上海市臨檢中心 臨床檢驗質(zhì)量管理培訓(xùn) 17沈佐君-分子診斷檢驗程序性能驗證指南解讀

分子診斷檢驗程序性能驗證指南解讀中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)附屬第一醫(yī)院（安徽省立醫(yī)院）沈佐君1范圍本指南適用于申請認(rèn)可或已獲認(rèn)可的醫(yī)學(xué)實(shí)驗室對分子診斷相關(guān)檢測程序進(jìn)行性能驗證實(shí)驗活動時使用，也可供醫(yī)學(xué)實(shí)驗室評審員在現(xiàn)場評審過程中參考使用。本指南適用的分子診斷技術(shù)包括：PCR、Sanger測序、二代基因測序(NGS)、原位雜交等，其他分子診斷使用的檢驗程序/方法可參考使用。本文件適用于醫(yī)學(xué)實(shí)驗室采用的經(jīng)確認(rèn)的檢驗程序。注：鑒于實(shí)際臨床工作中進(jìn)行分子診斷的樣本類型（如進(jìn)行原位雜交的樣本有血液、羊水穿刺、腫瘤組織等）以及預(yù)期用途差別較大，而不同樣本類型對性能驗證的要求和難易程度差別較大，建議結(jié)合實(shí)際情況酌情選擇與之相符合的性能驗證方案。2

規(guī)范性引用文件下列文件對于本指南的應(yīng)用是必不可少的。凡是注明日期的引用文件，僅該版本適用于本指南。凡是未注明日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改部分）適用于本指南。WS/T

420-2013《臨床實(shí)驗室對商品定量試劑盒分析性能的驗證》WS/T

492-2016《臨床檢驗定量測定項目精密度與正確度性能驗證》WS/T

505-2017《定性測定性能評價指南》YY/T

1261-2015《HER2基因檢測試劑盒（熒光原位雜交法）》YY/T

1459-2016《人類基因原位雜交檢測試劑盒》3術(shù)語和定義對于本指南，GB/T

29791.1-2013/ISO

18113-1：2009）中的定義適用。下列術(shù)語和定義適用于本指南。3.1可報告范圍

reportable

range體外診斷醫(yī)療器械性能特征已被驗證的測量區(qū)間。[GB/T29791.1-2013/ISO18113-1：2009

3.46注1]4.

總則4.1性能驗證的時機(jī)4.1.1

檢驗程序常規(guī)應(yīng)用前。4.1.2

任何嚴(yán)重影響檢測系統(tǒng)分析性能的情況發(fā)生后，應(yīng)在檢測系統(tǒng)重新啟用前對受影響的性能進(jìn)行部分性能驗證。影響檢測系統(tǒng)分析性能的情況可包括但不限于儀器主要部件故障，儀器搬遷，設(shè)施、環(huán)境的嚴(yán)重失控等。4.1.3

常規(guī)使用期間，實(shí)驗室可基于分析系統(tǒng)的穩(wěn)定性，利用日常工作產(chǎn)生的檢驗和質(zhì)控數(shù)據(jù)，定期對檢驗程序的分析性能進(jìn)行評審，應(yīng)能滿足檢驗結(jié)果預(yù)期用途的要求。新檢測系統(tǒng)也包含現(xiàn)用檢測系統(tǒng)的任一要素（儀器、試劑、校準(zhǔn)品等）變更，如試劑升級、儀器更新、校準(zhǔn)品溯源性改變等應(yīng)按照新系統(tǒng)來進(jìn)行驗證。4.2性能驗證的參數(shù)分子診斷檢驗程序的性能參數(shù)主要包括PCR定性和定量檢測、Sanger測序、二代基因測序(NGS)和原位雜交等。PCR定量檢測選擇驗證的性能指標(biāo)宜包括測量正確度、測量精密度（含測量重復(fù)性和測量中間精密度）、測量不確定度、分析特異性（含抗干擾能力）、分析靈敏度、檢出限和定量限、線性區(qū)間（可報告區(qū)間）等。PCR定性檢測選擇驗證的性能指標(biāo)宜包括方法符合率、檢出限、抗干擾能力、交叉反應(yīng)等。Sanger測序和NGS選擇驗證的性能指標(biāo)宜包括方法符合率和檢出限等。原位雜交技術(shù)應(yīng)依據(jù)樣本類型和預(yù)期用途，選用適宜的性能指標(biāo)進(jìn)行驗證，如基于完整細(xì)胞的原位雜交宜選用分析敏感性和特異性，基于組織的宜選用方法符合率。如果檢驗程序適用樣本類型包括血清與血漿，實(shí)驗室在臨床檢測時同時使用血清與血漿，應(yīng)進(jìn)行血清與血漿結(jié)果一致性的驗證。在腫瘤靶向基因檢測時，如果檢驗程序適用樣本類型包括除腫瘤組織/細(xì)胞以外的樣本（如血漿），應(yīng)進(jìn)行與腫瘤組織結(jié)果一致性的驗證。如果檢驗程序高度依賴人工操作或判斷，應(yīng)進(jìn)行不同操作人員間的驗證，驗證程序可參照本指南相關(guān)內(nèi)容制定。實(shí)驗室應(yīng)根據(jù)檢測項目的預(yù)期用途以及生產(chǎn)制造商聲明，選擇對檢測結(jié)果質(zhì)量有重要影響的參數(shù)進(jìn)行驗證。不同技術(shù)平臺、樣本類型以及預(yù)期用途不同時，所需驗證的性能指標(biāo)宜有所側(cè)重。4.3

性能驗證的判斷標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗室應(yīng)根據(jù)臨床需求選擇經(jīng)確認(rèn)的符合預(yù)期用途的檢驗程序。實(shí)驗室性能驗證結(jié)果的判斷標(biāo)準(zhǔn)是廠商或研發(fā)者在試劑盒或檢測系統(tǒng)說明書中聲明的性能指標(biāo)。5實(shí)驗前準(zhǔn)備樣本最好來自患者真實(shí)樣本，盡量與廠家建立性能指標(biāo)時所用材料一致。當(dāng)一份樣本需進(jìn)行多次試驗時，對樣本進(jìn)行分裝保存，避免反復(fù)凍融。5.1

實(shí)驗操作人員應(yīng)熟悉方法原理與操作，包括樣本處理、校準(zhǔn)、維護(hù)程序、質(zhì)量控制，確保檢測系統(tǒng)工作狀態(tài)正常。5.2實(shí)驗室設(shè)施及環(huán)境符合分析系統(tǒng)工作要求。5.3儀器經(jīng)過校準(zhǔn)，各項性能指標(biāo)合格。5.4試劑和校準(zhǔn)品滿足要求。5.5負(fù)責(zé)實(shí)施性能驗證的人員應(yīng)了解驗證方案，制定驗證計劃，并組織實(shí)施。5.6

涉及病理形態(tài)學(xué)的樣本（如組織、細(xì)胞學(xué)樣本等），需經(jīng)符合資質(zhì)的病理醫(yī)師于顯微鏡下確認(rèn)符合相應(yīng)要求后才可進(jìn)行后續(xù)檢測。需要時,可行腫瘤細(xì)胞富集。5.7

若涉及核酸提取，應(yīng)使用試劑盒配套或推薦的核酸提取試劑，并確保其提取效率滿足要求。核酸提取效率的評價宜包括：核酸濃度、純度及完整性。6性能驗證要求在常規(guī)應(yīng)用前，應(yīng)由實(shí)驗室對未加修改而使用的已確認(rèn)的檢驗程序進(jìn)行獨(dú)立驗證。已確認(rèn)的檢驗程序是經(jīng)國家衛(wèi)生管理部門批準(zhǔn)的體外診斷醫(yī)療器械使用說明書中規(guī)定的程序，或國際公認(rèn)標(biāo)準(zhǔn)或指南中規(guī)定的程序，或國家、地區(qū)法規(guī)中規(guī)定的程序。注：如果程序中含有與檢驗程序不適用的儀器、樣本類型、檢驗方法（包括核酸提取方法）或分析軟件的，則不屬于已確認(rèn)的檢驗程序。6.1定性項目的性能驗證6.1.1

方法符合率6.1.1.1

驗證要求通過與參比方法進(jìn)行比較。參比方法包括但不限于：金標(biāo)準(zhǔn)方法、行業(yè)公認(rèn)方法、經(jīng)驗證性能符合要求滿足臨床預(yù)期用途的方法（如：通過ISO15189認(rèn)可實(shí)驗室使用的相同檢測方法）。6.1.1.2

驗證方案a）樣本：選取陰性樣本至少5例、陽性樣本（宜包含弱陽性/低擴(kuò)增的樣本），一般不少于10例樣本。注1：罕見或少見病種的項目，可酌情減少樣本例數(shù)。注2：若弱陽性/低擴(kuò)增樣本不好獲取，可用適當(dāng)稀釋陽性樣本獲得類似的效果。注3：對于雜交檢測技術(shù)，若弱陽性/低擴(kuò)增樣本不好獲取，可用不同比例的特定細(xì)胞系混合獲得類似的效果。陰性樣本中應(yīng)包含與檢測對象核酸序列具有同源性、易引起相同或相似臨床癥狀的樣本。b）驗證方法：按照患者樣本檢測程序，采用參比方法和候選方法平行檢測。將所有檢測結(jié)果按下表匯總填表，計算符合率。表：方法符合率驗證參比方法總數(shù)陽性a陰性陽性陰性bda+bc+d候選方法總數(shù)ca+cb+da+b+c+d陽性符合率=a/(a+c)×100%陰性符合率=d/(b+d)×100%總符合率=(a+d)/(

a+b+c+d)×100%6.1.1.3

判斷標(biāo)準(zhǔn)參見

4.3。6.1.2

檢出限6.1.2.1

驗證要求所用檢驗程序在廠家試劑使用說明書等有聲明檢出限時，檢測項目在有標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)時，或以定量形式表達(dá)定性結(jié)果時，應(yīng)進(jìn)行檢出限的驗證。6.1.2.2

驗證方案a）樣本：定值標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（如：國際參考品、國家參考品、廠家參考品）。對于報告具體基因型的方法，其選用的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)需包括所有的突變類型。對于檢測對象同時含有不同比例的不同基因型時，應(yīng)設(shè)置多個梯度，主要從擴(kuò)增反應(yīng)終體系總核酸濃度和突變序列所占比例兩個方面進(jìn)行評價。b）驗證方法：使用定值標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的樣本梯度稀釋至廠家聲明的檢出限濃度，可重復(fù)測定5次或在不同批內(nèi)對該濃度樣本進(jìn)行20次重復(fù)測定（如測定5天，每天測定4份樣本）。稀釋液可根據(jù)情況選用廠家提供的稀釋液或陰性血清，該陰性血清除被驗證的目標(biāo)物必須陰性外，所含干擾物質(zhì)濃度必須在廠家聲明的范圍之內(nèi)。6.1.2.3

判斷標(biāo)準(zhǔn)如果是5次重復(fù)檢測，必須100%檢出靶核酸；如果是20次檢測，必須檢出至少18次靶核酸。示例1：NGS和Sanger測序

對于基因變異類型（如：SNV，indel，CNV，SV）的檢測，均應(yīng)分別進(jìn)行檢測限的驗證，以確定不同變異類型各自的檢測限。建議使用已知突變豐度的包含所有待檢測變異類型的經(jīng)過福爾馬林固定石蠟包埋的細(xì)胞系混合物或臨床樣本，將其稀釋至廠家聲明的檢出限濃度，以及高于和低于該濃度一個梯度濃度，按照廠家聲明的測序深度對該系列濃度樣本進(jìn)行測定（樣本總數(shù)不得少于5個，每個樣本檢測濃度不得少于3個），如果95%檢出限濃度以上的樣本檢測到可靠變異，則檢出限驗證通過。示例2：雜交

使用經(jīng)合格病理醫(yī)師評估的接近最低檢測限的按照一定比例混合的細(xì)胞系沉降制片/或組織切片，在不同批內(nèi)對樣本進(jìn)行測定（如連續(xù)測定5天，每天測定4份樣本），如果90%以上樣本符合細(xì)胞系特性或與中心參考實(shí)驗室結(jié)果相同（必要時可原片復(fù)核（快遞或進(jìn)行數(shù)字切片轉(zhuǎn)化），則測定下限驗證通過。需說明的是，此方法不適用原位雜交，原位雜交驗證見6.1.5。6.1.3

交叉反應(yīng)6.1.3.1

驗證要求應(yīng)驗證與檢測對象可能存在交叉反應(yīng)的核酸物質(zhì)對檢測的影響。對于病原體核酸檢測來說，主要指與檢測對象核酸序列具有同源性、易引起相同或相似臨床癥狀的病原體核酸，宜在病原體感染的醫(yī)學(xué)決定水平進(jìn)行驗證。對于報告具體基因型的方法，應(yīng)在待測核酸濃度水平驗證其它基因型對待測核酸測定的影響。6.1.3.2

驗證方案對于病原體核酸檢測，取一定濃度與待測核酸可能存在交叉反應(yīng)的病原體加入樣本保存液或經(jīng)確認(rèn)為陰性的樣本中，與常規(guī)樣本一樣處理，至少重復(fù)檢測3次；對于基因型檢測，取一定濃度經(jīng)其它方法（如測序等）確認(rèn)為其它基因型的樣本，與常規(guī)樣本一樣處理，至少重復(fù)檢測3次。6.1.3.3

判斷標(biāo)準(zhǔn)結(jié)果應(yīng)為陰性。6.1.4

抗干擾能力6.1.4.1

驗證要求分子診斷常見的干擾物質(zhì)主要包括血紅蛋白、甘油三酯、膽紅素、免疫球蛋白G、類風(fēng)濕因子和藥物等。實(shí)驗室可根據(jù)臨床需求、廠家聲明和樣本特點(diǎn)（實(shí)際可能存在的干擾物質(zhì)及達(dá)到的濃度）選擇需要驗證的干擾物質(zhì)及濃度。需要時，也應(yīng)評估抗凝劑和樣本保存液等對結(jié)果的影響。6.1.4.2

驗證方案實(shí)驗室可根據(jù)實(shí)際情況選擇驗證方案。方案1：實(shí)驗組為在弱陽性樣本中加入干擾物質(zhì)溶液（對照組加入等量的溶劑），使得干擾物質(zhì)的終濃度與廠家聲明的濃度相同，與常規(guī)樣本一樣處理，至少重復(fù)測定3次以上。方案2：選取含待驗證的高濃度水平干擾物質(zhì)且經(jīng)確認(rèn)不含被測物的臨床樣本作為實(shí)驗組，選取含低濃度水平干擾物質(zhì)且經(jīng)確認(rèn)不含被測物的臨床樣本作為對照組。分別在實(shí)驗組和對照組中加入弱陽性樣本（量小于10%），與常規(guī)樣本一樣處理，每組至少重復(fù)檢測3次。6.1.4.3

判斷標(biāo)準(zhǔn)方案1：弱陽性樣本檢測仍為弱陽性結(jié)果，則驗證通過。方案2：如果對照組和實(shí)驗組結(jié)果均為弱陽性，說明在驗證濃度下，干擾物質(zhì)對測定無顯著影響。如果對照組結(jié)果為弱陽性，實(shí)驗組結(jié)果為陰性，說明在驗證濃度下，干擾物質(zhì)對測定有顯著影響。6.1.5

原位雜交技術(shù)分析敏感性和特異性6.1.5.1

驗證要求至少200個與探針特定對應(yīng)的基因組目標(biāo)序列應(yīng)被用來進(jìn)行分析敏感性和特異性驗證。6.1.5.2

驗證方案樣本至少來自5個不同個體，至少50個（用于驗證遠(yuǎn)離著絲粒的探針）或100個（用于驗證近著絲粒探針）含有與探針相對應(yīng)的基因組目標(biāo)序列的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行原位雜交檢測。6.1.5.3

判斷標(biāo)準(zhǔn)敏感性和特異性均不低于90%。6.2

定量項目性能驗證分子診斷定量檢測項目的性能驗證請參見CNAS-GLXX《臨床化學(xué)定量檢驗程序性能驗證指南》。6.3

特定性能驗證對于商品化的診斷試劑，一般情況下不需要驗證核酸提取效率。在樣本來源有限、樣本組成復(fù)雜、目的基因在樣本中含量低或懷疑提取試劑有質(zhì)量問題時需要進(jìn)行核酸提取效率驗證。如果懷疑PCR擴(kuò)增系統(tǒng)有問題，則應(yīng)進(jìn)行擴(kuò)增效率驗證。對于NGS，為保證結(jié)果的可靠性，避免因測序深度過低導(dǎo)致的結(jié)果假陰性或測序深度太高引起的假陽性，應(yīng)進(jìn)行測序深度參考區(qū)間、上機(jī)測序的性能和數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)的性能驗證。6.3.1

核酸提取效率6.3.1.1

驗證要求核酸提取效率包括核酸純度，核酸提取產(chǎn)率和完整性。6.3.1.2

驗證方案按照試劑盒要求，提取含有不同濃度待測核酸的樣本，核酸濃度宜覆蓋廠家聲明的可提取的核酸濃度。a）核酸純度：將核酸提取液用分光光度計測定A260/280比值。b）核酸提取產(chǎn)率：將含有待測物質(zhì)的樣本平均分成2份，其中一份（A）加入一定體積（小于總體積10%）已知濃度的待測核酸，另一份（B）加入同體積核酸溶解液，按照試劑盒要求提取核酸，分別測定A和B提取的核酸量，按以下公式計算核酸提取得率，重復(fù)三次測定，計算平均值。A

?

B加入的待測核酸量核酸提取產(chǎn)率=×100%c）核酸完整性：按照試劑盒要求，提取含有不同濃度待測核酸的樣本，核酸濃度宜覆蓋廠家聲明的可提取的核酸濃度，取一定量的核酸提取液進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，與待測核酸標(biāo)準(zhǔn)物比較。6.3.1.3

判斷標(biāo)準(zhǔn)a）核酸純度：待測物質(zhì)為

DNA

時，A260/280

比值在

1.7-1.9；待測物質(zhì)為RNA

時，A260/280

比值在

1.8-2.0。b）核酸提取產(chǎn)率：核酸提取得率應(yīng)不低于廠家聲明或?qū)嶒炇抑贫ǖ臉?biāo)準(zhǔn)。c）核酸完整性：在期待核酸分子量相應(yīng)的位置可觀察到清晰或彌散的條帶，無明顯降解。6.3.2

擴(kuò)增效率驗證6.3.2.1

驗證要求擴(kuò)增效率包括樣本和標(biāo)準(zhǔn)品的擴(kuò)增效率兩部分，只有二者擴(kuò)增效率良好且一致時，定量結(jié)果才準(zhǔn)確。如果懷疑PCR擴(kuò)增系統(tǒng)有問題應(yīng)進(jìn)行擴(kuò)增效率驗證。6.3.2.2

驗證方案將接近線性范圍上限濃度的樣本10倍稀釋4-6個濃度，最低濃度應(yīng)在線性范圍內(nèi)或?qū)?biāo)準(zhǔn)品按照廠家要求處理，然后進(jìn)行擴(kuò)增。將濃度對數(shù)值作為橫軸，對應(yīng)的Ct值作為縱軸，繪制曲線，計算斜率（K），按以下公式計算擴(kuò)增效率（E）：E=10-1/K-16.3.2.3

判斷標(biāo)準(zhǔn)樣本和標(biāo)準(zhǔn)品的擴(kuò)增效率均≥90%且≤110%。6.3.3

上機(jī)測序的性能驗證6.3.3.1

驗證要求驗證所用測序儀是否正常運(yùn)行和使用，測序儀的各項性能參數(shù)是否符合要求，保證測序結(jié)果的可靠性。6.3.3.2

驗證方案建議使用質(zhì)控品或用參考品DNA制備的文庫樣本進(jìn)行上機(jī)，記錄設(shè)備運(yùn)行結(jié)束后的參數(shù)，根據(jù)性能參數(shù)標(biāo)準(zhǔn)評價設(shè)備性能是否符合使用要求。6.3.3.3

判斷標(biāo)準(zhǔn)儀器的各項性能參數(shù)在廠家聲明的正常范圍內(nèi)則驗證通過。6.3.4

數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)的性能驗證6.3.4.1

驗證要求對所有的檢測變異類型進(jìn)行驗證，驗證應(yīng)包括數(shù)據(jù)分析時所用到的所有硬件和軟件系統(tǒng)，涵蓋數(shù)據(jù)分析的所有步驟。6.3.4.2

驗證方案建議使用已知突變豐度的質(zhì)控品進(jìn)行測序分析，應(yīng)包含所有的檢測變異類型，如變異類型包含SNV，分析樣本至少應(yīng)含有同一位點(diǎn)的多個不同點(diǎn)突變的質(zhì)控品；如