現(xiàn)代生物技術(shù)制藥工藝學(xué)

現(xiàn)代生物技術(shù)制藥工藝學(xué)第一頁，共一百零六頁。第一講生物技術(shù)制藥概論第二講基因工程生物構(gòu)建第三講基因工程菌發(fā)酵制藥工藝第四講基因工程動物細(xì)胞培養(yǎng)制藥工藝第五講基因工程藥物檢測與質(zhì)量控制第二頁，共一百零六頁。第一講生物技術(shù)制藥概論第一節(jié)生物技術(shù)藥物一、生物技術(shù)藥物1.分類生物技術(shù)藥物：利用生物機(jī)體、組織、細(xì)胞，生產(chǎn)制造或從中分離得到的具有預(yù)防、治療和診斷功能的藥品，包括具有生物活性的初級代謝和次級代謝產(chǎn)物、天然活性化合物及其類似物。第三頁，共一百零六頁。生物藥物：

20世紀(jì)80年代，用現(xiàn)代生物技術(shù)生產(chǎn)的治療性藥物，基于重組DNA技術(shù)和雜交瘤技術(shù)生產(chǎn)的藥物，不包括直接從天然組織、血液等中提取的治療性蛋白質(zhì)。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，以核酸為基礎(chǔ)的治療性藥物也屬于生物藥物。除了治療性藥物外，也包括體外診斷試劑。

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在制藥領(lǐng)域，生物技術(shù)藥物、生物技術(shù)產(chǎn)品、生物技術(shù)制品互換使用。美國制藥研究與制造者（PhTMA）在其相關(guān)的報(bào)告中經(jīng)常使用生物技術(shù)藥物。生物技術(shù)藥物包括重組DNA、單克隆抗體、雜交瘤和細(xì)胞系生產(chǎn)的藥物，也包括細(xì)胞和組織來源的藥物及基因治療藥物。雖然與生物藥物的范疇有重疊，但生物技術(shù)藥物的范圍更大。生物藥物是15～20年以前藥物的一個(gè)亞類，生物技術(shù)藥物的歷史較長、含義廣。第五頁，共一百零六頁。

生物技術(shù)就是整合自然科學(xué)和工程科學(xué)，獲得應(yīng)用生物，生產(chǎn)細(xì)胞產(chǎn)品和分子產(chǎn)品。所以生物技術(shù)藥物應(yīng)該包括任何生物技術(shù)手段和方法（部分或全部）生產(chǎn)的藥物，包括傳統(tǒng)生物技術(shù)方法，如非重組蛋白，從天然資源如微生物中分離提取的抗生素或半合成抗生素，植物來源的提取藥物和細(xì)胞培養(yǎng)藥物。按照來源可把生物技術(shù)藥物分為微生物藥物、植物藥物和動物（包括人）藥物等。

第六頁，共一百零六頁。制造工藝：化學(xué)合成藥物、生物合成藥物、半合成藥物和中藥制造生產(chǎn)技術(shù):微生物發(fā)酵藥物、植物組織培養(yǎng)藥物、動物細(xì)胞培養(yǎng)藥物、動物組織和血液制劑藥物、免疫抗體藥物等?；瘜W(xué)本質(zhì)和特征：重組藥物、基因藥物、天然藥物和合成、半合成藥物。第七頁，共一百零六頁。重組藥物：重組多肽和蛋白質(zhì)藥物、細(xì)胞因子、受體、單克隆抗體和基因工程抗體、重組疫苗和重組多價(jià)疫苗等?；蛩幬铮悍戳x核酸藥物、基因治療藥物、DNA疫苗和核酶等。天然藥物：來自動物、植物、微生物和海洋生物的天然產(chǎn)物。生化藥物：包括從動物組織或臟器等中分離提取的氨基酸類、多肽和蛋白質(zhì)類、酶與輔酶類、核酸及其衍生物類、多糖類、脂類、生長因子類等第八頁，共一百零六頁。藥物生物技術(shù)藥物生物藥物重組蛋白質(zhì)是是單克隆抗體是是天然材料中直接提取的多肽、蛋白質(zhì)是否治療性基因藥物是是反義寡核苷酸（直接化學(xué)合成）是否反義寡核苷酸（生物酶法合成）是是直接化學(xué)合成的多肽否否天然材料中獲得的抗生素、半合成抗生素是否植物來源的天然藥物或半合成藥物是否細(xì)胞或組織制劑是否第九頁，共一百零六頁。在有關(guān)法規(guī)中，經(jīng)常出現(xiàn)的術(shù)語是生物制品(中國、美國使用)或生物反應(yīng)修飾劑（美國使用）、生物醫(yī)藥產(chǎn)品（歐盟使用）。美國FDA對生物制品的定義是病毒、治療性血清、毒素、抗毒素、疫苗、血液、血液成分及其衍生物、變應(yīng)原性制劑及類似產(chǎn)品、胂凡鈉明及其衍生物，用于預(yù)防、治療疾病。這個(gè)定義并沒有包括所有生物來源的藥物。傳統(tǒng)的生物制品包括疫苗、類毒素、血液制品和代謝制劑，但現(xiàn)在也包括重組蛋白質(zhì)和核酸藥物。生物反應(yīng)修飾劑是激素、神經(jīng)活性物質(zhì)、免疫活性物質(zhì)的總稱，它們在細(xì)胞水平上起作用。

第十頁，共一百零六頁。

中國的生物制品規(guī)程也對生物制品的定義：以微生物、寄生蟲、動物毒素、生物組織為起始材料，采用生物學(xué)工藝或分離純化技術(shù)制備，并以生物學(xué)技術(shù)和分析技術(shù)控制中間產(chǎn)物和成品質(zhì)量制成的生物活性制劑，包括菌苗、疫苗、毒素、類毒素、免疫血清、血液制品、免疫球蛋白、抗原、抗體、變態(tài)反應(yīng)原、細(xì)胞因子、激素、酶、發(fā)酵產(chǎn)品、單克隆抗體、DNA重組產(chǎn)品和體外免疫診斷制品等。第十一頁，共一百零六頁。生物制品分類：預(yù)防用生物制品治療用生物制品診斷用品菌苗抗血清與抗毒素細(xì)菌學(xué)試劑疫苗血液制品免疫試劑類毒素細(xì)胞因子臨床化學(xué)試劑第十二頁，共一百零六頁。2.重要的微生物藥物

抗生素：鏈霉素，頭孢霉素；鏈霉菌，青霉菌氨基酸：谷氨酸等20余種，放線菌，真菌維生素：維生素A，B2，霉菌，丙酸菌，酵母核苷酸和核苷：肌苷酸和肌苷，桿菌，放線菌，酵母，青霉酶：淀粉酶，纖維素酶，蛋白酶，天門冬酰胺酶，鏈激酶，葡激酶；米曲霉，黑曲霉，鏈霉菌酶抑制劑：洛伐他丁，辛伐他丁；曲霉，鏈霉菌免疫調(diào)節(jié)劑：環(huán)孢菌素A；光澤柱孢菌，鏈霉菌第十三頁，共一百零六頁。抗生素:一類在低濃度下就能選擇性地抑制或影響其它生物的生命過程的次級代謝產(chǎn)物。天然抗生素約9000種，半合成抗生素有7000多種，具有臨床應(yīng)用價(jià)值的近500種，已經(jīng)大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)的抗生素達(dá)100多種。第十四頁，共一百零六頁。種類藥物舉例生產(chǎn)菌抗菌機(jī)理與應(yīng)用β內(nèi)酰胺類頭孢霉素

頭孢霉抑制細(xì)胞壁氨基糖苷類鏈霉素鏈霉菌抑制蛋白合成大環(huán)內(nèi)酯類紅霉素鏈霉菌抑制蛋白合成多烯類兩性霉素鏈霉菌破壞細(xì)胞膜四環(huán)素類四環(huán)素鏈霉菌抑制蛋白合成糖肽類萬古霉素?zé)o枝酸菌抑制細(xì)胞壁多肽類桿菌肽桿菌破壞細(xì)胞膜蒽環(huán)類柔紅霉素鏈霉菌抑制RNA和DNA合成。第十五頁，共一百零六頁。3.重要的植物藥物很多植物來源的藥物已經(jīng)能化學(xué)合成，還有一部分直接分離提取，或修飾加工的半合成藥物。其中部分已經(jīng)用植物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)進(jìn)行生產(chǎn)。生物堿：阿托品，可卡因，吐根，奎寧，長春堿，長春新堿，喜樹堿，秋水仙堿水楊酸：阿司匹林；萜類:紫杉醇香豆素:雙香豆素甾體:地高辛，洋地黃苷酶：脲酶,無花果蛋白酶第十六頁，共一百零六頁。4.重要的動物藥物從動物組織或器官中直接分離提取，蛋白質(zhì)類藥物可以用基因工程技術(shù)制造，非蛋白質(zhì)藥物包括甾體類激素、皮質(zhì)類甾體和前列腺素等，大多數(shù)已化學(xué)合成。胰腺：胰島素，高血糖素，胰蛋白酶，胰酯酶，胰凝乳酶，Dnase，彈性蛋白酶腦：腦磷脂，神經(jīng)磷脂垂體：生長素，促黃體激素，加壓素，促卵泡激素，促皮質(zhì)激素

肝臟：維生素，肝細(xì)胞生長因子，肝素，RNA第十七頁，共一百零六頁。胸腺：胸腺素，胸腺肽血液：凝血酶，凝血因子，血紅素，血紅蛋白，SOD，血漿，白蛋白，免疫球蛋白，纖溶酶甲狀腺、鰓：降鈣素胃黏膜：胃蛋白酶，胃膜素，雙岐因子，凝乳酶尿：絨膜促性激素，尿激酶心臟：細(xì)胞色素C，輔酶Q蛋清：溶菌酶第十八頁，共一百零六頁。二、重要的重組生物藥物1.激素類藥物激素是由內(nèi)分泌腺或特異細(xì)胞產(chǎn)生的含量極低一類小分子，通過信使功能，起專一生理效應(yīng)。人胰島素：胰島細(xì)胞，前胰島素原跨膜運(yùn)輸，切除23aa信號肽，86aa的胰島素原。高爾基體形成二硫鍵，切除C肽，成熟的胰島素分泌到胞外，進(jìn)入血液循環(huán)。成熟的胰島素由AB雙鏈組成，A鏈21aa，B鏈30aa，3對二硫鍵。生理功能廣泛，能促進(jìn)糖原合成和糖酵解，產(chǎn)生ATP，降低血糖含量，保持能量供應(yīng)。重組人胰島素:發(fā)達(dá)國家取代豬或牛胰島素，用于臨床，主要治療I型糖尿病。第十九頁，共一百零六頁。生長素:垂體前葉分泌的一種促進(jìn)生長的激素。人生長素是191aa的單鏈球蛋白，2對二硫鍵。生長素具有促進(jìn)氨基酸的運(yùn)輸和蛋白質(zhì)、核酸的合成代謝，刺激新骨形成和紅細(xì)胞生成，加速生長。重組人生長素用于治療侏儒病、慢性腎功能衰竭、燒傷、創(chuàng)傷等。心鈉素即心房利鈉多肽（心房利鈉因子）：是一個(gè)家族，心鈉素、腦鈉素、C型利鈉肽。心鈉素家族的三個(gè)成員分子為環(huán)狀結(jié)構(gòu)，N端和C端為鏈狀，1對二硫鍵在環(huán)內(nèi)，存在高度保守序列和區(qū)域。人心鈉素由28個(gè)氨基酸殘基組成，人腦鈉素由32個(gè)氨基酸殘基組成。重組人心鈉素日本上市，用于心衰治療，我國也進(jìn)入臨床實(shí)驗(yàn)。第二十頁，共一百零六頁。降鈣素:甲狀腺濾泡旁細(xì)胞產(chǎn)生的激素，生理功能是調(diào)節(jié)鈣磷代謝，維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。33aa的多肽激素，不同種類活性差異較大，非脊椎動物如魚類比哺乳動物的活性高。目前使用的是天然提取的豬、人、鰻魚、化學(xué)合成的等?；蚬こ讨亟M鮭魚鈣降素于1999年在歐洲上市。主要用于骨質(zhì)疏松、高鈣血癥、Paget’s病等，骨量減少，更新機(jī)能障礙等疾病的治療。高血糖素：低血糖癥；促甲狀腺素：治療和診斷促卵泡激素：停止排卵和超排卵第二十一頁，共一百零六頁。種類商品名胰島素Humulin，Novolin，Humalog，Lantus生長素Humatrope，Nutropin，Saizen,BioTropin，Genotropin，

Norditropin，Protropin,Serostim高血糖素Glucogen促甲狀腺素Thyrogen促卵泡激素ConalF，Puregon,Follistin第二十二頁，共一百零六頁。2.細(xì)胞因子藥物細(xì)胞因子：各種細(xì)胞合成并分泌的小分子多肽類因子，調(diào)節(jié)機(jī)體的生理功能，參與細(xì)胞的增殖、分化、免疫、移植排斥、凋亡等過程。干擾素：IFN-α，β，γ，ε

ω，τ。IFN-α約有25種亞型，165－166aa，2個(gè)二硫鍵，無N－糖化位點(diǎn)。IFN-β有4個(gè)亞型，166aa，1個(gè)二硫鍵。IFN-γ有4以上個(gè)亞型，由143個(gè)氨基酸殘基組成，無二硫鍵，2個(gè)N－糖化位點(diǎn)。重組α、β、γ干擾素均已上市，α治療白血病、慢性病毒感染如乙肝、丙肝、單純皰癥病毒等，β治療多發(fā)性硬化癥，γ治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等。第二十三頁，共一百零六頁。白細(xì)胞介素:介導(dǎo)白細(xì)胞之間相互作用的一些細(xì)胞因子,現(xiàn)已命名至IL－23。只有IL-2和IL-11被開發(fā)成基因工程藥物而上市。IL－2由133aa組成，1個(gè)鏈內(nèi)二硫鍵，糖蛋白。IL－11由178aa組成，無二硫鍵和糖基化。IL－2用于癌癥輔助治療，IL－11與G－CSF聯(lián)合使用，糾正化療導(dǎo)致的粒細(xì)胞和血小板減少癥。集落刺激因子:是指能刺激造血細(xì)胞在半固體培養(yǎng)基上形成細(xì)胞集落的細(xì)胞因子，是一類造血細(xì)胞生長因子。M－CSF，GM－CSF，Multi－CSF，EPO，SCF，TPO等。第二十四頁，共一百零六頁。粒細(xì)胞集落刺激因子G-CSF是174aa，2對二硫鍵。GM-CSF是127aa，2對二硫鍵。M-CSF是522aa，3對二硫鍵。它們都具有N－糖化位點(diǎn)，有信號肽，分泌時(shí)被切除。重組人G-CSF、GM-CSF、M-CSF均已上市，刺激骨髓中粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞增殖，集落形成，增強(qiáng)免疫，用于血細(xì)胞減少癥、再生障礙性貧血及化療放療癌癥的輔助治療。EPO是165aa的高度糖基化蛋白，2個(gè)二硫鍵，糖基（主要為唾液酸）對活性至關(guān)重要。重組EPO用于治療透析性貧血或其他貧血，是治療腎功能衰竭導(dǎo)致貧血的首選藥物。第二十五頁，共一百零六頁。SCF:重組人SCF主要作用于早期造血干細(xì)胞，范圍廣，但專異性差，還具有種屬特異性，單獨(dú)使用活性低?？膳c其他因子協(xié)同作用產(chǎn)生不同的聯(lián)合效應(yīng)。一般與G-SCF聯(lián)合使用，刺激粒細(xì)胞增殖。與EPO聯(lián)合，刺激早期紅細(xì)胞的增殖，對細(xì)胞肥大也有增殖作用。生長因子GF:對細(xì)胞生長具有促進(jìn)作用的因子，表皮生長因子EGF、成纖維細(xì)胞生長因子FGF、轉(zhuǎn)化生長因子TGF、血小板生成素TPO。EGF：53aa，3對二硫鍵。重組人EGF已在國內(nèi)外上市，大腸桿菌和酵母細(xì)胞表達(dá)。主要外用，治療燒傷、潰瘍和外傷及外周神經(jīng)系統(tǒng)疾病。第二十六頁，共一百零六頁。FGF：堿性成纖維細(xì)胞生長因子bFGF和酸性成纖維細(xì)胞生長因子aFGF，等電點(diǎn)分別為5.4和9.8，它們的生物學(xué)活性相似。其實(shí)FGF是一個(gè)家族，其成員已經(jīng)鑒定出22個(gè)，重組FGF主要外用，治療燒傷及外周神經(jīng)系統(tǒng)疾病。TNF：腫瘤壞死因子，殺滅腫瘤。巨噬細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α，T細(xì)胞產(chǎn)生TNF-β。TNF具有廣泛生物學(xué)效應(yīng)，參與免疫細(xì)胞激活和炎癥反應(yīng)，具有抗感染、抗病毒、抗腫瘤的作用。國外重組TNF已進(jìn)入臨床階段，用于腫瘤治療，與化療聯(lián)合使用。TPO：332aa。重組TPO已進(jìn)入臨床階段，主要用于腫瘤病人的化療所致血小板減少癥。第二十七頁，共一百零六頁。種類商品名IFN-α1b賽諾金，干擾靈IFN-α2aReferonA，福康泰，來福隆，迪恩安，因特粉，貝爾芬IFN-α2bIntronA，Rebetron，Alfatronol，Virtron，安達(dá)芬，隆化諾，保守IFN-αInfergenIFN-βBetaferon，Betaseron，Avonex，RedifIFN-γ1bActimmuneIL-2Proleukin，辛格爾，德路生，悅康仙，英路因，安特魯克IL-11NeumegaEPOEpogen，Procrit，Neorecormon，寧紅欣，依普定，益比奧GM-CSFLeukine，里亞爾G-CSFNeupogen，吉粒芬PDGFRegranexTNF-αBeromun第二十八頁，共一百零六頁。3.溶血栓藥物類溶血栓藥物是纖溶酶原激活劑PA通過激活無活性的血漿纖溶酶原PLG，形成有活性的纖溶酶PLM.催化血栓的主要基質(zhì)纖維蛋白水解，使血栓溶解，暢通血管。纖溶酶原激活劑有:組織型纖溶酶原激活劑tPA;尿激酶原激活劑uPA，哺乳動物產(chǎn)生的可直接激活PLG，而由細(xì)菌產(chǎn)生的鏈激酶SK和葡激酶SAK，可間接激活PLG。TPA:527aa的糖蛋白，有17對二硫鍵，3個(gè)糖基化位點(diǎn)。細(xì)菌表達(dá)產(chǎn)物野生型tPA分子量大，未形成產(chǎn)品。哺乳動物細(xì)胞（CHO）表達(dá)重組tPA已在美國于1987年上市，第一個(gè)用動物細(xì)胞大規(guī)模生產(chǎn)的重組蛋白質(zhì)藥物。第二十九頁，共一百零六頁。改型tPA:rPA和TNK-tPA。RPA:是tPAcDNA缺失突變后，用大腸桿菌表達(dá)的單鏈無糖基化蛋白質(zhì)，355aa，效果與重組tPA相同，生產(chǎn)成本低，血漿中半衰期延長。TNK-tPA:是tPA個(gè)別氨基酸突變后，由CHO表達(dá)的糖基化雙鏈蛋白。527aa。PA、tPA、rPA和TNK-tPA均已上市。uPA:是從人胚腎細(xì)胞培養(yǎng)液或新鮮尿液中提取的溶栓藥。單鏈尿激酶型纖溶酶原激活劑由411個(gè)氨基酸殘基組成，有12對二硫鍵.目前美國Abbot公司從人胚腎細(xì)胞培養(yǎng)株生產(chǎn)scu-PA，德國Grunenthal公司用大腸桿菌表達(dá)scu-PA，活性高于哺乳動物細(xì)胞表達(dá)的糖基化scu-PA。第三十頁，共一百零六頁。SK:從溶血性鏈球菌培養(yǎng)液中提取分得到，415aa，是最早用于臨床的溶栓藥。SAK:金黃色葡萄球菌溶原性噬菌體所分泌的，136aa，是單鏈無二硫鍵的蛋白質(zhì)。直接從細(xì)菌培養(yǎng)液中分離純化困難，含量很低?，F(xiàn)已經(jīng)克隆了該基因，并實(shí)現(xiàn)了大腸桿菌和枯草桿菌表達(dá)，工程菌的產(chǎn)量占總蛋白質(zhì)的10%－15％。水蛭素:從水蛭中發(fā)現(xiàn)的一種凝血酶抑制劑，是溶血栓的有效輔助藥物。天然水蛭素是酸性多肽，含有65個(gè)氨基酸。水蛭素可用大腸桿菌和酵母表達(dá)，1998年美國、德國等批準(zhǔn)重組脫硫酸酯水蛭素上市，應(yīng)用于預(yù)防血栓和肝素相關(guān)的血小板減少癥。第三十一頁，共一百零六頁。4.受體、黏附分子藥物細(xì)胞表面分子包括受體和黏附分子。受體與其配體結(jié)合后，經(jīng)信號傳導(dǎo)，引起細(xì)胞的功能和行為發(fā)生改變。黏附分子是由細(xì)胞產(chǎn)生的介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞間或細(xì)胞與基質(zhì)間相互接觸和結(jié)合的一類分子，分布于細(xì)胞表面。很多黏附分子就是受體。根據(jù)人類白細(xì)胞分化抗原的國際協(xié)作組會議的命名，把識別同一分化抗原的單克隆抗體歸為同一個(gè)分化群CD，許多黏附分子和受體被命名為CD分子。在多數(shù)情況下，CD分子和黏附分子或受體的名稱可以通用。第三十二頁，共一百零六頁。重組CD分子與天然的CD競爭性結(jié)合配體，作為阻斷劑，封閉信號傳導(dǎo)，治療天然CD分子功能異常引發(fā)的疾病。與抗體相比，重組CD分子沒有免疫應(yīng)答反應(yīng)，安全性好。但存在問題要求真核表達(dá)系統(tǒng)，技術(shù)設(shè)備和條件要求高，規(guī)模生產(chǎn)較困難，成本高；半衰期短，給藥量大。其策略是采用與抗體結(jié)合，在CD分子的C端融合IgG的Fc片段，表達(dá)融合蛋白，形成免疫黏附素。已上市的有Immunex公司的可溶性TNF受體II－Fc融合蛋白，用于治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎和慢性心衰。其他的進(jìn)入臨床階段的可溶性CD54、可溶性IL－4受體、可溶性LFA－3/IgG1融合蛋白等。第三十三頁，共一百零六頁。5.重組融合蛋白藥物將兩種或兩種以上的功能蛋白質(zhì)的基因重組，產(chǎn)生新的融合蛋白質(zhì)，可發(fā)揮超越其單分子的生物學(xué)活性。主要有細(xì)胞因子之間融合，如IFN-γ/IL-2、IFN-γ/TNF2、IL-2/IL-6、GM-CSF/IL-3。細(xì)胞因子與抗原或抗體之間的融合，如Id/GM-CSF、Id/IL2、Id/IL4等，細(xì)胞因子部分可大大提高Id部分的抗原性。細(xì)胞因子與毒素或抑制因子之間融合，白喉毒素/IL-2、GM-CSF/LIF等。上市的重組融合蛋白藥物有Ontak，IL-2融合的白喉毒蛋白，靶向治療皮膚T細(xì)胞淋巴瘤。Enbrel是TNF可溶性受體融合IgG片段，治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。第三十四頁，共一百零六頁。三、疫苗主要用于健康人群的一類預(yù)防性生物藥物。包括蛋白質(zhì)、多糖、核酸等。根據(jù)病原生物體分類：菌苗:細(xì)菌性抗原制劑;疫苗:病毒性抗原制劑，但現(xiàn)在統(tǒng)稱為疫苗。根據(jù)制造技術(shù)分類：傳統(tǒng)疫苗包括滅活疫苗、減毒活疫苗和亞單位疫苗；新型疫苗是指用基因工程技術(shù)研制的疫苗，基因工程亞單位疫苗、載體疫苗、核酸疫苗、多抗聯(lián)合疫苗、重組多價(jià)疫苗等。第三十五頁，共一百零六頁。基因工程疫苗：用重組DNA技術(shù)克隆保護(hù)性抗原基因，用表達(dá)出的抗原產(chǎn)物或重組體本身制備成疫苗?；蚬こ虂唵挝灰呙缬梦⑸锉磉_(dá)抗原，純化后制備成疫苗。最成功的是酵母和CHO表達(dá)的乙肝表面抗原，純化后制備的乙肝疫苗，高效、價(jià)廉、安全，已取代了傳統(tǒng)的血源疫苗。蛋白質(zhì)工程疫苗是對抗原基因進(jìn)行改造，如突變、缺失、插入等，增加免疫原性，擴(kuò)大反應(yīng)譜。核酸疫苗或基因疫苗是用能夠表達(dá)抗原的基因制備成的疫苗。其本質(zhì)是核酸，可以是DNA，也可以是RNA。第三十六頁，共一百零六頁?；蚬こ梯d體疫苗和基因缺失活疫苗：本質(zhì)是菌苗，把抗原的基因重組到微生物體內(nèi)，篩選得到用表達(dá)抗原基因的重組微生物，進(jìn)而以微生物為載體制備成疫苗。多為活疫苗，載體為指定的微生物菌株，如痘苗病毒、脊灰病毒、腺病毒、卡介苗等。也可用非復(fù)制型載體，即微生物進(jìn)入人體后，不能繁殖，但能進(jìn)行DNA的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)的表達(dá)，能產(chǎn)生抗原刺激機(jī)體發(fā)生免疫反應(yīng)，提高了載體的安全性。DNA疫苗：將外源目的基因片段構(gòu)建在DNA質(zhì)粒中，重組后的DNA導(dǎo)入機(jī)體后可表達(dá)目標(biāo)蛋白，刺激機(jī)體的免疫系統(tǒng)，而達(dá)到預(yù)防某種疾病的生物制劑。DNA疫苗是質(zhì)粒DNA，它含有宿主疫苗應(yīng)答的抗原基因。第三十七頁，共一百零六頁。細(xì)菌減毒活疫苗卡介苗，傷寒疫苗，霍亂疫苗，布氏菌疫苗，炭疽疫苗，痢疾疫苗病毒減毒活疫苗牛痘疫苗，脊髓灰質(zhì)炎疫苗，麻疹疫苗，腺病毒疫苗，風(fēng)疹疫苗，黃熱病疫苗，腮腺炎疫苗，甲肝疫苗，流感疫苗，水痘疫苗，輪狀病毒疫苗，乙腦炎疫苗第三十八頁，共一百零六頁。病毒全滅活疫苗流感疫苗，脊髓灰質(zhì)炎疫苗，甲肝疫苗，乙腦炎疫苗，流行性出血熱疫苗，斑疹傷寒疫苗細(xì)菌全滅活疫苗霍亂疫苗，百日咳疫苗，鼠疫疫苗，傷寒疫苗上市的滅活疫苗第三十九頁，共一百零六頁。病毒亞單位疫苗乙肝疫苗，流感嗜血桿菌疫苗細(xì)菌亞單位疫苗肺炎鏈球菌疫苗，沙門氏Vi多糖疫苗，無細(xì)胞百日咳疫苗，A型和C型腦膜炎球菌疫苗病毒結(jié)合疫苗類毒素細(xì)菌結(jié)合疫苗B型流感嗜血桿菌疫苗，破傷風(fēng)疫苗，百喉疫苗上市的亞單位和結(jié)合疫苗第四十頁，共一百零六頁。二聯(lián)疫苗甲乙型肝炎聯(lián)合疫苗，乙型肝炎、B型流感嗜血桿菌聯(lián)合疫苗，麻疹、風(fēng)疹聯(lián)合疫苗。三聯(lián)疫苗百白破聯(lián)合疫苗，無細(xì)胞百白破聯(lián)合疫苗，三價(jià)口服脊髓灰質(zhì)炎減毒活疫苗，三價(jià)脊髓灰質(zhì)炎滅活疫苗，麻疹、流行性腮腺炎、風(fēng)疹聯(lián)合疫苗。上市的聯(lián)合疫苗第四十一頁，共一百零六頁。四聯(lián)疫苗百白破、B型流感嗜血桿菌聯(lián)合疫苗，百白破、乙型肝炎聯(lián)合疫苗，百白破、滅活脊髓灰質(zhì)炎聯(lián)合疫苗。五聯(lián)疫苗百白破、B型流感嗜血桿菌、乙型肝炎聯(lián)合疫苗，聯(lián)合疫苗，百白破、滅活脊髓灰質(zhì)炎、B型流感嗜血桿菌聯(lián)合疫苗。第四十二頁，共一百零六頁。種類藥物應(yīng)用乙肝Recombivax乙肝疫苗二聯(lián)疫苗ComvaxProcomvax抗乙型流感、乙疫苗肝聯(lián)合疫苗Tritantix抗乙肝、白喉、破傷風(fēng)、百日咳疫苗聯(lián)合疫苗Twinix抗甲乙肝免疫劑聯(lián)合疫苗Primavax抗白喉、破傷風(fēng)、乙肝疫苗含有HBsAg的重組疫苗

第四十三頁，共一百零六頁。四、基因藥物包括細(xì)胞因子、活性多肽、受體的基因，也稱DNA藥物。廣義的基因藥物還包括反義核酸和基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的藥物，主要針對基因遺傳缺陷引起的疾病。將具有治療意義的正?；蛑亟M到真核表達(dá)載體上，用一定方法導(dǎo)入體細(xì)胞內(nèi)，利用胞內(nèi)的原料，進(jìn)行基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，合成并分泌釋放蛋白質(zhì)或肽產(chǎn)物，替換或封閉其中異?；蛑虏』颍玫街委熛嚓P(guān)疾病的目的?；蛩幬锟赏委?00余種遺傳疾病。醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)的第四次革命?；蛩幬镞€處于實(shí)驗(yàn)研究階段，許多技術(shù)和倫理問題第四十四頁，共一百零六頁。反義核酸藥物是指用反義技術(shù)研制的藥物。根據(jù)堿基互補(bǔ)原理，用人工合成或生物合成的特定互補(bǔ)寡核苷酸片段，與特定的基因或RNA發(fā)生雜交，抑制或封閉基因表達(dá)，阻斷相應(yīng)有害蛋白質(zhì)的合成，干擾了遺傳信息從核酸向蛋白質(zhì)的傳遞，達(dá)到治療疾病的目的。反義寡核苷酸藥物是以4種核苷酸為基礎(chǔ)化學(xué)合成。天然的寡核苷酸很容易被體內(nèi)的核酸酶降解，因此在合成的同時(shí)進(jìn)行化學(xué)修飾，改變物化學(xué)性質(zhì)，降低核酸酶的敏感性，增加穩(wěn)定性、生物利用度和靶基因的結(jié)合特異性。FDA批準(zhǔn)ISIS/CIBAVision公司Vitravene上市，第一個(gè)反義核酸藥物，治療艾滋病人晚期發(fā)生的視網(wǎng)膜炎。第四十五頁，共一百零六頁。第二節(jié)現(xiàn)代生物技術(shù)制藥的特征藥物制造過程包括基礎(chǔ)設(shè)施的設(shè)計(jì)和布局、生物藥物來源、上下游過程和最終產(chǎn)品的分析等幾個(gè)階段。藥物的制造必須受到高度嚴(yán)格控制，不僅藥品安全、有效，而且制造過程的各個(gè)方面也都必須是安全、有效的。在制造過程中，藥典和GMP幾乎是指導(dǎo)性的中心，對產(chǎn)品安全和有效性起關(guān)鍵作用?，F(xiàn)代生物制藥的特點(diǎn)是技術(shù)含量高、智力密集，全封閉自動化、全程質(zhì)量控制，大規(guī)模生物反應(yīng)器生產(chǎn)和新型分離技術(shù)綜合利用。第四十六頁，共一百零六頁。一、生物藥物的特性與制造技術(shù)的關(guān)系生物藥物的特性生物材料本身成分復(fù)雜，除多糖、蛋白質(zhì)、核酸、脂類等高分子化合物外，還有糖蛋白等復(fù)合物。生物藥物具有高活性，活性與結(jié)構(gòu)有密切關(guān)系。低分子量的生物藥物的活性往往取決于其手性異構(gòu)體，不同的離體異構(gòu)體其活性截然不同甚至相反。高分子量的生物藥物活性不僅取決于其一級結(jié)構(gòu)，還與其高級（二級、三級、四級）空間結(jié)構(gòu)（即構(gòu)象）密切相關(guān)，空間構(gòu)象的破壞往往導(dǎo)致藥物失活。第四十七頁，共一百零六頁。酸、堿、有機(jī)試劑、重金屬、熱、光等因素敏感。所處的環(huán)境和介質(zhì)影響其結(jié)構(gòu)，生產(chǎn)中的機(jī)械剪切力、金屬器壁的摩擦力、傳熱傳質(zhì)等過程不僅會影響細(xì)胞的活性與功能，也影響藥物的活性。生產(chǎn)條件的變化對質(zhì)量影響大，在工藝放大過程中應(yīng)嚴(yán)格監(jiān)測質(zhì)量的動態(tài)變化，在分離純化等過程必須采用措施防止變性失活。生物藥物具有低穩(wěn)定性，易受物理化學(xué)和生物因素的影響而變性失去活性。細(xì)胞破碎后，打破了原有的亞細(xì)胞布局，不再存在細(xì)胞隔室，藥物失去了空間保護(hù)。一旦提取出來后，離體的藥物，容易受到理化因素的攻擊，變性失去活性。第四十八頁，共一百零六頁。

生物藥物具有易污染性，生物藥物本身是活性生物分子，很易被腐生降解的低等生物所取食，引起腐敗降解，同時(shí)可能產(chǎn)生熱源和過敏原。生物藥物具有用量少、價(jià)值高的應(yīng)用性。生物藥物在治療、預(yù)防和診斷中的所用劑量較少，顯示出很高的商業(yè)經(jīng)濟(jì)價(jià)值，驅(qū)動著生物藥的不斷創(chuàng)新和發(fā)展。第四十九頁，共一百零六頁。影響生物藥物活性的因素

蛋白藥物是以生物活性為基礎(chǔ)的，下游及其制劑過程必須把活性下降降到最低限度。加工過程盡可能縮短處理時(shí)間，加入穩(wěn)定劑，提高蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。蛋白質(zhì)喪失活性和不穩(wěn)定的原因包括共價(jià)鍵與非共價(jià)鍵的破壞與生成，均可引起蛋白質(zhì)不可逆降解和不穩(wěn)定。蛋白質(zhì)部分或全部蛋白變性共價(jià)鍵變化外消旋化，異構(gòu)化脫酰胺作用，亞胺形成二硫鍵交換，糖鏈變化氧化，水解，光降解聚集表面吸附沉淀非共價(jià)鍵變化伸展卷曲第五十頁，共一百零六頁。蛋白質(zhì)在空氣中發(fā)生自動氧化過程，由空氣中的氧自發(fā)引起的游離基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。溫度對蛋白質(zhì)是個(gè)很敏感的因素，溫度升高使分子內(nèi)的震動增強(qiáng)，從而破壞維系空間結(jié)構(gòu)的次級作用使蛋白質(zhì)變性。日光中的紫外線能量最大，生物藥物樣品受光催化的反應(yīng)有變色、氧化和分解等。多數(shù)蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)范圍內(nèi)才穩(wěn)定，超出此范圍會迅速變性，液體樣品保存時(shí)常用緩沖液控制pH值。第五十一頁，共一百零六頁。有機(jī)溶劑存在時(shí)，它們的極性及介電常數(shù)小于水，使肽鏈內(nèi)的靜電斥力增加，造成蛋白質(zhì)分子膨化或松散。在溶液中加入鹽類化合物也會影響蛋白質(zhì)構(gòu)象的穩(wěn)定性。在低濃度的中性生理鹽溶液中對蛋白質(zhì)的構(gòu)象不發(fā)生影響。但鹽濃度較高時(shí)，鹽離子有可能改變蛋白質(zhì)內(nèi)部的極性基團(tuán)或改變?nèi)軇┬再|(zhì)使蛋白質(zhì)穩(wěn)定性發(fā)生變化，出現(xiàn)沉淀。表面活性劑，如十二烷基硫酸鈉（SDS）在低濃度時(shí)可與蛋白質(zhì)結(jié)合，其表面帶有大量負(fù)電荷，阻止了復(fù)合物分子之間的聚集而不致凝集或沉淀。第五十二頁，共一百零六頁。蛋白質(zhì)的酸、堿水解是肽鍵的水解，使分子斷裂成為分子量大小不等的肽段和氨基酸，在蛋白酶存在下會加速水解。即使非常有限的蛋白酶都會引起蛋白質(zhì)活性的喪失。各種蛋白質(zhì)對蛋白酶的敏感性與空間結(jié)構(gòu)有關(guān)，緊密的結(jié)構(gòu)能抵抗蛋白酶的攻擊。保護(hù)蛋白質(zhì)降解的策略是減少加工過程時(shí)間、并在低溫下進(jìn)行操作，使用一些特異性蛋白酶抑制劑。蛋白酶要在下游的早期除去，在后期的殘存將嚴(yán)重影響產(chǎn)品活性。PMSF:絲氨酸蛋白酶、某些半胱氨酸蛋白酶苯甲瞇:絲氨酸蛋白酶；胃酶抑制素:天門冬氨酸蛋白酶EDTA:金屬蛋白酶第五十三頁，共一百零六頁。脫酰胺作用：谷氨酰胺與天冬門酰胺側(cè)鏈酰胺的水解，形成谷氨酸與天冬門氨酸。較高溫度、極端pH能促進(jìn)脫酰胺作用水解。脫酰胺化作用是胰島素降解的主要途徑。α氨基N進(jìn)一步攻擊側(cè)鏈羰基，引起亞胺形成。亞胺引入新的負(fù)電荷可影響三級結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性。蛋白質(zhì)用堿水解時(shí)，會使某些L-氨基酸變?yōu)镈-氨基酸產(chǎn)生消旋作用。蛋白質(zhì)中的氨基酸側(cè)鏈容易被一些氧化劑氧化，分子氧和氧自由基氧化。蛋氨酸可氧化成蛋氨酸亞砜使蛋白質(zhì)失活，半胱氨酸可氧化成半胱磺酸或二硫鍵?？稍谧罱K產(chǎn)品中充N2氣或添加抗氧化劑。第五十四頁，共一百零六頁。蛋白質(zhì)聚集:蛋白分子結(jié)合的微觀過程，可以是二聚體或大的低聚物，但仍保留在溶液中而影響生物活性。由于疏水的和靜電作用，蛋白質(zhì)和多肽吸附于容器、濾器或輸液系統(tǒng)的表面，蛋白質(zhì)溶液濃度較低時(shí)，吸附損失相對較高。蛋白質(zhì)與吸附表面之間的相互作用隨表面疏水性和蛋白質(zhì)疏水性的增加而增加。膜濾過是現(xiàn)行蛋白質(zhì)藥物制劑滅菌濾過最常用的方法，在膜上蛋白質(zhì)的吸附與失活是一個(gè)值得特別關(guān)注的問題。第五十五頁，共一百零六頁。穩(wěn)定蛋白質(zhì)藥物的策略

為了較長時(shí)間保存蛋白質(zhì)溶液，常常加入一些穩(wěn)定劑進(jìn)行保護(hù)。液體樣品可用惰氣驅(qū)除液中殘存的氧，高濃度保存也是一條可行方法。蛋白質(zhì)類：血清白蛋白、明膠；金屬螯合劑：EDTA；氨基酸：甘氨酸、丙氨酸、賴氨酸、蘇氨酸糖類：葡萄糖、蔗糖、海藻糖、右旋糖苷多元醇：甘油、山梨醇、肌醇、聚乙二醇表面活性劑：聚山梨醇酯；中性鹽：硫酸銨防腐劑：乙醇、苯酚、硫柳汞、醋酸苯汞、乙酯、抗氧劑：焦亞硫酸鈉、硫代硫酸鈉、半胱氨酸第五十六頁，共一百零六頁。二、生物制藥的研發(fā)1．研發(fā)過程生物制藥研發(fā)的基本過程包括新藥發(fā)現(xiàn)、原始特征、臨床前試驗(yàn)、臨床試驗(yàn)、制造與上市申請、批準(zhǔn)獲得許可證、銷售、售后監(jiān)測,幾個(gè)重要過程。

新藥發(fā)現(xiàn)的策略：隨機(jī)篩選，基于作用機(jī)理的藥物鑒定，但生物藥物的研發(fā)往往是基于作用機(jī)理。單因素的生物活性物質(zhì)直接缺乏所致疾病，如缺乏胰島素導(dǎo)致糖尿病，缺乏生長素會導(dǎo)致侏儒癥，由此開發(fā)胰島素和生長素藥物。多因素綜合的復(fù)雜疾病，癌癥和炎癥。細(xì)胞因子類的干擾素和白介素，刺激免疫、調(diào)節(jié)炎癥，治療復(fù)雜疾病。第五十七頁，共一百零六頁。在很多情況下，生物藥物的發(fā)現(xiàn)都是生理生化功能和分子進(jìn)展的理性考慮，更準(zhǔn)確地來說，就是機(jī)體自身的活性物質(zhì)作為藥物。2000年，人類基因組測序的完成和蛋白組學(xué)研究的興起，為基于基因組和蛋白組的生物藥物設(shè)計(jì)，特別是蛋白質(zhì)類和核酸類藥物提供了大量的生物信息，成為藥物研發(fā)的一個(gè)新熱點(diǎn)。植物、微生物也是生物藥物地重要來源。在20世紀(jì)50年代以前，大量的藥物就是從植物中發(fā)現(xiàn)的，如地高辛、洋地黃毒苷、阿司匹林、可待因和紫杉醇等。目前，美國100多種藥物（約占25％）最初來源于植物，盡管某些藥物現(xiàn)在已經(jīng)通過化學(xué)合成或半合成得以制造。第五十八頁，共一百零六頁。植物是潛在藥物最豐富的來源，顯花植物約26.5萬種，到目前為止不到1％的物種被用于藥物篩選。有兩條途徑從植物中篩選生物藥物。一條途徑種是收集營養(yǎng)體部分，最直接的隨機(jī)篩選，雖然象紫杉醇這樣的藥物是相當(dāng)成功的，但總體來說，成功率仍較低。另一條途徑是靶向篩選，如民族藥材學(xué)(ethnobotany)，研究植物與人之間的關(guān)系。在這方面可以借鑒中藥的經(jīng)驗(yàn)，以提高中選率。微生物特別是細(xì)菌和真菌已經(jīng)證明是抗生素和抗癌藥物的一個(gè)重要來源。目前發(fā)現(xiàn)并描述的微生物藥物近15000種，大約2/3由放線菌產(chǎn)生，不少藥物用于臨床。第五十九頁，共一百零六頁。合理藥物設(shè)計(jì)已經(jīng)越來越成為藥物發(fā)現(xiàn)的常規(guī)途徑。大規(guī)模系統(tǒng)篩選天然或合成物質(zhì)，已獲得了大批現(xiàn)代藥物。在已知藥物靶標(biāo)的三維結(jié)構(gòu)時(shí)，根據(jù)藥物與靶標(biāo)的相互作用，進(jìn)行計(jì)算機(jī)模擬修飾已知藥物，從而設(shè)計(jì)新藥。靶標(biāo)往往是蛋白質(zhì)或酶或受體，X射線晶體結(jié)構(gòu)和NMR分析結(jié)果都可用于設(shè)計(jì)。有很多分子模擬軟件可供藥物設(shè)計(jì)，這種設(shè)計(jì)的產(chǎn)物是小分子配體，如受體抑制劑，能準(zhǔn)確進(jìn)入靶標(biāo)的活性位點(diǎn)區(qū)域，從而阻斷受體活性，發(fā)揮藥效。第六十頁，共一百零六頁。對傳統(tǒng)的隨機(jī)藥物篩選的一個(gè)改進(jìn)就是組合化學(xué)庫的高通量篩選，組合文庫在較短時(shí)間內(nèi)相對容易和低價(jià)合成，實(shí)際上許多大型制藥公司擁有數(shù)十萬個(gè)天然和合成的化合物。對于短多肽，化學(xué)合成也很容易。此外，各種生物文庫，如噬菌體展示文庫、酵母展示文庫、酵母雙雜交系統(tǒng)等可用于蛋白質(zhì)類藥物的篩選和發(fā)現(xiàn)。對已發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)藥物進(jìn)行突變改造和其他蛋白質(zhì)如抗體、受體等融合，提高活性、延長半衰期是一種切實(shí)可行的途徑。如IL-2的125位由半胱氨酸變?yōu)榻z氨酸后，明顯延長半衰期。干擾素IFNα1c的86位氨基酸Cys突變后，失去形成二硫鍵巰基，提高了產(chǎn)物在大腸桿菌中表達(dá)的穩(wěn)定性。第六十一頁，共一百零六頁。Amegen公司在20世紀(jì)80年代發(fā)現(xiàn)的8種干擾素α的基礎(chǔ)上，進(jìn)行同源性分析，發(fā)現(xiàn)完全的相同位點(diǎn)99個(gè)。從而設(shè)計(jì)合成了保守干擾素，對其中的數(shù)個(gè)氨基酸進(jìn)行突變，只有在該位點(diǎn)出現(xiàn)頻率高的氨基酸取代，共形成三種突變產(chǎn)物，其中IFNcon-1（Infergen）于1997年批準(zhǔn)上市。多種溶栓蛋白藥物的突變改造體也正在不同的試驗(yàn)研究階段。對于細(xì)胞因子類，改變其受體結(jié)合部位的氨基酸，提高受體親和力和結(jié)合能力，能提高其生物活性。對IFNα1c的受體結(jié)合域AB環(huán)31、32位進(jìn)行突變?nèi)〈?，提高了抗病毒的生物活性。第六十二頁，共一百零六頁。一旦發(fā)現(xiàn)候選新藥，就要鑒定其物理化學(xué)性質(zhì)，如結(jié)構(gòu)、分子量、穩(wěn)定性等。常常需要組合2～3種高分辨率的色譜純化方法，以獲得均質(zhì)的初始蛋白質(zhì)。所鑒定的特征可用于生產(chǎn)制造中的質(zhì)量控制。完成特性鑒定后，可申報(bào)專利。臨床前測試藥物的安全性、質(zhì)量和有效性，包括藥物代謝譜、藥物動力學(xué)譜、生物利用度、急毒和長毒，免疫毒性、致癌性、誘變性、生殖毒性和致畸性等。臨床試驗(yàn)需要5年甚至更長時(shí)間，而且新藥申請專利受到保護(hù)。

第六十三頁，共一百零六頁。根據(jù)生物藥物的特點(diǎn)，臨床前和臨床試驗(yàn)均所需藥物為幾百克至1公斤的活性成分即可。設(shè)計(jì)最適生產(chǎn)過程用于藥物評價(jià)并有利于以后的放大是十分重要的。通常是實(shí)驗(yàn)室規(guī)模生產(chǎn)毫克級藥物，用于研發(fā)和特征鑒定等。小規(guī)模生產(chǎn)克級藥物，用于臨床前和臨床試驗(yàn)大規(guī)模生產(chǎn)百克至公斤級藥物，用于商業(yè)藥品銷售。第六十四頁，共一百零六頁。第三節(jié)生物制藥的發(fā)展歷程

制藥工業(yè)的歷史大約只有60多年，但從開始就發(fā)展很快，目前全世界制藥企業(yè)超過10000家，生產(chǎn)制造5000多種藥物，其中約100家為跨國公司現(xiàn)代制藥工業(yè)的發(fā)展可追溯到20世紀(jì)之交，那時(shí)只有4種藥物：洋地黃用于治療各種心血管疾病，奎寧用于治療瘧疾，吐根屬植物提取物（活性成分為生物堿）用于治療痢疾，水銀用于治療梅毒，但當(dāng)時(shí)缺乏安全性和有效性。隨著生物學(xué)和有機(jī)化學(xué)的發(fā)展，能人工合成某些具有治療作用化合物。第六十五頁，共一百零六頁。1800：阿司匹林，從而導(dǎo)致了藥物化學(xué)公司的誕生，Bayer和Hoechst公司。直到1930年代，制藥工業(yè)才開始大發(fā)展。磺胺類藥物的發(fā)現(xiàn)和化學(xué)合成是最初標(biāo)志，能有效治療很多細(xì)菌的感染。大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)胰島素也成為現(xiàn)實(shí)。1940年代大規(guī)模生產(chǎn)青霉素，此時(shí)，建立了很多現(xiàn)代的領(lǐng)頭制藥企業(yè)，如EliLilly、Wellcome、Glaxo、Roche等。早期的制藥幾乎都是化學(xué)合成的。第六十六頁，共一百零六頁。一、天然生物材料的提取早期的生物藥物是來自動物臟器和血液，即臟器制劑，以李時(shí)珍所著的本草綱目和中國藥用動物志為典型代表，分別收錄藥物1892種和藥用動物1500余種。屬單方入藥，簡單加工制造，幾乎沒有規(guī)模，是以原料藥為主。制品純度低，有效成分不明確。某些臟器制劑仍然在歐亞地區(qū)特別是第三世界國家和日本使用。在20世紀(jì)50年代后，隨著對動物臟器的有效成分和生理活性物質(zhì)的全面了解，生產(chǎn)工藝技術(shù)提高，分離和純化制劑技術(shù)也完善，改變了原來的混合制劑，成為高純度單一特異性組分的生化藥物制劑，豬牛胰島素、前列腺酶及激素第六十七頁，共一百零六頁。二、傳統(tǒng)微生物發(fā)酵階段1928年英國Fleming發(fā)現(xiàn)了抗菌物質(zhì)，1940年FloreyChain等提取并證明了青霉素的療效。起初沿用初級代謝產(chǎn)物的發(fā)酵條件，采用表面培養(yǎng)法生產(chǎn)青霉素。隨后研發(fā)了攪拌發(fā)酵沉沒法生產(chǎn)成功，提高了供氧和通氣量，菌株選育、培養(yǎng)和深層發(fā)酵、提取技術(shù)和設(shè)備的研究取得了突破性進(jìn)展，給抗生素生產(chǎn)帶來了革命性的變化，開始了微生物工業(yè)時(shí)代。以后鏈霉素、金霉素、紅霉素等抗生素出現(xiàn)，抗生素成為制藥業(yè)的獨(dú)立門類。黑根霉一步生物轉(zhuǎn)化孕酮為11a-羥基孕酮，實(shí)現(xiàn)甾體類激素工業(yè)化第六十八頁，共一百零六頁。三、酶工程技術(shù)的出現(xiàn)與應(yīng)用酶工程是酶學(xué)和工程學(xué)相互結(jié)合滲透發(fā)展形成的，以應(yīng)用為目的，研發(fā)新酶并生產(chǎn)、分離和純化，包括酶的固定化及酶反應(yīng)器及酶的分子設(shè)計(jì)等。在20世紀(jì)20年代，就出現(xiàn)了酶工程，以自然酶制劑在工業(yè)上大規(guī)模應(yīng)用的特征，原料以動植物為主。1953年，GrubhogerSchleith用重氮化聚氨基聚苯乙烯樹脂對羧肽酶、蛋白酶、核酸酶等進(jìn)行固定，產(chǎn)生了固定化酶技術(shù)。

第六十九頁，共一百零六頁。1969年，千畑一郎等用固定化氨基?；讣夹g(shù)拆分了DL-氨基酸，生產(chǎn)L-氨基酸，隨后固定化天冬氨酸酶生產(chǎn)L-天冬氨酸等，開創(chuàng)了固定化酶應(yīng)用的局面。以后相繼出現(xiàn)了化學(xué)修飾酶、人工酶、有機(jī)相酶反應(yīng)等化學(xué)酶工程和遺傳修飾、改變及克隆酶等生物酶工程，并且以微生物為酶工程的主要來源。在制藥工業(yè)上的應(yīng)用:酶制劑直接或間接應(yīng)用于醫(yī)藥;生物轉(zhuǎn)化，給已有藥物添加基團(tuán)，增加藥效和功能;細(xì)胞固定化技術(shù)用于動物細(xì)胞培養(yǎng)制藥;酶抑制劑是低分子物質(zhì)，對微生物本身無害，在人體有生理活性，是藥物研發(fā)的一個(gè)重要方向。

第七十頁，共一百零六頁。固定化大腸桿菌細(xì)胞（產(chǎn)生青霉素酰化酶）轉(zhuǎn)化青霉素G、V，除去側(cè)鏈生產(chǎn)無側(cè)鏈青霉素，即6-氨基青霉烷酸。固定化5-磷酸二酯酶水解轉(zhuǎn)化酵母RNA，生產(chǎn)5-復(fù)合單核苷酸。固定化氨基?；覆鸱只瘜W(xué)合成的DL-氨基酸，產(chǎn)生有活性的L-氨基酸。已上市的酶抑制劑;阿卡波糖,抑制葡萄糖苷酶活性，降血糖。洛伐他汀抑制3-羥甲基戊二酰輔酶A還原酶，降膽固醇。第七十一頁，共一百零六頁。四、動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)1838年植物學(xué)家Schleiden和1839年動物學(xué)家Schwann首次把細(xì)胞作為植物、動物的基本結(jié)構(gòu)單元，創(chuàng)立了細(xì)胞學(xué)說，是19世紀(jì)的三大發(fā)現(xiàn)之一。1885年德國Roux用生理鹽水培養(yǎng)雞胚組織，1897年Loeb用血清和血漿培養(yǎng)結(jié)締組織細(xì)胞，1907年Harrison在無菌條件下離體成功地培養(yǎng)蛙胚神經(jīng)組織，并使之生長，是現(xiàn)代動物細(xì)胞培養(yǎng)的開端。1923年Carrel發(fā)明了卡士瓶培養(yǎng)法，1951年，Earle等開發(fā)了培養(yǎng)基，動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)開始形成。第七十二頁，共一百零六頁。動物細(xì)胞培養(yǎng)以成為重要的生物藥物制造技術(shù)，目前所用動物細(xì)胞：昆蟲細(xì)胞、哺乳動物細(xì)胞、雞胚細(xì)胞等。動物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)的藥物有：病毒疫苗，如乙肝疫苗、脊椎灰質(zhì)炎疫苗、狂犬疫苗等；非抗體免疫調(diào)節(jié)劑，如干擾素、白細(xì)胞介素、巨噬細(xì)胞激活因子等；多肽生長因子，如神經(jīng)生長因子、成纖維細(xì)胞生長因子、表皮生長因子、血清生長因子等；酶類，如組織血纖維溶酶原激活劑、VIII因子等；激素類如促黃體生成素、促濾胞素等。腫瘤特異抗原如癌胚抗原等；單克隆抗體；病毒殺蟲劑如桿狀病毒等；皮膚移植如單細(xì)胞培養(yǎng)等。第七十三頁，共一百零六頁。五、植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)與轉(zhuǎn)基因植物制藥創(chuàng)始人德國Haberlandt于19世紀(jì)末期對植物細(xì)胞在培養(yǎng)液中培養(yǎng)，能存活一段時(shí)間。1902年他又對葉肉進(jìn)行培養(yǎng)。

到30年代，利用組織培養(yǎng)可以使細(xì)胞分化成完整的植株，Gautheret對煙草細(xì)胞、Nobercourt對蘿卜細(xì)胞、White對楊樹細(xì)胞成功培養(yǎng)。1958：Steward等從胡蘿卜韌皮部組織培養(yǎng)出完整植株，VisilHildebrandt用煙草單細(xì)胞培養(yǎng)成可育完整植株.

1969：Nitch用花粉培養(yǎng)出單倍體植株，

1970：Steward用懸浮細(xì)胞培養(yǎng)出胡蘿卜可育植株。

第七十四頁，共一百零六頁。Routier和Nickell首先申請用植物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)有機(jī)產(chǎn)物的專利。

70年代以后，越來越多的植物被用來細(xì)胞培養(yǎng)，快速繁育、離體保存和生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物。用高度分化的組織仍能培養(yǎng)發(fā)育成完整植株，即細(xì)胞的全能性是今天培養(yǎng)技術(shù)的基礎(chǔ)。大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)發(fā)展起來，如日本已開發(fā)20000升攪拌斧式反應(yīng)器生產(chǎn)煙草細(xì)胞?，F(xiàn)在已生產(chǎn)的藥物有奎寧、長春堿、嗎啡、可卡因、莨菪堿、蛇根堿、阿托品、多巴、小檗堿等。農(nóng)藥有除蟲菊脂、魚藤酮等，食品類有紫草寧、花青素和香精等。

第七十五頁，共一百零六頁。六、抗體工程技術(shù)抗體是能與相應(yīng)抗原特異性結(jié)合的具有免疫反應(yīng)功能的球蛋白。1890年Behring和北里柴三郎等發(fā)現(xiàn)了白喉抗毒素，并建立了血清治療法，開始了第一代抗體藥物，如破傷風(fēng)抗毒素血清仍然在使用。1937年Tiselius等電泳分離血清蛋白，發(fā)現(xiàn)抗體活性主要為γ球蛋白。在相當(dāng)長的時(shí)間內(nèi)，γ球蛋白成了抗體的同義詞。60年代，發(fā)現(xiàn)患骨髓瘤的病人血清中有與抗體分子結(jié)構(gòu)類似的球蛋白，因此把具有抗體活性、化學(xué)結(jié)構(gòu)與抗體相似的球蛋白通稱為免疫球蛋白Ig。第七十六頁，共一百零六頁。由于病原微生物含有多種抗原決定簇的抗原物質(zhì)，因此制得的抗體是多種抗體的混合物，即多克隆抗體。這些抗體制劑在使用中經(jīng)常發(fā)生非特異性交叉反應(yīng)而導(dǎo)致假陽性結(jié)果，同時(shí)產(chǎn)量低，難以滿足臨床需要。1975年Kohler和Milstein把來自脾臟能產(chǎn)生抗體的B淋巴細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞，進(jìn)行原生質(zhì)體融合，得到了通過離體培養(yǎng)就能產(chǎn)生單一抗體的雜交細(xì)胞，即雜交瘤細(xì)胞。這是首次把雜交瘤技術(shù)應(yīng)用于單克隆抗體的制備。與多克隆抗體相比，單克隆抗體具有高度特異性、均一性，而且來源穩(wěn)定，可大量生產(chǎn)，成了抗體制備和生產(chǎn)的主要方法。單克隆抗體是第二代抗體。第七十七頁，共一百零六頁。動物源性單克隆抗體在人體應(yīng)用中，也存在抗原性，容易產(chǎn)生過敏反應(yīng)，在體內(nèi)易失效。人源單克隆抗體才是最終目標(biāo)。因此產(chǎn)生了在基因水平對抗體結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造的學(xué)科即抗體工程，通過原核微生物或昆蟲細(xì)胞表達(dá)抗體的功能部分，制備嵌合抗體，并對抗體改形、變小，完全人源化抗體，這就是所謂的第三代抗體。1981年美國第一種單克隆抗體診斷試劑盒被批準(zhǔn)進(jìn)行商品化生產(chǎn)，至今品種已達(dá)數(shù)百種。至2002年，F(xiàn)DA批準(zhǔn)的臨床治療性抗體藥物10余種。第七十八頁，共一百零六頁。抗體類型商品名應(yīng)用鼠源單克隆抗體Orthoclone器官移植排斥嵌合抗體Peopro冠狀動脈成形術(shù)，心絞痛嵌合抗體RituxanB細(xì)胞型非霍奇金淋巴瘤嵌合抗體Simulect器官移植排斥嵌合抗體Remicade回腸炎，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎人源化抗體Zenapax器官移植排斥人源化抗體Synagis嬰兒呼吸道合胞病毒人源化抗體Herceptin乳腺癌人源化抗體Campath慢性淋巴細(xì)胞白血病人源化抗體偶聯(lián)物Mylotarg急性復(fù)發(fā)骨髓白血病鼠源抗體放射性偶聯(lián)物ZevalinB細(xì)胞型非霍奇金淋巴瘤第七十九頁，共一百零六頁。七、基因工程技術(shù)基因工程是在體外對生物的遺傳物質(zhì)基因進(jìn)行剪切、拼接、重新組合，與適宜的載體連接，構(gòu)成完整的基因表達(dá)系統(tǒng)，然后導(dǎo)入宿主生物細(xì)胞內(nèi)，與原有遺傳物質(zhì)整合或以質(zhì)粒形式單獨(dú)在細(xì)胞中繁殖，編碼產(chǎn)生人類所需的物質(zhì)或創(chuàng)造新的物種，也可對疾病進(jìn)行基因治療。1973年重組DNA技術(shù)的建立為標(biāo)志，是科學(xué)技術(shù)史上的里程碑。應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥、輕工、化工、環(huán)境等領(lǐng)域，成為人類解決糧食、能源、環(huán)境、制藥的主要手段。第八十頁，共一百零六頁。1976年世界上第一家基因工程技術(shù)開發(fā)藥物的公司（Genentech公司）建立，開始了現(xiàn)代生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)發(fā)展的新紀(jì)元。1982年世界上第一個(gè)基因工程藥物重組人胰島素獲得FDA批準(zhǔn)，由EliLilly公司正式生產(chǎn)，推向市場?；蚬こ碳夹g(shù)首先在醫(yī)藥領(lǐng)域?qū)崿F(xiàn)產(chǎn)業(yè)化，到現(xiàn)在仍有60％～80％集中在醫(yī)藥領(lǐng)域，占主要地位的是基因工程藥物的研究和商品化。研究開發(fā)的治療藥物是癌癥、心腦血管疾病、艾滋病、遺傳病等重大病而用常規(guī)方法又難以獲得的藥物。第八十一頁，共一百零六頁。年代技術(shù)貢獻(xiàn)者53DNA雙螺旋模型Watson和Crick58DNA半保留復(fù)制和中心法則Crick61遺傳密碼的堿基三聯(lián)體Crick和Nirenberg67破譯遺傳密碼Khorana和Nirenberg71首家生物技術(shù)制藥公司成立Cetus公司72體外重組DNAJackson和Berg73重組質(zhì)粒在大腸桿菌中表達(dá)Boyer和Cohen75細(xì)胞融合，單克隆抗體技術(shù)Kohler和Milstein76首家基因工程技術(shù)制藥公司成立Genentech公司78大腸桿菌中表達(dá)出胰島素Genentech公司第八十二頁，共一百零六頁。80轉(zhuǎn)基因小鼠Gordon等82基因工程人胰島素在美國上市EliLilly公司82轉(zhuǎn)基因超級小鼠Palmiter等83基因擴(kuò)增的PCR技術(shù)Mullis85植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)Horsch等86基因工程重組乙肝疫苗上市Merck公司87轉(zhuǎn)基因鼠乳腺表達(dá)藥物tPAGordon等第八十三頁，共一百零六頁。90人類基因組計(jì)劃開始美國97克隆動物綿羊多利，轉(zhuǎn)凝血因子IX基因綿羊波利Wilmut等99中國加入人類基因組計(jì)劃

2000繪制出人類基因組“工作框架圖”中、美、英、日、法、德等6國2001完成人類基因組“中國卷”

中國2003繪制出人類基因組“序列圖”中、美、英、日、法、德等6國第八十四頁，共一百零六頁。第四節(jié)生物制藥的現(xiàn)狀和展望現(xiàn)代生物技術(shù)發(fā)展迅猛，日益影響和改變著人們的生產(chǎn)和生活方式。生物技術(shù)引入醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)，使得生物醫(yī)藥業(yè)成為最活躍、進(jìn)展最快的產(chǎn)業(yè)之一。2000年全球生物技術(shù)藥物銷售額為300億美元，美國約為200億美元，其次是歐洲和日本。而與此同時(shí)，全球醫(yī)藥市場銷售額年遞增幅度卻遠(yuǎn)低于生物藥物的發(fā)展水平(近10%)，顯示出生物藥物的良好發(fā)展勢頭，并呈現(xiàn)出加速的跡象。第八十五頁，共一百零六頁。一、

國外生物制藥全世界生物技術(shù)公司3600多家，主要集中在歐美，美國1450家，歐洲700家，加拿大330家，日本也有幾百家。年產(chǎn)值超過10億美元的生物技術(shù)公司有20余家。美國是現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)源地，又是應(yīng)用現(xiàn)代生物技術(shù)研制新型藥物的第一個(gè)國家，多數(shù)基因工程藥物都首創(chuàng)于美國。年研究經(jīng)費(fèi)70億美元以上。

1980年美國的生物技術(shù)產(chǎn)品的銷額還是零增長，1991:59億USD，1996:101億USD，基因工程藥物為80億USD，1997:130億USD，2001:270億USD。第八十六頁，共一百零六頁。第八十七頁，共一百零六頁。美國2001年已達(dá)1450余家。從業(yè)人員達(dá)19萬人。形成規(guī)?；a(chǎn)的有Amgen,Biogen,Chiron,Schering－plough,EliLilly,Merker,Genentech,Hoffman－LaRoche,SmithKlineBeecham,OrthoBiotech等20余家公司，其中Genentech、Amgen、Biogen、Chiron和Genzyme的銷售額名列前茅。第八十八頁，共一百零六頁。第八十九頁，共一百零六頁。第九十頁，共一百零六頁。第九十一頁，共一百零六頁。2002年批準(zhǔn)35種藥物，另外有300多個(gè)品種進(jìn)入臨床實(shí)驗(yàn)或待批階段。到2002年底，F(xiàn)DA批準(zhǔn)234種生物技術(shù)藥物和疫苗（包括新的適應(yīng)癥）正式投放市場，其中新生物技術(shù)藥物和疫苗為141種。第九十二頁，共一百零六頁。第九十三頁，共一百零六頁。二、國內(nèi)生物制藥

20世紀(jì)80年代是我國生物制藥的起步階段，1983年成立生物工程開發(fā)中心，“七五”期間投資成立了基因工程藥物、生物制品、疫苗三個(gè)研究開發(fā)中心。項(xiàng)目主要集中在肝炎、疫苗、血液制品等產(chǎn)品，企業(yè)數(shù)目極少。1986年我國生物技術(shù)尚處于研發(fā)的初期，僅有單克隆抗體診斷試劑盒、微生物農(nóng)藥等少數(shù)、少量產(chǎn)品，醫(yī)藥產(chǎn)品的產(chǎn)值約為0.2億元，占生物技術(shù)產(chǎn)品銷售額的8％。20世紀(jì)90年代，企事業(yè)單位齊頭并進(jìn)，大發(fā)展。國外主要的基因工程藥物及疫苗，都能生產(chǎn).第九十四頁，共一百零六頁。到1996年醫(yī)藥產(chǎn)品的銷售額達(dá)為2.2億元，其中基因工程藥物和疫苗占10.5％。1998年，基因工程藥物銷售額達(dá)7.2億。代表性的產(chǎn)品rhuIFN-α1b，直到1989年申報(bào)新藥，1993年批準(zhǔn)試生產(chǎn)。通過國家863計(jì)劃、科技攻關(guān)計(jì)劃、火炬計(jì)劃及973等國家計(jì)劃的實(shí)施，使這一領(lǐng)域發(fā)展迅速，逐步縮短了與先進(jìn)國家的差距，產(chǎn)品從無到有，不斷發(fā)展壯大。經(jīng)過十幾年的努力，我國在生物技術(shù)領(lǐng)域取得了較快的發(fā)展，與世界先進(jìn)國家的差距明顯縮小，尤其是在基礎(chǔ)技術(shù)和實(shí)驗(yàn)室階段，許多領(lǐng)域已接近國外先進(jìn)水平。第九十五頁，共一百零六頁。

1000多家單位從事生物工程研究、生產(chǎn)和開發(fā)工作。注冊的生物技術(shù)公司共有200家左右，真正涉及到基因工程技術(shù)的不到100家，基因工程藥物并已在有關(guān)部門登記立項(xiàng)的公司60家，取得生產(chǎn)基因工程藥物試產(chǎn)或生產(chǎn)批文的企業(yè)約50家。

2000年底，我國已批準(zhǔn)上市的基因工程藥物和疫苗產(chǎn)品共計(jì)20余種，其中一類新藥有重組人干擾素