液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法在藥物動(dòng)力學(xué)和代謝研究中的應(yīng)用

創(chuàng)新藥物及其代謝物濃度測(cè)定方法的建立及應(yīng)注意的問(wèn)題UnknownUser:鐘大放

第一頁(yè)，共六十頁(yè)。生物樣品中藥物及代謝物濃度測(cè)定臨床前吸收試驗(yàn)組織分布試驗(yàn)代謝排泄毒代臨床

臨床藥動(dòng)學(xué)制劑生物利用度及生物等效性

第二頁(yè)，共六十頁(yè)。生物樣品中代謝物濃度測(cè)定代謝物,影響藥物的安全性和有效性藥動(dòng)學(xué)研究測(cè)定母體藥物和代謝物濃度制劑生物等效性評(píng)價(jià)測(cè)定母體藥物和代謝物的濃度,等效性評(píng)價(jià)時(shí)以母體藥物濃度作為主要判斷指標(biāo)主要代謝物，活性不清楚藥動(dòng)學(xué)研究測(cè)定母體藥物和代謝物濃度制劑生物等效性評(píng)價(jià)測(cè)定母體藥物濃度

第三頁(yè)，共六十頁(yè)。生物樣品中代謝物濃度測(cè)定母體藥物體液濃度很低,代謝物為體內(nèi)的主要存在形式藥動(dòng)學(xué)研究測(cè)定母體藥物和代謝物濃度制劑生物等效性評(píng)價(jià)測(cè)定代謝物的濃度前體藥物藥動(dòng)學(xué)研究測(cè)定母體藥物(如果能測(cè)到)和代謝物濃度制劑生物等效性評(píng)價(jià)測(cè)定代謝物的濃度

第四頁(yè)，共六十頁(yè)。生物樣品中藥物濃度測(cè)定方法的建立和確證基本概念生物樣品分析方法的建立生物樣品分析方法的確證生物樣品分析方法的應(yīng)用分析數(shù)據(jù)的記錄與報(bào)告提交第五頁(yè)，共六十頁(yè)?；靖拍钌飿悠贩治龇椒ǖ闹匾?/p>

臨床藥理學(xué)研究、藥代動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)、生物等效性試驗(yàn)、藥物組織分布試驗(yàn)、排泄試驗(yàn)：數(shù)量和質(zhì)量血漿藥物濃度

藥物在體內(nèi)達(dá)到平衡狀態(tài)時(shí)，血漿中藥物濃度一般與藥物在作用部位的濃度密切相關(guān)：藥效和毒性分析方法

色譜學(xué)方法、免疫學(xué)方法、微生物學(xué)方法第六頁(yè)，共六十頁(yè)?；靖拍钌锝橘|(zhì)生物來(lái)源物質(zhì)能夠以可重復(fù)方式采集和處理包括全血、血漿、血清、尿、糞、各種組織第七頁(yè)，共六十頁(yè)?；靖拍罘治雠ù郎y(cè)樣品、適當(dāng)數(shù)目的標(biāo)準(zhǔn)樣品和質(zhì)控樣品的完整系列：相同實(shí)驗(yàn)條件和時(shí)間區(qū)段一天內(nèi)可以完成幾個(gè)分析批一個(gè)分析批也可以持續(xù)幾天完成通常一天完成一個(gè)分析批第八頁(yè)，共六十頁(yè)?；靖拍顪?zhǔn)確度在確定的分析條件下，測(cè)得值與真實(shí)值的接近程度精密度在確定的分析條件下，相同介質(zhì)中相同濃度樣品的一系列測(cè)量值的分散程度第九頁(yè)，共六十頁(yè)?；靖拍钸x擇性分析方法測(cè)量和區(qū)分共存組分中分析物的能力這些共存組分包括代謝物、雜質(zhì)、分解產(chǎn)物、介質(zhì)組分等基質(zhì)效應(yīng)由樣品中存在的干擾物質(zhì)，對(duì)響應(yīng)造成的直接或間接的影響第十頁(yè)，共六十頁(yè)?；靖拍钪噩F(xiàn)性分析方法在相同條件下，間隔一段短時(shí)間后測(cè)定結(jié)果的分散程度不同實(shí)驗(yàn)室間采用同一分析方法，測(cè)定結(jié)果的分散程度第十一頁(yè)，共六十頁(yè)?；靖拍顦?biāo)準(zhǔn)樣品在生物介質(zhì)中加入已知量分析物配制的樣品用于建立標(biāo)準(zhǔn)曲線、計(jì)算質(zhì)控樣品和未知樣品中分析物濃度質(zhì)控樣品（QC樣品）在生物介質(zhì)中加入已知量分析物配制的樣品用于監(jiān)測(cè)分析方法的重現(xiàn)性、評(píng)價(jià)每一分析批中未知樣品分析結(jié)果的完整性和正確性第十二頁(yè)，共六十頁(yè)?；靖拍顦?biāo)準(zhǔn)曲線實(shí)驗(yàn)響應(yīng)值與分析物濃度間的關(guān)系應(yīng)采用適當(dāng)?shù)募訖?quán)和統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)，用簡(jiǎn)單的數(shù)學(xué)模型來(lái)最適當(dāng)?shù)孛枋鰬?yīng)以各濃度點(diǎn)回歸計(jì)算結(jié)果的百分偏差最小為基礎(chǔ)第十三頁(yè)，共六十頁(yè)?；靖拍疃糠秶ǘ可舷蓿║LOQ）和定量下限（LLOQ）的連續(xù)的濃度范圍采用濃度-響應(yīng)關(guān)系能進(jìn)行可靠的、可重現(xiàn)的定量其準(zhǔn)確度和精密度可以接受第十四頁(yè)，共六十頁(yè)。OptimizationValidationImplementationDevelopmentRevalidationPre-Validation生物樣品分析方法的建立第十五頁(yè)，共六十頁(yè)。生物樣品分析方法的建立生物樣品分析常用方法色譜法

HPLC,GC,LC/MS,LC/MS/MS,GC/MS微生物法免疫分析法選擇依據(jù)

藥物的化學(xué)結(jié)構(gòu)、待測(cè)物濃度范圍、實(shí)驗(yàn)室條件第十六頁(yè)，共六十頁(yè)。生物樣品分析方法的建立（1）查閱相關(guān)文獻(xiàn)是否有分析方法可供借鑒盡可能獲知分析物待測(cè)濃度范圍JournalofChromatographyBRapidCommunicationsinMassSpectrometryJournalofPharmaceuticalandBiomedicalAnalysisBiomedicalChromatography

藥學(xué)學(xué)報(bào)，藥物分析雜志，中國(guó)臨床藥理學(xué)雜志第十七頁(yè)，共六十頁(yè)。生物樣品分析方法的建立（2）根據(jù)藥物的化學(xué)結(jié)構(gòu)分子的極性、酸堿性、穩(wěn)定性建立色譜分析方法的可能性使用哪種檢測(cè)器

質(zhì)譜、紫外、熒光、電化學(xué)…第十八頁(yè)，共六十頁(yè)。生物樣品分析方法的建立（3）樣品的穩(wěn)定性采集哪種生物樣品：血漿、血清、全血、尿、組織…儲(chǔ)存條件

–20C：大部分藥物

–80C：阿莫西林等 加穩(wěn)定劑：卡托普利等立即測(cè)試：維生素C等第十九頁(yè)，共六十頁(yè)。生物樣品分析方法的建立（4）生物樣品預(yù)處理液-液提取液-固提取沉淀蛋白在線提取第二十頁(yè)，共六十頁(yè)。生物樣品分析方法的建立（5）色譜條件選擇色譜柱流動(dòng)相組成pH值和緩沖鹽流速第二十一頁(yè)，共六十頁(yè)。生物樣品分析方法的建立（6）內(nèi)標(biāo)選擇與待測(cè)藥物色譜行為相近與待測(cè)藥物檢測(cè)器響應(yīng)相近與待測(cè)藥物提取回收率相近第二十二頁(yè)，共六十頁(yè)。生物樣品分析方法的建立（7）質(zhì)譜條件選擇準(zhǔn)分子離子和碎片離子碰撞誘導(dǎo)解離條件考察生物樣品的基質(zhì)效應(yīng)與色譜條件的匹配第二十三頁(yè)，共六十頁(yè)。生物樣品分析方法的建立（8）各種條件和參數(shù)的進(jìn)一步優(yōu)化

考察選擇性

考察靈敏度 考察線性關(guān)系 考察重現(xiàn)性（9）實(shí)際樣品預(yù)實(shí)驗(yàn)

最終確定濃度測(cè)定范圍第二十四頁(yè)，共六十頁(yè)。生物樣品分析方法的建立（10）其他因素

血漿蛋白結(jié)合 生物樣品測(cè)試的安全防護(hù)

第二十五頁(yè)，共六十頁(yè)。MethodValidationAccuracyPrecisionLimitofDetectionLimitof

QuantitationLinearityandRangeSpecificity/SelectivitySystemSuitabilityRuggedness/Robustness生物樣品分析方法的確證第二十六頁(yè)，共六十頁(yè)。分析方法的確證全面確證首次建立的生物樣品分析方法增加新的定量組份(如代謝物)對(duì)以前的方法進(jìn)行較大的改進(jìn)如：改變儀器、檢測(cè)器等第二十七頁(yè)，共六十頁(yè)。分析方法的確證部分確證生物分析方法在實(shí)驗(yàn)室間的轉(zhuǎn)移定量濃度范圍改變生物介質(zhì)改變

相同生物基質(zhì)內(nèi)種屬的改變（例如大鼠血漿和小鼠血漿）同種內(nèi)生物樣品的改變（例如人血漿和人尿）稀少生物介質(zhì)證實(shí)復(fù)方給藥后分析方法的選擇性小幅改變流動(dòng)相比例和柱溫第二十八頁(yè)，共六十頁(yè)。分析方法的確證選擇性證明所測(cè)定的物質(zhì)是預(yù)期的分析物內(nèi)源性物質(zhì)和其他代謝物不得干擾樣品的測(cè)定多組分定量分析時(shí)應(yīng)對(duì)每一待測(cè)物進(jìn)行考察，以保證它們互相之間不產(chǎn)生干擾色譜法：考察不同來(lái)源（n6）空白生物樣品色譜圖，標(biāo)準(zhǔn)生物樣品色譜圖（注明濃度），實(shí)際生物樣品色譜圖空白生物樣品中干擾物質(zhì)的響應(yīng)不超過(guò)待測(cè)物定量下限時(shí)響應(yīng)的20%第二十九頁(yè)，共六十頁(yè)。分析方法的確證標(biāo)準(zhǔn)曲線與定量范圍配制標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)所用生物基質(zhì)必須與實(shí)際研究樣品生物基質(zhì)相同

必須用至少6個(gè)非零濃度樣品建立標(biāo)準(zhǔn)曲線根據(jù)待測(cè)物濃度與響應(yīng)的相關(guān)性，用回歸分析法獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)不包括空白點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)曲線高、低濃度范圍為定量范圍定量范圍要能覆蓋全部待測(cè)濃度，不允許外推第三十頁(yè)，共六十頁(yè)。標(biāo)準(zhǔn)曲線與定量范圍

在定量范圍內(nèi)濃度測(cè)定結(jié)果應(yīng)達(dá)到試驗(yàn)要求的精密度和準(zhǔn)確度

標(biāo)準(zhǔn)曲線上75%的濃度點(diǎn)測(cè)定值不能超出真實(shí)值的15%（LLOQ濃度點(diǎn)不超出真實(shí)值的20%）相關(guān)系數(shù)r>0.99分析方法的確證第三十一頁(yè)，共六十頁(yè)。分析方法的確證定量下限定量下限是標(biāo)準(zhǔn)曲線上的最低濃度點(diǎn)至少應(yīng)滿足測(cè)定3～5個(gè)半衰期的藥物濃度，或Cmax的1/10～1/20時(shí)的藥物濃度其準(zhǔn)確度應(yīng)在真實(shí)濃度的80～120%范圍內(nèi)，RSD應(yīng)小于20%其響應(yīng)應(yīng)為空白生物基質(zhì)干擾物響應(yīng)的5倍至少應(yīng)由5個(gè)標(biāo)準(zhǔn)樣品測(cè)試結(jié)果證明第三十二頁(yè)，共六十頁(yè)。分析方法的確證精密度與準(zhǔn)確度選擇3個(gè)濃度的質(zhì)控樣品考察方法的精密度和準(zhǔn)確度低濃度選擇在定量下限附近，<3LLOQ高濃度接近于標(biāo)準(zhǔn)曲線上限濃度，75～90%測(cè)定3個(gè)分析批，每批每一濃度至少5個(gè)樣品精密度：質(zhì)控樣品的批內(nèi)和批間標(biāo)準(zhǔn)差

RSD15%，低濃度RSD20%準(zhǔn)確度：質(zhì)控樣品的相對(duì)偏差

允許范圍85～115%，低濃度80～120%第三十三頁(yè)，共六十頁(yè)。分析方法的確證樣品穩(wěn)定性文獻(xiàn)中關(guān)于分析物穩(wěn)定性的報(bào)道含藥生物樣品冷凍儲(chǔ)存條件下的穩(wěn)定性含藥生物樣品在室溫、凍融條件下的穩(wěn)定性樣品處理過(guò)程中的穩(wěn)定性樣品處理后在溶液中的穩(wěn)定性儲(chǔ)備液的穩(wěn)定性第三十四頁(yè)，共六十頁(yè)。分析方法的確證提取回收率樣品提取過(guò)程前、后，分析物含量百分比注意扣除基質(zhì)效應(yīng)和體積改變應(yīng)考察低、中、高3個(gè)濃度的提取回收率其結(jié)果應(yīng)當(dāng)基本一致、精密和可重現(xiàn)第三十五頁(yè)，共六十頁(yè)。分析方法的確證基質(zhì)效應(yīng)液相色譜-質(zhì)譜分析時(shí)，內(nèi)源性物質(zhì)使待測(cè)物的離子化效率降低或增強(qiáng)第三十六頁(yè)，共六十頁(yè)。分析方法的確證微生物學(xué)和免疫學(xué)分析標(biāo)準(zhǔn)曲線是非線性的采用更多的濃度點(diǎn)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果的準(zhǔn)確度是關(guān)鍵因素如果重復(fù)測(cè)定能改善準(zhǔn)確度，則應(yīng)在方法確證和未知樣品測(cè)定中采用同樣的步驟第三十七頁(yè)，共六十頁(yè)。分析方法的確證分析質(zhì)量保證標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品和QC樣品分別配制獨(dú)立的質(zhì)量保證人員未知濃度樣品考核質(zhì)量檢查報(bào)告第三十八頁(yè)，共六十頁(yè)。生物樣品分析方法的應(yīng)用未知濃度樣品的測(cè)試應(yīng)在生物樣品分析方法確證完成之后，開(kāi)始測(cè)試未知濃度的樣品由獨(dú)立的人員配制不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣品，對(duì)分析方法進(jìn)行考核每個(gè)未知樣品一般測(cè)定一次，必要時(shí)進(jìn)行復(fù)測(cè)生物等效性試驗(yàn)中，來(lái)自同一個(gè)體的生物樣品最好在同一批中測(cè)定第三十九頁(yè)，共六十頁(yè)。生物樣品分析方法的應(yīng)用未知濃度樣品的測(cè)試每個(gè)分析批應(yīng)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，組織分布試驗(yàn)時(shí)，可視具體情況而定隨行測(cè)定低、中、高3個(gè)濃度的QC樣品，每個(gè)濃度至少雙樣本，并應(yīng)均勻分布在未知樣品測(cè)試順序中當(dāng)一個(gè)分析批中未知樣品數(shù)目較多時(shí)，應(yīng)增加各濃度QC樣品數(shù)，使QC樣品數(shù)大于未知樣品總數(shù)的5%第四十頁(yè)，共六十頁(yè)。生物樣品分析方法的應(yīng)用未知濃度樣品的測(cè)試質(zhì)控樣品測(cè)定結(jié)果的偏差一般應(yīng)小于15%，低濃度點(diǎn)偏差一般應(yīng)小于20%最多允許1/3不在同一濃度的質(zhì)控樣品測(cè)定結(jié)果超限如果QC樣品測(cè)定結(jié)果不符合上述要求，則該分析批樣品測(cè)試結(jié)果作廢濃度高于定量上限的樣品，應(yīng)采用相應(yīng)的空白介質(zhì)稀釋后重新測(cè)定；對(duì)于濃度低于定量下限的樣品，應(yīng)以零值計(jì)算第四十一頁(yè)，共六十頁(yè)。分析數(shù)據(jù)的記錄與報(bào)告提交基本要素建立一般性和特殊性的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程保存完整的實(shí)驗(yàn)記錄：分析方法建立、確證和未知樣品測(cè)試過(guò)程中產(chǎn)生的測(cè)試原始圖譜和數(shù)據(jù)，包括QC樣品測(cè)試提交完成試驗(yàn)工作的相關(guān)資料：綜合信息、方法建立過(guò)程、日常樣品分析中的基本資料、其他相關(guān)信息第四十二頁(yè)，共六十頁(yè)。分析數(shù)據(jù)的記錄與報(bào)告提交綜合信息項(xiàng)目編號(hào)分析方法編號(hào)、分析方法類型、分析方法確證簡(jiǎn)化的理由相應(yīng)的項(xiàng)目計(jì)劃編號(hào)項(xiàng)目標(biāo)題第四十三頁(yè)，共六十頁(yè)。分析數(shù)據(jù)的記錄與報(bào)告提交方法建立過(guò)程分析方法的詳細(xì)描述：該方法所用對(duì)照品（被測(cè)藥物、代謝物、內(nèi)標(biāo)物）的純度和來(lái)源穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)描述和相關(guān)數(shù)據(jù)描述考察選擇性、準(zhǔn)確度、精密度、回收率、定量限、標(biāo)準(zhǔn)曲線的實(shí)驗(yàn)，并給出獲得的主要數(shù)據(jù)列出批內(nèi)、批間精密度和準(zhǔn)確度的詳細(xì)結(jié)果根據(jù)具體情況，提供代表性的色譜圖、質(zhì)譜圖，并加以說(shuō)明第四十四頁(yè)，共六十頁(yè)。分析數(shù)據(jù)的記錄與報(bào)告提交在日常樣品分析中的基本資料（一）所用對(duì)照品（被測(cè)藥物、代謝物、內(nèi)標(biāo)物）的純度和來(lái)源樣品處理和保存的情況：樣品編號(hào)、采集日期、運(yùn)輸前的保存、運(yùn)輸情況、分析前的保存信息應(yīng)包括日期、時(shí)間、樣品所處條件，以及任何偏離試驗(yàn)計(jì)劃的情況第四十五頁(yè)，共六十頁(yè)。分析數(shù)據(jù)的記錄與報(bào)告提交在日常樣品分析中的基本資料（二）樣品分析批的綜合信息：分析批編號(hào)、分析日期、分析方法、分析人員、開(kāi)始和結(jié)束時(shí)間、主要設(shè)備和材料的變化，以及任何可能偏離分析方法建立時(shí)的情況用于計(jì)算結(jié)果的回歸方程，分析樣品時(shí)標(biāo)準(zhǔn)曲線列表各分析批QC樣品測(cè)定結(jié)果綜合列表計(jì)算批內(nèi)和批間精密度、準(zhǔn)確度各分析批包括的未知樣品濃度計(jì)算結(jié)果第四十六頁(yè)，共六十頁(yè)。分析數(shù)據(jù)的記錄與報(bào)告提交在日常樣品分析中的基本資料（三）提交20%受試樣品測(cè)試的色譜圖復(fù)印件，包括相應(yīng)分析批的標(biāo)準(zhǔn)曲線和QC樣品的色譜圖復(fù)印件注明缺失樣品的原因、重復(fù)測(cè)試的結(jié)果對(duì)舍棄任何分析數(shù)據(jù)和選擇所報(bào)告的數(shù)據(jù)說(shuō)明理由第四十七頁(yè)，共六十頁(yè)。分析數(shù)據(jù)的記錄與報(bào)告提交其他相關(guān)信息縮略語(yǔ)列表參考文獻(xiàn)列表標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程列表第四十八頁(yè)，共六十頁(yè)。參考文獻(xiàn)國(guó)家藥典委員會(huì)：生物樣品分析方法的基本要求。見(jiàn)：中華人民共和國(guó)藥典，2005年版二部附錄USFDA:GuidanceforIndustry:BioanalyticalMethodValidation.May2001.ShahVP,MidhaKK,FindlayJW,etal.Bioanalyticalmethodvalidatio