第四章藥物定量分析與分析方法驗證演示文稿

第四章藥物定量分析與分析方法驗證演示文稿目前一頁\總數(shù)五十二頁\編于十八點優(yōu)選第四章藥物定量分析與分析方法驗證目前二頁\總數(shù)五十二頁\編于十八點

一、概述

為什么要對定量分析的樣品進(jìn)行前處理？

含鹵素有機(jī)藥物R-X（F，Cl,Br,I）

金屬有機(jī)藥物R-O-Me（有機(jī)酸或酚的含金屬有機(jī)藥物金屬鹽；結(jié)合不牢固）

有機(jī)金屬藥物R-Me

（結(jié)合牢固）

第一節(jié)定量分析樣品的前處理方法Pretreatmentofsampleusedinquantitativeanalysis目前三頁\總數(shù)五十二頁\編于十八點含鹵素藥物C—X乙烯型鹵和芳鹵烯丙型鹵和芐鹵鹵代烷型鹵素活潑性I＞Br＞Cl＞F分子中所含鹵原子的個數(shù)越多，活潑性越強(qiáng)；同一碳上含多個鹵原子或一個苯環(huán)上含多個鹵原子時，活潑性增強(qiáng)更加明顯第一節(jié)定量分析樣品的前處理方法目前四頁\總數(shù)五十二頁\編于十八點三氯叔丁醇六氯對二甲苯泛影酸碘他拉酸第一節(jié)定量分析樣品的前處理方法目前五頁\總數(shù)五十二頁\編于十八點第一節(jié)定量分析樣品的前處理方法水解后測定不經(jīng)有機(jī)破壞經(jīng)有機(jī)破壞直接測定配位滴定法氧化還原滴定法堿水解酸水解經(jīng)還原分解后測定濕法破壞——凱氏定氮法干法破壞高溫灼燒法氧瓶燃燒法二、常用樣品處理方法目前六頁\總數(shù)五十二頁\編于十八點第一節(jié)定量分析樣品的前處理方法(一)、直接測定法葡萄糖酸鈣EDTA配位滴定富馬酸亞鐵鄰二氮菲-硫酸鈰滴定葡萄酸銻鈉間接碘量法適用范圍：金屬原子不直接于碳原子相連或某些C-M鍵結(jié)合不牢固的有機(jī)金屬藥物。目前七頁\總數(shù)五十二頁\編于十八點第一節(jié)定量分析樣品的前處理方法1、堿水解法三氯叔丁醇銀量法返滴定適用范圍：含鹵素有機(jī)藥物結(jié)構(gòu)中鹵素原子結(jié)合不牢固的藥物。(二)、經(jīng)水解后測定法目前八頁\總數(shù)五十二頁\編于十八點2、酸水解法EDTA配位滴定第一節(jié)定量分析樣品的前處理方法目前九頁\總數(shù)五十二頁\編于十八點第一節(jié)定量分析樣品的前處理方法(三)經(jīng)氧化還原后測定適用范圍：碘原子直接與芳環(huán)連接的含碘有機(jī)化合物。1.堿性還原后測定例如：泛影酸的含量測定2.酸性還原后測定例如：碘番酸的含量測定Zn還原后銀量法目前十頁\總數(shù)五十二頁\編于十八點3.利用藥物中可游離的金屬離子的氧化性測定含量

（1）含銻藥物例如：葡萄糖酸銻的含量測定

Sb5++2KISb3++2K+

++I2I2+2Na2S2O32NaI+Na2S4O6

（2）含鐵藥物2Fe3++2KI2Fe2++2K++I2I2+2Na2S2O32NaI+Na2S4O6H+第一節(jié)定量分析樣品的前處理方法目前十一頁\總數(shù)五十二頁\編于十八點

三、經(jīng)有機(jī)破壞的分析方法

濕法破壞

藥物分析中常用的有機(jī)破壞的方法有干法破壞

HNO3-HClO4法氧瓶燃燒法濕法破壞HNO3-H2SO4法

H2SO4-硫酸鹽法

HNO3-H2SO4-HClO4法；H2SO4-H2O2；H2SO4-KMnO4干法破壞加Na2CO3或MgO以助灰化；溫度控制在420℃

第一節(jié)定量分析樣品的前處理方法目前十二頁\總數(shù)五十二頁\編于十八點含氮、硫、硫化汞、氯化鈉的生物制品、含氮有機(jī)合成藥物測定的前處理和生物制品中金屬元素測定時生物基質(zhì)的去除。H2SO4-HNO3H2SO4-HClO4H2SO4-H2SO4HNO3-KMnO4分解劑/消化劑輔助分解劑——凱氏定氮法測定含有氨基和酰胺結(jié)構(gòu)的藥物結(jié)構(gòu)(一)濕法破壞第一節(jié)定量分析樣品的前處理方法目前十三頁\總數(shù)五十二頁\編于十八點第一節(jié)定量分析樣品的前處理方法凱氏定氮法原理將含氮藥物與硫酸在凱氏燒瓶中共熱，藥物分子中有機(jī)結(jié)構(gòu)被“消化”成CO2和H2O，有機(jī)結(jié)合的氮轉(zhuǎn)化為無機(jī)氮，與過量的硫酸結(jié)合為硫酸氫銨和硫酸銨，經(jīng)堿化后釋放出氨氣，隨水蒸氣餾出，用硼酸溶液或定量的酸滴定液吸收后，再用酸或堿滴定液滴定。常量法——含氮量25～30mg半微量法——含氮量

1.0～2.0mg目前十四頁\總數(shù)五十二頁\編于十八點第一節(jié)定量分析樣品的前處理方法凱氏燒瓶K2SO4(提高消解溫度)CuSO4(加快消解速度)硫酸堿液硼酸(吸收液)甲基紅-溴甲酚綠指示劑硫酸滴定空白校正目前十五頁\總數(shù)五十二頁\編于十八點(二)干法破壞1.高溫灼燒法用于含鹵素、含磷藥物和藥物中砷鹽的檢查。常加入無水碳酸鈉、硝酸鎂、氫氧化鈣、氧化鋅等輔助灰化。2.氧瓶燃燒法系指將含有待測元素的有機(jī)藥物置于充滿氧氣的密閉的燃燒瓶中充分燃燒，使有機(jī)結(jié)構(gòu)部分徹底分解為CO2和H2O，待測元素根據(jù)電負(fù)性的不同轉(zhuǎn)化為不同價態(tài)的氧化物，被吸收于適當(dāng)?shù)奈找褐?，再根?jù)其性質(zhì)和存在方式選擇方法進(jìn)行分析。目前十六頁\總數(shù)五十二頁\編于十八點1.儀器裝置500ml,1000ml,2000ml,磨口、硬質(zhì)玻璃錐形瓶2.稱樣固體樣；液體樣3.燃燒分解操作法4.吸收液的選擇用于X、S、Se等的鑒別、檢查、含量測定時多數(shù)是H2O或H2O-NaOH；少數(shù)為H2O-NaOH-H2O2.目前十七頁\總數(shù)五十二頁\編于十八點第一節(jié)定量分析樣品的前處理方法目前十八頁\總數(shù)五十二頁\編于十八點第一節(jié)定量分析樣品的前處理方法目前十九頁\總數(shù)五十二頁\編于十八點第二節(jié)定量分析方法特點

一、容量分析法（一）容量分析法的特點

操作簡單、快速；比較準(zhǔn)確（RSD＜0.2%）；儀器普通易得。目前二十頁\總數(shù)五十二頁\編于十八點第二節(jié)定量分析方法的特點（二）滴定度每1ml規(guī)定濃度的滴定液所相當(dāng)?shù)谋粶y藥物濃度。被測藥物滴定液目前二十一頁\總數(shù)五十二頁\編于十八點第二節(jié)定量分析方法的特點目前二十二頁\總數(shù)五十二頁\編于十八點（一）紫外-可見分光光度法（200nm～760nm)靈敏度高，可達(dá)10-4g/ml～10-7g/ml1.特點：準(zhǔn)確度高，SRD（%）為2%～5%儀器價格低廉，操作簡單，易普及，應(yīng)用范圍廣。2.朗伯-比耳定律

A=ECLE1%1cm=ε×10/M二、光譜分析法目前二十三頁\總數(shù)五十二頁\編于十八點

波長校正用汞燈中較強(qiáng)譜線237.38,253.65,275.28,296.73,313.16,334.15,365.02,404.66,425.83,546.07nm與576.96nm

或用儀器中氘燈的486.02nm與656.10nm進(jìn)行校正。吸收度的檢定：用K2CrO7(60mg)+0.005mol/LH2SO4液至1000ml

波長(nm)235(最小)257(最大)313(最小)350(最大)

E1%1cm124.5144.048.62106.6

雜散光檢查：試劑濃度(g/ml)測定波長透光率(%)

NaI1.00220nm＜0.8NaNO25.00340nm＜0.83.儀器校正和檢定第二節(jié)定量分析方法的特點目前二十四頁\總數(shù)五十二頁\編于十八點4.對溶劑的要求:220～240nm241～250nm251～300nm300nm以上溶劑+吸收池A＜0.41＜0.20＜0.10＜0.05

5.測定方法要求供試品溶液的A應(yīng)在0.3～0.7

第二節(jié)定量分析方法的特點目前二十五頁\總數(shù)五十二頁\編于十八點第二節(jié)定量分析方法的特點（1）對照品比較法原料藥制劑目前二十六頁\總數(shù)五十二頁\編于十八點2.吸收系數(shù)法第二節(jié)定量分析方法的特點目前二十七頁\總數(shù)五十二頁\編于十八點

靈敏度高，可達(dá)10-10g/ml～10-12g/ml

在低濃度進(jìn)行測定，防止F與C不成正比及自熄滅作用1.特點用基準(zhǔn)物溶液校正儀器靈敏度，防止樣品液熒光衰減靈敏度高，但干擾因素多。

制備熒光衍生物，可提高其靈敏度和選擇性。用樣品量少，操作簡單，方法快速，應(yīng)用范圍較廣。

（二）熒光分光光度法目前二十八頁\總數(shù)五十二頁\編于十八點2.熒光分析儀有二個單色光器—激發(fā)單色光器與發(fā)射單色光器；且激發(fā)光源、樣品池和檢測器成直角。3.含量測定常用的方法對照品比較法

Ch.P收載地高辛片、利血平片、洋地黃毒苷片。第二節(jié)定量分析方法的特點目前二十九頁\總數(shù)五十二頁\編于十八點

按分離原理分為：吸附；分配；離子交換；排阻色譜按分離方法分為：PC；TLC；柱色譜；GC；HPLC。（一）HPLC法1.對HPLC儀器一般要求色譜柱、流動相按品種項下要求。色譜柱的理論板數(shù)：n=5.54(tR/Wh/2)22.系統(tǒng)性試驗分離度：R=2（tR1–tR2)/(W1+W2);要大于1.5拖尾因子：T=W0.05h/2d1

應(yīng)在0.9～1.05

三、色譜分析法目前三十頁\總數(shù)五十二頁\編于十八點內(nèi)標(biāo)法加校正因子測定供試品中主成分含量3.測定方法

標(biāo)準(zhǔn)曲線法

外標(biāo)法測定供試品中主成分含量外標(biāo)一點法應(yīng)用示例：RP-HPLC法測定鹽酸黃酮哌酯片含量，用標(biāo)準(zhǔn)曲線法如頭孢拉??；頭孢羥氨芐；頭孢唑啉鈉用外標(biāo)一點法第二節(jié)定量分析方法的特點目前三十一頁\總數(shù)五十二頁\編于十八點

（二）GC法1.對GC儀器一般要求載氣為氮氣；色譜柱為填充或毛細(xì)管柱色譜柱的理論板數(shù)：n=5.54(tR/Wh/2)22.系統(tǒng)性試驗分離度：R=2（tR1–tR2)/(W1+W2);要大于1.5拖尾因子：T=W0.05h/2d1

應(yīng)在0.9～1.05第二節(jié)定量分析方法的特點目前三十二頁\總數(shù)五十二頁\編于十八點內(nèi)標(biāo)法加校正因子測定供試品中主成分含量

3.測定方法

標(biāo)準(zhǔn)曲線法

外標(biāo)法測定供試品中主成分含量外標(biāo)一點法應(yīng)用示例：Ch.P(2000)收載的月桂卓酮、維生素E及其片劑、注射劑、甲酚皂溶液等均采用GC法中的內(nèi)標(biāo)法加校正因子測定含量。返回目前三十三頁\總數(shù)五十二頁\編于十八點第三節(jié)藥品分析方法的驗證目的：

證明所采用的分析方法適合于相應(yīng)的檢測要求效能指標(biāo)：

評價分析方法的尺度效能指標(biāo)包括:

精密度,準(zhǔn)確度,檢測限,定量限,選擇性,線性與范圍,耐用性目前三十四頁\總數(shù)五十二頁\編于十八點第三節(jié)藥品分析方法的驗證一、準(zhǔn)確度（accuracy）系指用該方法測定的結(jié)果與真實值或參考值接近的程度。用回收率(Recovery)表示回收試驗加樣回收試驗?zāi)壳叭屙揬總數(shù)五十二頁\編于十八點1.原料藥可用已知純度對照品或樣品進(jìn)行測定；或與已建準(zhǔn)確度的另一方法測定的結(jié)果進(jìn)行比較。制劑要考察輔料對回收率的影響。采用在空白輔料中加入原料對照品的方法作回收率試驗，然后計算RSD。

回收率的RSD＜2%；用UV和HPLC法時，一般回收率可達(dá)98%～102%；容量法可達(dá)99.7%～100.3%

第三節(jié)藥品分析方法的驗證目前三十六頁\總數(shù)五十二頁\編于十八點（二）數(shù)據(jù)要求

回收率%=（測定平均值—空白值）/加入量×100%要求制備高、中、低三濃度的樣品，各測定3次。應(yīng)報告已知加入量的回收率，或測定結(jié)果平均值與真實值之差及其可信限。3×3，至少9個測定結(jié)果第三節(jié)藥品分析方法的驗證目前三十七頁\總數(shù)五十二頁\編于十八點第三節(jié)藥品分析方法的驗證二、精密度(Precision)系指在規(guī)定的測試條件下，同一個均勻供試品，經(jīng)多次取樣測定所得結(jié)果之接近的程度。表示：偏差(d)、標(biāo)準(zhǔn)偏差(s),相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)重復(fù)性:

同一實驗室,同一人多次測定的精密度中間精密度:

同一實驗室，不同人，不同儀器測定的精密度

重現(xiàn)性:

不同實驗室，不同人測定的精密度目前三十八頁\總數(shù)五十二頁\編于十八點（一）精密度表示方法1.偏差(deviation,d)d=測得值-平均值=Xi-X

2.標(biāo)準(zhǔn)偏差（standarddeviation,SD或S）

S=[(∑Xi–X)2/(n-1)]1/23.相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(relativestandarddeviation,RSD)也稱變異系數(shù)(coefficientofvariation,CV)RSD=標(biāo)準(zhǔn)偏差/平均值×100%=S/X×100%目前三十九頁\總數(shù)五十二頁\編于十八點（二）數(shù)據(jù)要求

應(yīng)報告S或SD、RSD和可信限。用統(tǒng)計學(xué)的可信性分析(t或f）。目前四十頁\總數(shù)五十二頁\編于十八點三、專屬性是指在其他成分(如雜質(zhì)、降解產(chǎn)物、輔料等)可能存在下，采用的方法能準(zhǔn)確測定出被測物的特性。鑒別反應(yīng)、雜質(zhì)檢查、含量測定方法，均應(yīng)考察其專屬性。（一）鑒別反應(yīng)應(yīng)能與其它共存的物質(zhì)或相似化合物區(qū)分，不含被測組分的樣品均應(yīng)呈現(xiàn)負(fù)反應(yīng)。目前四十一頁\總數(shù)五十二頁\編于十八點（二）含量測定和雜質(zhì)測定色譜法和其他分離法，應(yīng)附代表性的圖譜，以說明專屬性。

圖中應(yīng)注明各組分的位置，色譜法中分離度應(yīng)符合要求。在能獲得雜質(zhì)的情況下，可加到試樣中，考察對結(jié)果的干擾。在雜質(zhì)和降解物不能獲得的情況下，可用以驗證方法和藥典方法進(jìn)行對照；也可用對試樣加速破壞的方法，比較兩種方法。目前四十二頁\總數(shù)五十二頁\編于十八點

是指試樣中被測物能被檢測出的最低濃度或量，是限度檢驗指標(biāo)。它無需測定，只要指出高于或低于該規(guī)定的濃度或量即可。（一）常用的方法

1.非儀器分析目視法用已知濃度被測物，試驗出能被可靠地檢測出的最低濃度或量。2.儀器分析方法

UV法：LOD=f.3S空=C樣/A樣×

3S空

Flu法：LOD=f.3S空=C樣/(F樣-F空)×

3S空

GC和HPLC法：

LOD=S/N=2或3

四、檢測限（limitofdetection,

LOD)目前四十三頁\總數(shù)五十二頁\編于十八點（二）數(shù)據(jù)要求應(yīng)附測試圖，說明測試過程和檢測限結(jié)果。目前四十四頁\總數(shù)五十二頁\編于十八點是指樣品中被測物能被定量測定的最低量，其測定結(jié)果應(yīng)具一定準(zhǔn)確度和精密度。雜質(zhì)和降解產(chǎn)物進(jìn)行定量測定時，要求LOQ.常用信噪比法確定定量限，一般以S/N=10時相應(yīng)的濃度進(jìn)行測定。五、定量限（limitofquantitation,

LOQ)目前四十五頁\總數(shù)五十二頁\編于十八點是指在設(shè)定的范圍內(nèi)，測試結(jié)果與試樣中被測物濃度直接呈正比關(guān)系的程度。

UV法：首先制備一個標(biāo)準(zhǔn)系列，濃度點n=5;A=0.3～.0.7

建立回歸方程C=aA+b;r＞0.9999。HPLC法：制備一個標(biāo)準(zhǔn)系列，濃度點n=5～7;以C對h或A或與內(nèi)標(biāo)物的峰面積之比，建立回歸方程r＞0.9999。六、線性目前四十六頁\總數(shù)五十二頁\編于十八點是指達(dá)到一定精密度、準(zhǔn)確度和線性、測試方法適用的高低限度或量的區(qū)間。

原料藥和制劑含量測定：范圍應(yīng)為測試濃度的80%-～120%。