微生物實驗放線菌

放線菌的分離純化、鑒別與培養(yǎng)實驗生物科學1101班第二小組引言

土壤是微生物的大本營，它所含微生物無論是數(shù)量還是種類都是極其豐富的，因此，土壤是微生物多樣性的重要場所，是發(fā)掘微生物的重要基地，可以從中分離、純化得到許多有價值的菌株。

放線菌廣泛分布在含水量較低，有機物較豐富和呈微堿性的土壤中，泥土所特有的泥腥味，主要是由放線菌產生的土腥味素所引起的，研究發(fā)現(xiàn)，駱駝尋找水源的主要線索就是嗅到土腥味素。每克土壤中放線菌的孢子數(shù)一般可達百萬左右。實驗目的

1、通過代表微生物放線菌的學習來掌握選育、分離純化和培養(yǎng)微生物等的基本操作技術。

2、深入了解放線菌的形態(tài)特征。

3、復習回顧微生物實驗的各種技術及方法（培養(yǎng)基的制備，消毒與滅菌，革蘭氏染色法，無菌操作技術等）。

實驗原理（結合《微生物學實驗》中實驗五《平板分離技術與活菌計數(shù)》）

1、菌體培養(yǎng)：選擇適合于待分離微生物的生長條件，如營養(yǎng)、酸堿度、溫度和氧等要求或加入某種抑制劑造成只利于該微生物的生長，而抑制其他微生物生長的環(huán)境，從而淘汰一些不需要的微生物。

馬丁氏培養(yǎng)基（PDA培養(yǎng)基）：培養(yǎng)真菌（加入青霉素和鏈霉素，制成抗細菌的雙抗培養(yǎng)基）高氏1號培養(yǎng)基：培養(yǎng)放線菌（加入10％酚數(shù)滴）

2、微生物的分離與純化：從雜菌混生的微生物群體中獲得只含有一種或某一株微生物的過程。

3、微生物在固體培養(yǎng)基上形成的單個菌落可以是由一個細胞繁殖而成的集合體，因此可通過挑取單菌落而獲得一種純培養(yǎng)。獲得單菌落的方法是平板分離法，此法主要有：①平板劃線分離法；②稀釋涂布平板法。后者除能分離純化微生物外，還可用于測定樣品中活菌數(shù)量。

4、放線菌主要是呈絲狀生長和以孢子繁殖的革蘭氏陽性細菌。實驗思路

將采集來的土壤樣品制成懸浮液，在懸浮液中獲取不同稀釋度的菌液，分別在高氏1號培養(yǎng)基上進行恒溫培養(yǎng)，待菌苔長出后，挑取少許菌苔觀察其形態(tài)，并將其細胞進行革蘭氏染色后用顯微鏡檢查是否為單一的微生物細胞，如若發(fā)現(xiàn)有雜菌，則須再次進行分離純化。實驗儀器和用具顯微鏡、擦鏡紙、雙層瓶、載玻片、蓋玻片、鑷子、無菌吸管、玻璃珠、無菌培養(yǎng)皿、恒溫培養(yǎng)箱等。實驗操作

1、稀釋涂布平板法⑴倒平板⑵制備土壤稀釋液⑶涂布取菌液0.1ml放入已寫好稀釋度的平板中，靜置5~10min，使菌液吸附近培養(yǎng)基，用無菌的玻璃涂布器將菌液先沿一條直線輕輕地來回推動，使均勻分布，然后改變方向沿另一垂直線來回推動，平板內邊緣處可改變方向用涂棒再涂布幾次。⑷培養(yǎng)放線菌、真菌，28℃培養(yǎng)3~5天；細菌，37℃培養(yǎng)2~3天⑸挑菌苔將培養(yǎng)后長出的單個菌落分別挑取少許細胞接種到培養(yǎng)基的斜面上，進行培養(yǎng)，待菌苔長出后，檢查其特征是否一致，同時將微生物細胞涂片染色后用顯微鏡檢查是否為單一的微生物，若發(fā)現(xiàn)雜菌，需再一次進行分離、純化，直到獲得純培養(yǎng)。2、平板劃線分離法（1）倒平板標明培養(yǎng)基名稱、土樣編號和實驗日期。（2）劃線用無菌的接種環(huán)挑取上述10-1倍的土壤懸液一環(huán)在平板上劃線。劃線的方法很多，但無論采取哪種方法，其目的都是通過劃線將樣品在平板上進行稀釋，培養(yǎng)后能形成單個菌落。本實驗采取四區(qū)劃線法。常見的幾種劃線方法⑶挑菌苔

將培養(yǎng)后長出的單個菌落分別挑取少許細胞接種到培養(yǎng)基的斜面上，培養(yǎng)，待菌苔長出后，檢查其特征是否一致，同時將微生物細胞涂片染色后用顯微鏡檢查是否為單一的微生物，若發(fā)現(xiàn)雜菌，需再一次進行分離、純化，直到獲得純培養(yǎng)。(4)革蘭氏染色鑒別

將挑出的菌苔進行革蘭氏染色，依次進行初染、媒染、脫色、復染后進行鏡檢，由于放線菌是革蘭氏陽性菌，所以染色后的菌體會呈現(xiàn)紅色。

脫色是革蘭氏染色是否成功的關鍵，脫色不夠造成假陽性，脫色過度造成假陰性色。所以要嚴格控制脫色的時間，保證染色成功。1、質地:致密、干燥、多皺、小而不蔓延、不易挑起，表面有放射狀溝紋。2、菌落表面呈干粉狀。3、菌體多產脂溶性或水溶性色素。放線菌形態(tài)觀察放線菌菌絲的各種形態(tài)插片法使放線菌沿培養(yǎng)基與蓋玻片交界處生長并附著于蓋玻片上。(5)利用插片法培養(yǎng)放線菌實驗注意事項

1、實驗要在嚴格的無菌環(huán)境下進行，以避免雜菌感染；

2、涂片時取菌量要適宜且要涂抹均勻，避免貪多造成菌體堆積而難以看清細胞個體形態(tài)。同時也應避免取菌量太少而難以在顯微鏡視野中找到細胞；

3、涂布均勻，培養(yǎng)后菌落在整個平板表面分散均勻；

4、平板劃線時要快速，接種針在平板上迅速滑動。s思考題1、放線菌與細菌菌落最顯著的差異是什么？2、為什么要在高氏1號培養(yǎng)基中加入10%的酚？解答1、答：放線菌菌落的特征是：小型、干燥、不透明、表面呈致密的絲絨狀，上有一薄層彩色的“干粉”；菌落和培養(yǎng)基的連接緊密，難以挑??；菌落的正反面