植物基因克隆方法

關(guān)于植物基因克隆方法第1頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月

一、基因克隆（分子克隆molecularcloning）通過體外重組技術(shù),將一段目的DNA經(jīng)切割、連接插入適當(dāng)載體，并導(dǎo)入受體細(xì)胞，擴(kuò)增形成大量子代分子的過程。二、基因克隆的核心---體外重組(Recombination)人工將一段目的DNA插入一個(gè)載體的過程。第2頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月載體DNA（vector）目的DNA（targetfragment）重組DNA（recombinantDNA）宿主（host）篩選、擴(kuò)增克?。╟lone）基因克隆的路線DNA重組轉(zhuǎn)化第3頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月

用何種方法取決于基因產(chǎn)物（Geneproducts）的豐度以及gene的相關(guān)背景知識，如geneoritsprotein的表達(dá)模式及初級結(jié)構(gòu)等

（一）已知基因產(chǎn)物的基因分離（二）未知基因產(chǎn)物的基因分離第4頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月（一）已知Geneproducts的基因分離1、利用DNA探針篩選基因文庫前提是已知一段DNA序列并構(gòu)建了基因文庫●

同源(homologous)DNA探針

為了克隆一個(gè)完整基因結(jié)構(gòu)或研究調(diào)節(jié)序列?！?/p>

異源(Heterologous)DNA探針利用一種植物的一段DNA序列作探針，從其它植物中克隆同源基因注意：有的基因在不同物種間同源性很高，有的則很低。第5頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月2、利用protein信息分離基因前提是所研究的protein可以從植物中分離純化●利用antibody篩選表達(dá)文庫(ExpressionLibrary)

AntibodyproductionConstructionofExpressionLibrary●利用protein測序的氨基酸信息

Probe(oligonucleotides)Primer(degeneratedprimer)第6頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月(b)

Oligonucleotideprobesorgeneratedprimersforgeneswhosetranslationproductshavebeencharacterized

p176Trp-Asp-Glu-Asn-Asn-Met122221(16species)Ser-Glu-Try-Leu-Thr-Asn622642(1152species)第7頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月第8頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月RT-PCRandRACEPCRReverseTranscription,RapidAmplificationofcDNAEnds第9頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月問題1：在瓊脂糖凝膠分析中看到少量或沒有RT-PCR產(chǎn)物。

原因：

1）RNA被降解

建議解決方法：利用無污染技術(shù)分離RNA；

如果使用RNase抑制劑，不要加熱超過45℃或pH超過8.0。

2）RNA中包含逆轉(zhuǎn)錄抑制劑

建議解決方法：

通過乙醇沉淀RNA除去抑制劑。用70％（v/v）乙醇對RNA沉淀進(jìn)行清洗。

逆轉(zhuǎn)錄抑制劑包括：SDS，EDTA，甘油，焦磷酸鈉，甲酰胺和胍鹽。

RT-PCR實(shí)驗(yàn)中的常見問題與對策第10頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月3）多糖同RNA共沉淀

建議解決方法：

使用氯化鋰沉淀RNA以除去多糖。4）起始RNA量不夠

建議解決方法：增加RNA量。

對于＜50ng的RNA樣品，可以在第一鏈cDNA合成中使用0.1μg到0.5μg乙酰BSA。

5）RNA模板二級結(jié)構(gòu)太多

建議解決方法：

將RNA和引物在不含鹽及緩沖液條件下變性/退火.提高逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)溫度，對SuperScriptⅡ可以到50℃，對ThermoScript可以到65℃。

注意：不要在＞60℃時(shí)使用oligo(dT)引物，選擇一個(gè)在反應(yīng)溫度可以退火的GSP。對于＞1kb的RT-PCR產(chǎn)物，保持反應(yīng)溫度≤65℃。

注意：不要在高于37℃時(shí)使用M-MLV。

如果不需要全長cDNA，在第一鏈反應(yīng)中使用隨機(jī)引物。

第11頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月6）PCR引物設(shè)計(jì)較差

建議解決方法：

避免在引物3‘端含有互補(bǔ)序列。避免可以形成內(nèi)部發(fā)卡結(jié)構(gòu)的序列。設(shè)計(jì)Tm類似的引物。

7）鎂離子濃度太低

建議解決方法：

從1mM到3mM，間隔0.5mM進(jìn)行一系列反應(yīng)，確定對于每個(gè)模板和引物對的最佳鎂離子濃度。8）退火溫度太高

建議解決方法：

把退火溫度設(shè)定為低于Tm5℃。因?yàn)楣焦浪鉚m值比所有真正的退火溫度實(shí)際會高些或低些。

9）富含GC的模板

建議解決方法：

對于GC含量＞50％的模板，使用PCRxEnhancerSolution。

第12頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月問題2：在瓊脂糖凝膠分析中觀察到非預(yù)期條帶。

原因：

1）引物和模板非特異性退火

建議解決方法：

以2℃到5℃間隔增加退火溫度，減少退火時(shí)間。

在開始幾個(gè)循環(huán)使用較高的退火溫度，然后使用較低的退火溫度。

使用PlatinumTaqDNA進(jìn)行自動(dòng)熱啟動(dòng)PCR。

2）引物設(shè)計(jì)較差

避免在引物3‘端含有2到3個(gè)dG或dC。3）RNA中沾染了基因組DNA

4）鎂離子濃度太高

建議解決方法：

優(yōu)化鎂離子濃度。

5）因?yàn)閿U(kuò)增復(fù)雜模板導(dǎo)致引物錯(cuò)誤起始

建議解決方法：

使用巢式PCR或遞減PCR。

第13頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月RACEPCR第14頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月PCR和細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制的相同點(diǎn)：（1）兩者都符合半保留復(fù)制模型，即兩條鏈都可作為模板，子代鏈中一條鏈來自于親代鏈，另一條鏈?zhǔn)切潞铣傻模?）兩者都需要引物（3）兩者都需要依賴DNA的DNA聚合酶（4）兩者的底物都是dNTP（5）DNA合成時(shí)都是在DNA聚合酶作用下按堿基配對原則往3’-OH上加dNTP，形成3’，5’磷酸二酯鍵（6）兩者新合成鏈延伸的方向都是5’to3’（7）兩者DNA合成的保真度（精確性）都較高第15頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月PCR和細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制的不同點(diǎn)：（1）復(fù)制為半不連續(xù)復(fù)制，而PCR兩條鏈的合成都是連續(xù)的（2）復(fù)制時(shí)引物是由引發(fā)酶或引發(fā)體合成的，而PCR引物是在反應(yīng)前加到反應(yīng)體系中（3）復(fù)制需要在特定的復(fù)制原點(diǎn)起始，并且有終止點(diǎn)，而PCR在有特異引物存在時(shí)在任何序列都可起始，并且沒有終止點(diǎn)（4）復(fù)制時(shí)兩條模板鏈?zhǔn)窃诮庑傅淖饔孟戮植看蜷_雙鏈，而PCR兩條模板鏈通過變性完全打開雙鏈（5）復(fù)制時(shí)兩條鏈的合成是同步進(jìn)行的，而PCR兩條鏈的合成可能不同步（6）PCR的DNA聚合酶為耐熱的DNA聚合酶，而復(fù)制的聚合酶一般不耐熱（7）復(fù)制一般為雙向復(fù)制，而PCR反應(yīng)中DNA合成是單向的（8）復(fù)制時(shí)由多種蛋白因子參與，而PCR只有DNA聚合酶參與第16頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月（二）未知Geneproducts的基因分離1、差異雜交篩選（differentialhybridizationscreening）

2、mRNA差異顯示(differentialdisplay)3、DNA表達(dá)文庫（expressionlibrary）

4、DNA結(jié)合蛋白基因的分離

5、信號傳遞蛋白基因的分離

6、圖位克隆技術(shù)（Map-basedcloning）第17頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月建庫法cDNALibraryab第18頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月傳統(tǒng)mRNA差異顯示技術(shù)（DDRT-PCR）是根據(jù)絕大多數(shù)真核細(xì)胞mRNA3’端具有的多聚腺苷酸尾（polyA）結(jié)構(gòu)，因此可用含oligo（dT）的寡聚核苷酸為引物將不同的mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。該方法的創(chuàng)始人LiangP和PardeeA根據(jù)PolyA序列起點(diǎn)前2個(gè)堿基除AA外只有12種可能性的特征，設(shè)計(jì)合成了12種下游引物，稱3’-錨定引物，其通式為5’-T11MN；同時(shí)為擴(kuò)增出polyA上游500bp以內(nèi)所有可能性的mRNA序列，在5′端又設(shè)計(jì)了20種10bp長的隨機(jī)引物。這樣構(gòu)成的引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增能產(chǎn)生出20000條左右的DNA條帶，其中每一條都代表一種特定mRNA種，這一數(shù)字大體涵蓋了在一定發(fā)育階段某種細(xì)胞類型中所表達(dá)的全部mRNA。將差別表達(dá)條帶中的DNA回收，擴(kuò)增至所需含量，進(jìn)行Southernblot或Northernblot或直接測序，從而對差異條帶鑒定分析，以便最終獲得差異表達(dá)的目的基因。第19頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月mRNA差異顯示(differentialdisplay)第20頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月表達(dá)文庫法第21頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月從基因文庫的功能上看可分為克隆文庫及表達(dá)文庫。克隆文庫由克隆載體構(gòu)建。載體中具復(fù)制子、多克隆位點(diǎn)及選擇標(biāo)記，可通過細(xì)菌培養(yǎng)使克隆片斷大量增殖。表達(dá)文庫是用表達(dá)載體構(gòu)建。載體中除上述元件外，還具有控制基因表達(dá)的序列(如啟動(dòng)子、SD序列、ATG、終止子等)，可在宿主細(xì)胞中表達(dá)出克隆片段的編碼產(chǎn)物。表達(dá)載體又有融合蛋白表達(dá)載體及天然蛋白表達(dá)載體之分。從克隆文庫中分離目的克隆時(shí)主要利用核酸探針，可以是根據(jù)蛋白質(zhì)序列合成的寡核苷酸探針，也可以是同種或同屬生物的同源序列探針。從表達(dá)文庫中分離目的克隆時(shí)，因克隆片段的表達(dá)產(chǎn)物蛋白質(zhì)具有抗原性及生物活性，所以除核酸探針外，還可以利用免疫學(xué)探針及生物功能進(jìn)行篩選。表達(dá)文庫適合于那些不知道蛋白質(zhì)的氨基酸序列、不能用核酸類探針篩選的目的基因的分離。

第22頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月1、差異雜交篩選（differentialhybridizationscreening）

2、mRNA差異顯示(differentialdisplay)3、DNA表達(dá)文庫（expressionlibrary）

4、DNA結(jié)合蛋白基因的分離

5、信號傳遞蛋白基因的分離

6、圖位克隆技術(shù)（Map-basedcloning）利用表達(dá)文庫利用酵母單雜交第23頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月Promoterstructure3’noncodingregion5’noncoding

regioncodingregionPromoterregion0ATG●-75-25TATACAATEnhancerSilencerOthercontrolsequenceCore

promoterTerminationsignal第24頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月DNA結(jié)合蛋白第25頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月a.DNA結(jié)合域-DNAbindingdomain，簡稱DNA-BD，它可識別效應(yīng)基因上游的一段特定的區(qū)段，即上游激活序列(up-streamactivatingsequence,UAS)，并與之結(jié)合。b.轉(zhuǎn)錄激活域-Transcriptionalactivationdomain，簡稱AD，它通過同轉(zhuǎn)錄機(jī)(transcriptionmachinery)中的其它成分的結(jié)合作用，啟動(dòng)UAS下游的基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。

轉(zhuǎn)錄因子的兩個(gè)主要結(jié)構(gòu)域：

第26頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月酵母單雜交(yeastonehybrid)技術(shù)是體外分析DNA與細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)相互作用的一種方法，通過對酵母細(xì)胞內(nèi)報(bào)告基因表達(dá)狀況的分析，來鑒別DNA結(jié)合位點(diǎn)并發(fā)現(xiàn)潛在的結(jié)合蛋白基因，或?qū)NA結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行分析.運(yùn)用此技術(shù)，能篩選到與DNA結(jié)合的蛋白質(zhì)，并可直接從基因文庫中得到編碼該蛋白質(zhì)的核苷酸序列，而無需復(fù)雜的蛋白質(zhì)分離純化操作。目前認(rèn)為真核生物的轉(zhuǎn)錄起始需要轉(zhuǎn)錄因子的參與。這些轉(zhuǎn)錄因子通常由一個(gè)DNA結(jié)合域（BD)和一個(gè)或多個(gè)與其他調(diào)控蛋白相互作用的轉(zhuǎn)錄激活域（AD）組成。用于酵母單雜交系統(tǒng)的酵母GAL4蛋白即是一種典型的轉(zhuǎn)錄因子。酵母單雜交Yeastone-hybridsystem第27頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月GAL4的DNA結(jié)合域靠近羧基端,含有幾個(gè)鋅指結(jié)構(gòu),可激活酵母半乳糖苷酶的上游激活位點(diǎn)(UAS);而轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域可與RNA聚合酶或轉(zhuǎn)錄因子TFIID相互作用，提高RNA聚合酶的活性.在這一過程中，DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域可完全獨(dú)立地發(fā)揮作用.據(jù)此，我們可將GAL4的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域置換為其他蛋白，只要他能與我們想要了解的目的基因相互作用，就照樣可以通過其轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域激活RNA聚合酶，從而啟動(dòng)對下游報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄。正是基于這一理論，酵母單雜交系統(tǒng)由2部分組成：(1)將文庫蛋白片段與GAL4轉(zhuǎn)錄激活域融合表達(dá)的cDNA文庫質(zhì)粒；(2)含有目的基因和下游報(bào)告基因的報(bào)告質(zhì)粒。首先將報(bào)告質(zhì)粒整合入酵母基因組,產(chǎn)生帶有目的基因的酵母報(bào)告株；再將文庫質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入報(bào)告株；若存在文庫蛋白與目的基因相互作用,可通過對報(bào)告基因的表達(dá)將文庫蛋白的基因篩選出來.

第28頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月第29頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月第30頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月1、差異雜交篩選（differentialhybridizationscreening）

2、mRNA差異顯示(differentialdisplay)3、DNA表達(dá)文庫（expressionlibrary）

4、DNA結(jié)合蛋白基因的分離

5、信號傳遞蛋白基因的分離

6、圖位克隆技術(shù)（Map-basedcloning）第31頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月

酵母雙雜交體系

酵母雙雜交體系(yeast-twohybridsystem,Y2H)是上一世紀(jì)九十年代初期在轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種敏感的檢測蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的方法，亦即是體內(nèi)鑒定基因的方法。它不僅可有效地用來分離能與一種已知的靶蛋白(targetprotein)相互作用的另一種蛋白質(zhì)及其編碼基因，而且可以用來確定蛋白質(zhì)相互作用的特異性結(jié)構(gòu)域及其氨基酸序列。第32頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月方法構(gòu)建兩種E.coli-Yeast穿梭質(zhì)粒載體:已知基因與BD序列融合表達(dá)融合的蛋白質(zhì)叫做誘餌蛋白質(zhì)(Baitprotein)第一種質(zhì)粒載體又叫做誘餌質(zhì)粒載體或DNA-BD質(zhì)粒載體(具Trp基因)。第33頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月第二種質(zhì)粒載體又叫做文庫質(zhì)粒載體或AD質(zhì)粒載體，它具有亮氨酸基因(leu)，是用來構(gòu)建cDNA表達(dá)文庫的專用載體。cDNA編碼蛋白質(zhì)與GAL4-AD多肽融合這種與AD融合的蛋白質(zhì)叫做基因文庫編碼蛋白質(zhì)，其中可與誘餌蛋白質(zhì)發(fā)生相互作用的特稱為捕獲蛋白質(zhì)(preyprotein)第34頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月AD:GAL4ActivationDomain;DNA-BP:DNABindingProtein;USA：Upstreamactivatingsequence.GAL1UAS啟動(dòng)子LacZ(orHIS3)報(bào)告基因GAL1UAS啟動(dòng)子LacZ(orHIS3)報(bào)告基因GAL1UAS啟動(dòng)子LacZ(orHIS3)報(bào)告基因轉(zhuǎn)錄DNABDADDNABD(a)(b)(c)XYADXY第35頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月1、差異雜交篩選（differentialhybridizationscreening）

2、mRNA差異顯示(differentialdisplay)3、DNA表達(dá)文庫（expressionlibrary）

4、DNA結(jié)合蛋白基因的分離

5、信號傳遞蛋白基因的分離

6、圖位克隆技術(shù)（Map-basedcloning）第36頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月圖位克隆技術(shù)圖位克隆(Map-basedcloning)又稱定位克隆(positionalcloning),1986年首先由劍橋大學(xué)的Alancoulson提出，用該方法分離基因是根據(jù)目的基因在染色體上的位置進(jìn)行的，無需預(yù)先知道基因的DNA順序，也無需預(yù)先知道其表達(dá)產(chǎn)物的有關(guān)信息，但應(yīng)有以下兩方面的基本情況:一是有一個(gè)根據(jù)目的基因的有無建立起來的遺傳分離群體。二是開展以下幾項(xiàng)工作:1)首先找到與目標(biāo)基因緊密連鎖的分子標(biāo)記；2)用遺傳作圖和物理作圖將目標(biāo)基因定位在染色體的特定位置；3)構(gòu)建含有大插入片段的基因組文庫(BAC庫或YAC)；4)以與目標(biāo)基因連鎖的分子標(biāo)記為探針篩選基因組文庫；5)用獲得陽性克隆構(gòu)建目的基因區(qū)域的跨疊群；6)通過染色體步行、登陸或跳躍獲得含有目標(biāo)基因的大片段克??；7)通過亞克隆獲得含有目的基因的小片段克隆；8)通過遺傳轉(zhuǎn)化和功能互補(bǔ)驗(yàn)證最終確定目標(biāo)基因的堿基序列。

第37頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月DNAmarkersforgeneticmaps●第38頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月eg.ThebreastcancergeneBRCA1MappingofBRCA1Toisolatethegene,thefirststepistodeterminewhichchromosomecontainsitandthepositionofthegeneonthischromosome.第39頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月第40頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月第41頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月圖位克隆存在的問題圖位克隆也有其自身的局限性，在某些情況下，就很難或者不能通過圖位克隆技術(shù)來定位基因。

在分析自然發(fā)生的變異的時(shí)候，我們最有可能遇到的復(fù)雜情況是一個(gè)給定的性狀是由不止一個(gè)的基因位點(diǎn)控制的。無論何時(shí)，當(dāng)影響這些性狀的自然或者誘導(dǎo)的突變被定位的時(shí)候，第二位點(diǎn)修飾成分會干擾這些分析。

表觀（上位）遺傳突變這個(gè)術(shù)語是描述一個(gè)基因在表達(dá)和功能上的可遺傳改變，而不涉及DNA序列的改變，這是圖位克隆工程中又一個(gè)可能的復(fù)雜情況。

關(guān)于染色體上位點(diǎn)的物理和遺傳距離的比值是變化的。1%重組的遺傳距離相當(dāng)于100-400Kb的物理距離，平均是250Kb。然而著絲粒區(qū)域是一個(gè)顯著的例外，在