DNA測序分析常見問題整理演示文稿

DNA測序分析常見問題整理演示文稿目前一頁\總數(shù)三十頁\編于十二點測序結(jié)果—峰圖四色圖譜：每一種顏色對應(yīng)一種堿基ATCG目前二頁\總數(shù)三十頁\編于十二點

引物DNA模板純化困難模板機器影響影響測序質(zhì)量的主要因素目前三頁\總數(shù)三十頁\編于十二點一、引物對測序結(jié)果的影響①引物合成時多（少）一個堿基②引物不純③模板上沒有引物結(jié)合位點④引物二聚體⑤雙引物結(jié)合目前四頁\總數(shù)三十頁\編于十二點合成時部分引物多一個堿基合成時部分引物少一個堿基●現(xiàn)象：每個峰后面有個同樣熒光信號的小“尾巴”?！裨颍汉铣蓵r引物多一個堿基?！駥Σ撸褐匦潞铣梢铩瘳F(xiàn)象：每個峰前面有個同樣熒光信號的小“尾巴”?！裨颍汉铣蓵r引物多一個堿基?！駥Σ撸褐匦潞铣梢锬壳拔屙揬總數(shù)三十頁\編于十二點引物（模板）不純●現(xiàn)象：整個峰圖噪音都比較高。（區(qū)別與小片段的干擾）●原因：引物（模板）純度太低，含有較多雜質(zhì)●對策：–建議使用HPLC（柱子純化）或PAGE純化的測序引物。–脫鹽純化的引物純度較低，適合做普通PCR，但不建議用來測序。目前六頁\總數(shù)三十頁\編于十二點模板上沒有引物結(jié)合位點●現(xiàn)象：沒有特異性的測序峰圖●原因：引物無法結(jié)合模板●對策重新設(shè)計引物目前七頁\總數(shù)三十頁\編于十二點引物二聚體●現(xiàn)象：前面100多bp噪音高，后面正常（引物二聚體片段小大在100bp左右）●原因：引物二聚體未去除干凈●對策：割膠純化目前八頁\總數(shù)三十頁\編于十二點雙引物結(jié)合●現(xiàn)象：從一開始（區(qū)別于非單克隆）就出現(xiàn)兩套峰●原因：模板有兩個引物結(jié)合位點，同時和兩個引物結(jié)合●對策：重新設(shè)計單個引物目前九頁\總數(shù)三十頁\編于十二點二、模板對測序結(jié)果的影響①模板不純②點突變（SNP）③移碼突變④雜合子⑤非單克隆目前十頁\總數(shù)三十頁\編于十二點噪音信號高終止峰PCR正常終止后面的噪音峰PCR正常終止正常模板與噪音目前十一頁\總數(shù)三十頁\編于十二點模板不純（非特異性PCR產(chǎn)物）●現(xiàn)象：每個峰下面都有其它顏色●原因：PCR主帶與雜帶混在一起測序●對策：凝膠電泳回收主帶，重新測序割膠純化目前十二頁\總數(shù)三十頁\編于十二點點突變（SNP）突變點如果模板有單核苷酸（堿基）突變（SNP），測序圖形中其他的位點一般都是單一的峰形，然后突然在某一個位點出現(xiàn)重疊峰(如圖中箭頭所示)。目前十三頁\總數(shù)三十頁\編于十二點移碼突變在450bp處因點突變導(dǎo)致移碼，在528bp處又因點突變恢復(fù)目前十四頁\總數(shù)三十頁\編于十二點雜合子雜合變點雜合信號處的套峰強度大小相等，都相當(dāng)于正常峰值的一半。目前十五頁\總數(shù)三十頁\編于十二點非單克隆特征：左邊清晰，右邊全部像雜合子

原因：挑克隆時兩個質(zhì)?；煸谝黄饘Σ撸盒绿艨寺?，重新制DNA目前十六頁\總數(shù)三十頁\編于十二點三、純化對測序結(jié)果的影響①染料峰②酒精峰③熒光物質(zhì)污染④釘子峰⑤有機物污染（瀑布效應(yīng)）目前十七頁\總數(shù)三十頁\編于十二點染料峰特征：染料峰位于序列的前100bp左右，是殘余的A、T、C、G、4個BigDye峰，其不影響其它序列的可靠性。目前十八頁\總數(shù)三十頁\編于十二點酒精峰特征：酒精峰位于序列的200bp-300bp堿基之間，圖譜被“透明”抬高，其同樣不影響其它序列的可靠性。目前十九頁\總數(shù)三十頁\編于十二點熒光物質(zhì)污染●現(xiàn)象：紅色峰異常高?！裨颍何粗蠓肿訜晒馕镔|(zhì)污染，恰好是紅色，被軟件誤認為紅色峰?！駥Σ撸阂来胃鼡Q水、緩沖液、甲酰胺、測序膠、毛細管；清洗或更換膠引導(dǎo)塊、針筒。目前二十頁\總數(shù)三十頁\編于十二點“釘子”峰●現(xiàn)象：四色并存突然拔起的尖峰，峰形銳利。●原因：毛細管內(nèi)有氣泡、灰塵、尿素結(jié)晶等，對激光全反射。●對策–灌膠時，避免氣泡產(chǎn)生；–上樣前，樣品先離心；–毛細管、檢測窗口保持清潔；–膠內(nèi)有尿素結(jié)晶時，注意不要吸進注射器；–樣品純化干凈。目前二十一頁\總數(shù)三十頁\編于十二點有機物污染（瀑布效應(yīng)）●現(xiàn)象：基線從高處突然下降?！裨颍河袡C物進入毛細管，受激發(fā)產(chǎn)生一定波長的熒光，抬高基線?！駥Σ撸阂来胃鼡Q水、緩沖液、甲酰胺、測序膠、毛細管；清洗或更換膠引導(dǎo)塊、針筒。目前二十二頁\總數(shù)三十頁\編于十二點四、困難模板對測序結(jié)果的影響①特殊結(jié)構(gòu)②Ploy結(jié)構(gòu)③高GC④重復(fù)序列⑤回文結(jié)構(gòu)目前二十三頁\總數(shù)三十頁\編于十二點特殊結(jié)構(gòu)目前二十四頁\總數(shù)三十頁\編于十二點Poly結(jié)構(gòu)Poly在序列的前端對信號影響較小,Poly在序列的后端對信號影響較大。Poly-G/poly-C很容易導(dǎo)致信號中斷和信號亂。目前二十五頁\總數(shù)三十頁\編于十二點高GCPoly-G/poly-C是高GC的一種，很容易導(dǎo)致信號衰減。局部高GC一般會導(dǎo)致信號中斷和亂峰。目前二十六頁\總數(shù)三十頁\編于十二點重復(fù)序列GT重復(fù)導(dǎo)致信號衰減A/G重復(fù)導(dǎo)致信號衰減或信號亂目前二十七頁\總數(shù)三十頁\編于十二點回文結(jié)構(gòu)其他復(fù)雜的二級結(jié)構(gòu)也會