上海市臨檢中心 PCR培訓(xùn)班 非小細(xì)胞肺癌治療靶向基因檢測(cè)及質(zhì)控

上海交通大學(xué)附屬胸科醫(yī)院

張杰Mutations

ofSome

Driver

Genes

in

Never-smoking

Women

With

AdenocarcinomaKRAS1.92%PI3K1.92%P531.92%Unknow17.31%BRAF1.92%EML4-ALK8.65%EGFR66.35%T790M/

EGFR

Mut

=

5開(kāi)展項(xiàng)目

EGFR突變檢測(cè)：

EGFR

19-21外顯子序列突變檢測(cè)

EGFR拷貝數(shù)量改變檢測(cè)

K-ras

12-13外顯子序列突變檢測(cè)

ALK-EML4融合基因檢測(cè)免疫組化法FISH方法RT-PCR方法

B-raf突變檢測(cè)

ROS1突變檢測(cè)Exon

19

deletions

andL858Raccount

for

approximately

85%

ofEGFR

TKmutationsConfer

sensitivityorresistanceUncleareffect

onsensitivity

toEGFR

TKIsEGFRtranscripttoEGFR

TKIsL688PV689MP694XV700D18E709XExons

1–16I715SL718PS720XG719A/SG735SV738FV742ADeletionsL730FP733L1920T751IS752YExon

17E746KD761YD761NA763VN765AS768IT783AL792PL798FG810SD770_N771

insNPGT790MExons

18–24N826SL833VL858RH835LL838VT847I21H850NV851XL861XExons

25–28I853TA859TG863DA864TE866KRiely,

etal.ClinCancer

Res

2006;

Murray,

et

al.JThoracOncol2008EGFR突變檢測(cè)流程標(biāo)本采集及病理評(píng)估DNA抽提及質(zhì)控EGFR突變檢測(cè)ARMS測(cè)序法

其它方法檢測(cè)報(bào)告上海胸科醫(yī)院2163例肺癌EGFR檢測(cè)

腺癌1420

例236

例43

例陽(yáng)性率

60.1%

(854

/1420)陽(yáng)性率

17%

(40

/236)陽(yáng)性率

53.5%

(23

/43)陽(yáng)性率

18.5%

(10/

54)陽(yáng)性率

33.3%

(17

/51)陽(yáng)性率

46.3%（

163

/352

）

鱗癌

腺鱗癌

大細(xì)胞癌54例

低分化癌（NOS）

51

例

其它類型352

例檢測(cè)方法67.7%328/216315.2%84.8%48.6%1835/2163EGFR突變率60.2%53.5%33.3%17%18.5%腺癌鱗癌大細(xì)胞癌低分化癌腺鱗癌KRAS基因檢測(cè)腺癌

10/122腺癌且EGFR陰性10/488.2%20.8%肺癌個(gè)體化檢測(cè)質(zhì)量控制

檢測(cè)標(biāo)本

檢測(cè)方法及試劑

實(shí)驗(yàn)室要求及檢測(cè)人員資質(zhì)要求

檢測(cè)報(bào)告內(nèi)容及格式臨床標(biāo)本與研究標(biāo)本的差異其他分析前、分析后腫瘤細(xì)胞標(biāo)本類型標(biāo)本處理含量處理新鮮組織、蠟塊、穿刺

隨意性大，無(wú)組織、脫落細(xì)胞等固定方式、試劑、標(biāo)本離體時(shí)間各異實(shí)際臨床標(biāo)本不定嚴(yán)格要求要求統(tǒng)一，被

統(tǒng)一的保存以病理所確認(rèn)

及運(yùn)送條件研究標(biāo)本統(tǒng)一要求盡量統(tǒng)一標(biāo)本是獲得高質(zhì)量檢測(cè)結(jié)果的重要前提

標(biāo)本來(lái)源標(biāo)本相關(guān)問(wèn)題

標(biāo)本異質(zhì)性

手術(shù)切除標(biāo)本

氣管鏡活檢標(biāo)本

經(jīng)皮穿刺標(biāo)本

標(biāo)本類型

標(biāo)本的收集和儲(chǔ)存

淋巴結(jié)穿刺標(biāo)本

胸水/心包

細(xì)胞學(xué)標(biāo)本

血清DNA標(biāo)本及循環(huán)細(xì)胞取樣中存在的問(wèn)題

腫瘤的位置

腫瘤生長(zhǎng)的部位有時(shí)難以進(jìn)行內(nèi)科穿刺活檢，需要依靠外科手術(shù)活檢取材

細(xì)針穿刺時(shí)使用的器材尺寸可能影響細(xì)胞的獲取量及DNA的質(zhì)量

由于無(wú)法保證每次都能取得足夠的標(biāo)本，需要一些適用于小標(biāo)本的檢測(cè)方法標(biāo)本的獲取

腫瘤標(biāo)本獲取的主要途徑支氣管鏡(活檢：中央型)手術(shù)(切除/切取)穿刺(活檢：周圍型)

以臨床醫(yī)生認(rèn)為最容易獲取的方式

原發(fā)病灶

/

轉(zhuǎn)移灶腫瘤組織制備蠟塊

切片

HE染色

確認(rèn)癌細(xì)胞

胸水等肺癌的活檢標(biāo)本通常僅含有少量腫瘤細(xì)胞經(jīng)支氣管肺活檢CT引導(dǎo)穿刺腫瘤

<正常細(xì)胞的5%標(biāo)本處理

：?

離體后處理：及時(shí)切開(kāi)、固定(盡快)?

固定液：10%中性福爾馬林(pH≈7.0)(不推薦使用任何其它溶液)?

固定液量：

≥10倍體積?

固定時(shí)間：6~48小時(shí)適宜的切片：?

HE片確認(rèn)*，癌細(xì)胞數(shù)≥200個(gè)

(不推薦依經(jīng)驗(yàn)盲取)?

常規(guī)切片(4~5μm厚，普通載玻片)?

連續(xù)切片8~10張?

刀片：一次性(不推薦交叉使用)如何獲取優(yōu)質(zhì)的標(biāo)本：標(biāo)本類型

石蠟組織：盡可能送檢一年內(nèi)的石蠟標(biāo)本

石蠟切片：含腫瘤細(xì)胞越多越好(50%以上)；組織部位面積約6mmx6mm以上

包埋組織：組織塊不小于0.5×0.5×0.5(cm)

新鮮組織：比石蠟等處理過(guò)的舊組織，DNA保存得更完整，對(duì)PCR實(shí)驗(yàn)更有利，但一定要經(jīng)病理學(xué)確認(rèn)

含有腫瘤組織50%以上；重量≥10ｍg(約米粒大小以上)，經(jīng)PBS或生理鹽水沖洗干凈

取癌組織的中心位置組織塊(避開(kāi)壞死區(qū)域)，固定于10%中性福爾馬林溶液中，盡快送病理科如何獲取優(yōu)質(zhì)的標(biāo)本：標(biāo)本類型

盡可能取得大標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)

臨床常用的取樣方法取得標(biāo)本量通常較少

內(nèi)鏡活檢、穿刺活檢、細(xì)胞學(xué)標(biāo)本(支氣管刷檢,細(xì)針穿刺)

小標(biāo)本檢測(cè)失敗率

53–66%(內(nèi)鏡活檢與穿刺活檢)，而切除活檢標(biāo)本的失敗率僅24%

標(biāo)本中腫瘤細(xì)胞的含量也十分重要

組織標(biāo)本富集

細(xì)胞學(xué)標(biāo)本富集

直接測(cè)序要求使用腫瘤細(xì)胞含量較高(50–70%)的標(biāo)本EberhardDA,etal.JClinOncol2008;26:983-984.如何獲取優(yōu)質(zhì)的標(biāo)本：標(biāo)本異質(zhì)性

分子水平的肺癌細(xì)胞存在異質(zhì)性

腫瘤內(nèi)異質(zhì)性

原發(fā)部位與轉(zhuǎn)移部位的異質(zhì)性

腫瘤異質(zhì)性可能影響研究結(jié)果

如果可行，至少取得3個(gè)代表性部位的標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)EberhardDA,etal.JClinOncol2008;26:983-984.分子檢測(cè)與靶向治療的關(guān)鍵步驟臨床采集合適的組織標(biāo)本123選擇合適的檢測(cè)方法根據(jù)結(jié)果制定治療方案基因突變檢測(cè)影響因素---方法學(xué)因素ARMS

&PNA-LNAclampPCR/HRMA/dHPLCNested

PCR/SequencingPyroSequencingPCR/SURVEYORPCR/SequencingME-PCR/

SequencingPCR/RFLPTaqManqPCR:Real-timeDetectionqPCR:Real-timeDetection12PCRPCRPCRPCRPCRPCRPCRRFLPPCROOOOOOSURVEYORcleavageHetero-duplex1%~10%Clean-upClean-upPCRRFLPOOPyro-sequencingRxnOOOCapillaryElectro-OOOElectro-phoresisSizingdHPLCSizingSequencing345Clean-upRxnphoresisOOOOOSequencingRxnConfirmationbysequencingConfirmationbysequencingConfirmationbysequencing~10%Clean-upClean-upOOOCapillarySequencingSequencing3-10%10%3-12%Clean-upRxnOO20~30%CapillarySequencing67Clean-upO20~30%O=產(chǎn)物轉(zhuǎn)移/加入試劑/開(kāi)管操作CapillarySequencing<1%ARMS

vs.DNA測(cè)序結(jié)果成功率可分析檢出率共計(jì)不可分析突變

無(wú)突變ScorpionsARMS**42

400

51.2%

100%

82例24

30.5%

70.7%

82例直接測(cè)序***

25

33*

肺癌手術(shù)石蠟切片標(biāo)本檢測(cè)EGFR基因突變**IPASS方法學(xué)***INTEREST方法學(xué)中華病理學(xué)雜志

2008;37(5):294-9.ARMSvs.DNA測(cè)序測(cè)序法ARMS1%敏感度25%石蠟組織標(biāo)本成功率低高商用試劑盒流程與速度數(shù)據(jù)分析要求試劑成本無(wú)復(fù)雜/慢高有簡(jiǎn)單/快低相對(duì)低高相對(duì)高儀器成本低1.DacicS.AdvAnatPathol2008;15(4):241-247.2.中國(guó)非小細(xì)胞肺癌患者表皮生長(zhǎng)因子受體基因突變檢測(cè)專家組.中華病理學(xué)雜志

2011;40(10):700-702.EGFR基因突變檢測(cè)方法的選擇優(yōu)化檢測(cè)途徑，最大限度提高檢測(cè)敏感性、降低假陽(yáng)性和假陰性率以獲得可靠的檢測(cè)結(jié)果對(duì)每個(gè)患者來(lái)說(shuō)都至關(guān)重要

DNA測(cè)序在部分地區(qū)仍然是EGFR檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)

其他方法，比如ARMS可能比直接測(cè)序更敏感，目前已被廣泛應(yīng)用

新的EGFR基因檢測(cè)方法層出不窮，其檢驗(yàn)效能有待進(jìn)一步考證NCCN指南建議NSCLC患者檢測(cè)ALK30ALK陽(yáng)性NSCLC總患者數(shù)約為HER2陽(yáng)性乳腺癌患者的70%，CML患者的3倍多EGFR陽(yáng)性肺癌（新發(fā)病數(shù)）208923例ALK陽(yáng)性肺癌（新發(fā)病數(shù)）34820例其他驅(qū)動(dòng)突變腫瘤的每年發(fā)病數(shù)乳腺癌

HER2陽(yáng)性患者49,631例CML10,000例左右ALK陽(yáng)性腫瘤患者34,820例中國(guó)腫瘤登記年報(bào)，2012臨床&病理特征：ALK融合

vsEGFR突變特征EGFR腺癌

TTF1+非粘液型不吸煙東亞EML4/ALK腺癌TTF1+粘液型組織學(xué)亞型吸煙狀態(tài)人種不吸煙所有人種52y發(fā)病年齡性別66y女性男>女與EGFR突變?nèi)巳合啾?，ALK融合人群年齡更輕Signal

pattern

ofVysis

ALK

Break

ApartFISH

KitFISH診斷橘紅色與綠色探針相互臨近或粘合：ALK陰性橘紅色與綠色探針相互分離或單個(gè)橘紅色探針：ALK陽(yáng)性熒光原位雜交技術(shù)（FISH）1.

FISH技術(shù)是美國(guó)藥物臨床試驗(yàn)中所采用的檢測(cè)方法。2.

采用“分離”分析，基因倒位和ALK重排后，紅色和綠色探針?lè)珠_(kāi)3.

≥15%的樣本細(xì)胞中呈現(xiàn)分開(kāi)的紅色和綠色信號(hào)表示陽(yáng)性結(jié)果1野生型ALK重排36ALK

FISH檢測(cè)正常分裂丟失IHC用于檢測(cè)ALK表達(dá)

采用高靈敏度的檢測(cè)系統(tǒng)后，有越來(lái)越多的數(shù)據(jù)支持使用IHC作為初步篩查

靈敏度和特異度都可達(dá)到很高水準(zhǔn)。

與FISH相比，IHC是一種更常規(guī)的技術(shù)，成本更低，且工作強(qiáng)度也更低ALK

IHCFISH患者1：IHC顯示ALK強(qiáng)表達(dá)，F(xiàn)ISH顯示重排患者2：IHC顯示無(wú)ALK表達(dá)，F(xiàn)ISH顯示無(wú)重排Mino-Kenudson

et

al.,

ClinCancer

Res2010;16:1561–1571.38Ventana

IHC試劑設(shè)計(jì)ALK融合蛋白:OptiviewAmplification

KitOptiview

DABIHC

Detection?

無(wú)ALK重排的NSCLC不表達(dá)ALK融合蛋D5F3

rabbittmonoclonalantibody白?

部分ALK融合蛋白表達(dá)較低Ventana

IHC的原理:?

使用具有高度敏感性和特異性的一抗——D5F3?

全自動(dòng)儀操作，充分保證特異性?

獨(dú)有Optiview擴(kuò)增技術(shù)，充分保證敏感性FISH陽(yáng)性標(biāo)本使用IHC檢測(cè)全自動(dòng)VentanaIHC：信號(hào)擴(kuò)增常規(guī)IHC：無(wú)信號(hào)擴(kuò)增ALK-positive

NSCLC

byVysis

FISHandVentanaALKIHCD5F3rabbit

mAb

Controlrabbit

mAbALK

(+)

病例40腺癌伴有粘液分泌Vetana公司ALK抗體結(jié)果高分化腺癌有ALK表達(dá)8.8%5.7%91.2%檢測(cè)方法比較

FISH:判讀的主觀性較強(qiáng)，檢測(cè)證據(jù)難以存留。

Realtime

PCR:小樣本RNA提取質(zhì)與量難以保證。

根據(jù)標(biāo)本的類型合理選擇“免疫組化+Realtime

PCR”或“免疫組化+

FISH”

。2013年NCCN指南建議NSCLC患者檢測(cè)ROS1

基因融合IfROS1

mutationstatus

isknownand

positive,maytreat

with

crizotinib.基因融合檢測(cè)方法

熒光原位雜交技術(shù)（FISH）

免疫組織化學(xué)（IHC）

實(shí)時(shí)逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（實(shí)時(shí)RT-PCR）熒光原位雜交技術(shù)（FISH）采用“分離”探針?lè)治?，ROS1

基因融合后，紅色和綠色探針?lè)珠_(kāi)野生型ROS1基因融合陽(yáng)性

有5-11%出現(xiàn)假陽(yáng)性信號(hào)分離1，2，3

信號(hào)分離微弱，結(jié)果難以判斷3

主觀性強(qiáng)，受人為因素影響大

工作強(qiáng)度大，費(fèi)時(shí)1.

VarellaGarcia

etal.,IASLC

2011;

Abs

#MTE36.12.Camidge

et

al.,

ClinCancer

Res

2010;

16:5581-55903.

Sai-Hong

，DrugDesign,Development

and

Therapy

2011,5:471-485ROS1檢測(cè)

ROS1

是胰島素受體家族的一種受體酪氨酸激酶；

ROS1

基因融合發(fā)生頻率與檢測(cè)方法/檢測(cè)群體相關(guān)；

ROS1

基因融合主要發(fā)生于年輕、非吸煙、腺癌患者；

ROS1

基因融合病人對(duì)crizotinib敏感；

ROS1

融合狀態(tài)可通過(guò)實(shí)時(shí)RT-PCR方法實(shí)現(xiàn)檢測(cè)。FFPE質(zhì)量要求FFPE

樣本30%tumorcells5-10μM厚度的切片RNA提取RNA質(zhì)量影響因素

組織離體到固定包埋的時(shí)間越短越好.

使用10%的中性福爾馬林溶液

控制合適的組織厚度、福爾馬林用量和固定時(shí)間.

組織包埋前應(yīng)完全脫水，且包埋時(shí)使用低熔點(diǎn)石蠟

建議4℃保存FFPE樣品固定時(shí)間對(duì)RNA完整度的影響

固定時(shí)間越長(zhǎng)，長(zhǎng)片段核酸擴(kuò)增效率越差PLoS

One.2007Dec

5;2(12):e1261固定過(guò)程中樣品大小對(duì)RNA完整性的影響

固定組織樣本越大，RNA完整性越差PLoS

One.2007Dec

5;2(12):e1261不同保存溫度對(duì)FFPE樣品RNA完整性的影響FFPE樣品保存溫度越高，RNA完整性越差PLoS

One.2007Dec

5;2(12):e1261RT-PCR檢測(cè)關(guān)鍵要素小結(jié)

確保樣本中有至少30%的腫瘤細(xì)胞

需要5片的5-10

uMFFPE樣本，太薄或太厚均不合適

RNA比DNA更敏感，樣本正確的固定、包埋和保存對(duì)于RNA的質(zhì)量起著非常重要的影響。

高質(zhì)量的FFPE樣本RNA提取試劑盒

PCR擴(kuò)增子片段大小PCRampliconlengthFragmentation

ofRNA分子靶向基因檢測(cè)質(zhì)量問(wèn)題

實(shí)驗(yàn)室：

達(dá)標(biāo)

人員資質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)化檢測(cè)人員上崗培訓(xùn)、上崗證書(shū)報(bào)告簽發(fā)人員資質(zhì)、分子病理醫(yī)師實(shí)驗(yàn)條件；檢測(cè)方法：方法越是靈敏，抗污染的問(wèn)題越是突出標(biāo)本來(lái)源：不同的標(biāo)本，應(yīng)相對(duì)采用不同的檢測(cè)方法分子病理實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量要求

二.

PCR實(shí)驗(yàn)室要達(dá)標(biāo)，通過(guò)國(guó)家驗(yàn)證

檢測(cè)結(jié)果要做室間比對(duì)

國(guó)際間的室間比對(duì)

(

EMQN,

ESP,

ETOP

andESMO)

分子病理實(shí)驗(yàn)室要通過(guò)ISO15189認(rèn)可關(guān)于EGFR突變檢測(cè)共識(shí)（中華病理學(xué)雜志

2011年10期）

關(guān)于EGFR檢測(cè)時(shí)間

活檢：1小時(shí)內(nèi)送病理科

及時(shí)固定于4%中性甲醛中

小標(biāo)本6-12h

大標(biāo)本6-48h

病理報(bào)告3個(gè)工作日（包括免疫組化）

EGFR5-7個(gè)工作日

總共10個(gè)工作日，完成全部診斷和檢測(cè)工作關(guān)于EGFR突變檢測(cè)共識(shí)

DNA提?。篜