型或Down綜合征，是最常見的染色疾病，新生兒的發(fā)病率于母親的年齡有關。年齡越大，新生兒得唐氏兒的幾率就越高。NIPT?

A：胎兒頸部透明帶檢測

B：唐氏篩查

C：羊水穿刺PGD?

PGD是胚胎種植前基因診斷(preimplantation

genetic

diagnosis)?

PGD主要用于檢查胚胎是否攜帶有遺傳缺陷的基因。PGDPGDPGS?

PGS

：胚胎植入前遺傳學篩查（

Preimplantation

Genetic

Screening）?

對早期胚胎進行染色體數(shù)目和結構異常的檢測