化妝品舒緩功效-斑馬魚胚胎中性粒細胞測試方法（征求意見稿）

ICS：71.100.70Y40T/HPCIA00X-2022化妝品舒緩功效-斑馬魚胚胎中性粒細胞測試

方法SoothingEfficacyofCosmetics-ZebrafishNeutrophilTestMethod（征求意見稿）2023-XX-XX發(fā)布2023-XX-XX發(fā)布2023-XX-XX實施廣州開發(fā)區(qū)黃埔化妝品產(chǎn)業(yè)協(xié)會發(fā)布#前言TOC\o"1-5"\h\z范圍 3\o"CurrentDocument"規(guī)范性引用文件 3\o"CurrentDocument"術語和定義 3原理 3儀器設備 3\o"CurrentDocument"主要試劑及耗材 4實驗方法 ] 5受試物準備 ;：????，； 6測試步驟 廳 6結(jié)果計算 N 7\o"CurrentDocument"測試有效性驗證 二 7結(jié)果相關性解讀??…'g ，? 7結(jié)果報告?…二 :. 7附錄A（資料性附錄）??…土 ?' 尹 9附錄B（資料性附錄） ?盤2 子 10參考文獻 11r/ —冃IJ 言本文件按照GB/T1.1-2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》規(guī)則起草。本文件由廣東省開發(fā)區(qū)黃埔化妝品產(chǎn)業(yè)協(xié)會提出。本標準由廣州開發(fā)區(qū)黃埔化妝品產(chǎn)業(yè)協(xié)會歸口。本標準起草單位：本標準主要起草人：化妝品舒緩功效一斑馬魚胚胎中性粒細胞測試方法1范圍本文件規(guī)定了斑馬魚胚胎中性粒細胞測試方法的基本要求。本文件提供一種化妝品舒緩功效的斑馬魚生物評估方法，適用于測試通過有效抑制中性粒細胞聚集而達到舒緩效果的原料及配方的功效評價。2規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應用是必不可少的。凡是注明日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件，凡未注明日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和測試方法DB32/T3979-2021實驗用斑馬魚飼育技術條件OECDTG236-2013化學品測試規(guī)范斑馬魚胚胎急性毒性測試ISO15088-2017污水對斑馬魚胚胎的主性毒性測試3術語和定義下列術語及定義適合于本文件。3.1斑馬魚胚胎Zebrafishembryo處在依靠卵黃提供能量發(fā)育階段的斑馬魚胚胎。3.2沒有心跳Lackofheartbeat一分鐘內(nèi)心臟沒有跳動的魚胚胎。3.310%致死濃度10%LethaIconcentration,LC10受試物導致10%受試魚胚胎死亡的濃度。魚胚胎沒有心跳則判定為死亡。4原理皮膚在收到刺激或病菌入侵時，會產(chǎn)生免疫反應，會出現(xiàn)紅腫、瘙癢等不適，表現(xiàn)出敏感肌征兆。其中，中性粒細胞是最主要的免疫白細胞，作用于吞噬和清除皮膚中的感染或有害物質(zhì)。而斑馬魚胚胎的中性粒細胞和人體中性粒細胞在形態(tài)、生化和生理功能上高度相似，因此斑馬魚測試結(jié)果對人體皮膚功效具有很好的可推導性。應用硫酸銅誘導斑馬魚胚胎側(cè)線區(qū)域神經(jīng)丘細胞損傷而引起中性粒細胞聚集的模型進行測試，比較受試物處理組和模型對照組的魚胚胎側(cè)線區(qū)域的中性粒細胞的數(shù)量變化,計算中性粒細胞抑制率以評價原料、配方或產(chǎn)品的舒緩功效。5儀器和設備5.1斑馬魚養(yǎng)殖設備設備需配有溫控裝置，水循環(huán)和過濾裝置，養(yǎng)殖容器用玻璃或常見食品級PC材質(zhì)制成?？刹捎猛ㄓ冒唏R魚養(yǎng)殖設備或按實驗室需求配備魚缸（如長寬高45cmX45cmX30cm）。5.2產(chǎn)卵盒/缸由玻璃、不銹鋼或其它惰性材料制成，配備網(wǎng)篩（網(wǎng)格大小為2mmX2mm,由不銹鋼或多項材料組成用來保護魚卵）。5.3水質(zhì)監(jiān)測設備pH計、溶解氧測定儀、鹽度計（電導率測定儀）。5.4分析天平精度0.Img。5.5顯微鏡配帶照相系統(tǒng)，最大放大倍數(shù)應大于80倍的體式顯微鏡。方法A中顯微鏡需配帶綠色熒光。5.6測試容器測試容器：玻璃或聚苯乙烯測試容器（如96-孔板，培養(yǎng)皿）。如測試物可能吸附于聚苯乙烯容器時（如非極性化學品），應選用惰性材料（如玻璃）來減少吸附。5.7恒溫箱精度±l°Co5.8豐年蝦孵化器設備需配有孵化桶，氣管，氣量調(diào)節(jié)閥，氣泵截止開關和止逆閥裝置。9其他常規(guī)測試儀器和設備移液管、離心管、玻璃容器（如燒杯、容量瓶等）、旋渦混合紘超聲水拾鍋、離心機、低溫冰箱、可調(diào)節(jié)移液器和吸頭。6主要試劑與耗材1水符合GB/T6682規(guī)定。6.2甲醇、二甲基亞硯、乙醇等助溶劑分析純級別。6.3親魚養(yǎng)殖用水稱取4g海鹽溶于10L水配制而成，鹽度為0.25-0.50%。，電導率為500?800卩S/cm,溶解氧＞80%飽和度，pH值6.5?8.5,硬度30?300mg/L（以碳酸鈣計）。6.4豐年蝦（Artemiasalina）卵豐年蝦休眠卵需干燥避光冷藏。稱取約15g海鹽溶于1L水配制豐年蝦卵孵化水，密度以不超過4g/L豐年蝦卵為宜。6.5魚胚胎培養(yǎng)液稱取2940mg無水氯化鈣，1233mg七水硫酸鎂，630mg碳酸氫鈉，55mg氯化鉀溶于10L水配制而成。pH值6.5?8.5?；瘜W品均為分析純級別。采用B法測試需要準備下列6.6-6.14試劑。6.6硫酸銅溶液用水配制160mg/L五水硫酸銅（CuSO4-5H2O）儲存液。室溫儲存。工作液濃度為0.16mg/L,用魚胚胎培養(yǎng)液稀釋，使用前新鮮配制。6.7吲哚美辛溶液用二甲基亞硯配制36mg/L哼噪美辛儲存液。冷藏。工作液濃度為0.0036mg/L哼噪美辛，用魚胚胎培養(yǎng)液稀釋，使用前新鮮配制。6.8多聚甲醛用磷酸緩沖鹽溶液（PBS）配制含有4%多聚甲醛和0.8%氫氧化鈉（NA0H）,pH為7.2?7.4的溶液。冷臧。6.950%和70%酒精溶液用水配制50%和70%酒精溶液。6.10蘇丹黑染色液蘇丹黑儲存液：用70%酒精配制0.4%蘇丹黑儲存液。冷藏。苯酚溶液：將8g苯酚溶節(jié)15mL乙醇溶液，將0.3gM^04-12H20溶解于50mL水中，然后將二種溶液混合配制成苯酚溶液。室溫儲存，半年內(nèi)有效。蘇丹黑染色液是將900皿70%酒精溶液，100皿蘇丹黑儲存液和1應苯酚溶液混合而成。用前新鮮配制。6.11PBST配制0.04%TritonXT00于PBS溶液中。室溫儲存。6.12漂白溶液用水配制含有3%H202和1%K0H的溶液。使用前新鮮配制。6.13清透液1用水配制含有20%甘油和0.25%K0H的溶液。室溫保存。6.14清透液2用水配制含有50%甘油和0.25%KOH的溶液。室溫保存。7實驗方法7.1受試生物A法應用中性粒細胞熒光標記斑馬魚（Daniorerio）（如：mpo,lyz,mpegl等品系）產(chǎn)卵測試。B法應用中性粒細胞熒光標記斑馬魚（Daniorerio），也可以應用來源可靠（如中國國家斑馬魚資源中心）的野生型AB品系斑馬魚（Daniorerio）產(chǎn)卵測試。親魚應具有較好的繁殖能力-魚齡以6-12月最佳。傳代盡量使用側(cè)交以保持遺傳多樣性，純品系親魚繁殖5代后需更換新一批親魚。親魚不應該有明顯可見的感染和疾病特征，且在2個月內(nèi)沒有經(jīng)歷過藥物治療。在繁殖產(chǎn)卵測試前，親魚應在引入實驗室后馴養(yǎng)14天以上。7.2養(yǎng)殖要求7.2.1養(yǎng)殖水溫宜控制在26-28.5°C,室內(nèi)溫度建議控制在20~25°Co2.2養(yǎng)殖密度宜控制在每升水1?2條魚，以及每日固定的12?16h光照，且需保持良好的過濾系統(tǒng)。7.2.3每天至少喂食2次，包括至少1次豐年蝦（Artemiasalina'）幼蟲，喂食間隔在3小時以上，避免過量喂食影響水質(zhì)和清潔度。3產(chǎn)卵要求7.3.1如用產(chǎn)卵缸收集魚卵，將雄魚和雌夢以2：1的比率為宜在產(chǎn)卵前一天關燈前1?2h放進產(chǎn)卵缸中。由于斑馬魚偶爾不產(chǎn)卵，建議同時準備多個產(chǎn)卵缸備用。7.3.2為避免基因偏差，將最少3個產(chǎn)卵缸中收集的魚卵混合再進行挑選備用。若用養(yǎng)殖魚缸收集魚卵,收卵盒在產(chǎn)卵前一天關燈前或產(chǎn)卵當天開燈前放進要收集魚卵的養(yǎng)殖魚缸中。7.3.3為避免魚卵被成魚所食，收卵盒用惰性網(wǎng)覆蓋。7.3.4交配、產(chǎn)卵和受精在開燈后大約30min內(nèi)完成，屆時可把收卵盒移出魚缸。7.3.5魚卵從收卵盒取出后，建議用魚胚胎培養(yǎng)液清潔魚胚胎。7.3.6挑選健康的斑馬魚胚胎；并以200應魚胚胎培養(yǎng)液爭不超過1尾魚胚胎的密度于28+TC培養(yǎng)至受精后2天。8受試物準備1化妝品原料1.1水溶性原料：可用魚胚胎培養(yǎng)液直接將受試物溶解配制成測試溶液。8.1.2非水溶性原料：可選常用溶劑如甲醇、二甲基亞硯、乙醇等助溶。如將受試物和有機溶劑按1：1（重量g：體積mL）混勻，超聲處理lOmin,然后加入魚胚胎培養(yǎng)液配制成所需濃度，震蕩30s后于6500xg離心lOmin。取上清液進行測試。8.2化妝品產(chǎn)品8.2.1水溶性產(chǎn)品：可用魚胚胎培養(yǎng)液直接將受試物溶解配制成測試溶液。建議最高測試濃度為5g/L。8.2.2非水溶性產(chǎn)品：可選常用溶劑如甲醇、二甲基亞硯、乙醇等助溶。如將受試物和有機溶劑按1：1（重量g：體積mL）混勻，超聲處理1Omin,然后加入魚胚胎培養(yǎng)液配制成所需濃度，震蕩30s后于6500xg離心10min。取上清液進行測試。8.3注意事項受試物測試溶液需測試前新鮮配制。測試濃度需保證對斑馬魚的死亡率＜10%（沒有心跳特征的胚胎界定為死亡）。測試時可根據(jù)需要設置多個濃度組。9測試步驟以下測試步驟是3cm培養(yǎng)皿測試指引。測試流程可參見附錄A圖A.挑選健康的受精后3天大的斑馬魚。9.1測試分組測試需設定模型對照組（硫酸銅工作液）、陽性對照組（硫酸銅工作液+吲味美辛工作液）和受試物組（硫酸銅工作液+受試物）。9.2模型對照組設置隨機挑選24尾魚胚胎于3cm培養(yǎng)皿中，加入5mL含0.16mg/L五水硫酸銅的魚胚胎培養(yǎng)液。9.3陽性對照組設置隨機挑選24尾魚胚于3cm培養(yǎng)皿中，加入5mL含0.16mg/L五水硫酸銅和0.0036mg/LH引噪美辛的魚胚胎培養(yǎng)液。9.4受試物處理隨機挑選24尾魚胚于3cm培養(yǎng)皿中，加入5mL含0.16mg/L五水硫酸銅和受試物的魚胚胎培養(yǎng)液。放置于28±1°C恒溫箱中培養(yǎng)40?4象寸n。應用中性粒細胞熒光標記斑馬魚9.5樣本的顯微分析將魚胚胎使用三部溶液麻醉，側(cè)身擺放。然后放到熒光顯微鏡下對魚胚胎尾部鏡下按統(tǒng)一的拍照參數(shù)進行拍照。9.6數(shù)據(jù)分析計數(shù)每尾魚胚胎從肛門起四分之三尾部側(cè)線區(qū)域（見附錄B圖B）的中性粒細胞數(shù)目。10結(jié)果計算計算中性粒細胞聚集抑制率：■C—T抑制率=x100% （1）（1）式中：T一受試物處理組魚胚胎中性粒細胞數(shù)目的平均值；C一模型對照組魚胚胎中性粒細胞數(shù)目的平均值。對受試物處理組中性粒細胞數(shù)目和空白對照組中性粒細胞數(shù)目進行雙尾T檢驗，取得，值。11測試有效性驗證11.1測試判定各測試組暴露完成后至少90%魚胚胎存活，否則對應測試組結(jié)果無效。

11.2測試要求每批次測試須設置陽性對照組，陽性對照組魚胚胎中性粒細胞聚集抑制率為正數(shù)且人〈0.05。12結(jié)果報告12.1ROS清除率受試物在對應測試濃度下對中性粒細胞的聚集抑制率。12.2評價評價受試物抑制中性粒細胞聚集的能力，分析受試物處理組與模型對照組的檢測值是否具有統(tǒng)計學差異（p〈0.05）。1313結(jié)果相關性解讀在中性粒細胞聚集抑制率為正數(shù)且具有統(tǒng)計學差異（芯0.05）情況下，測試結(jié)果可作為受試物具有舒緩功效的支持證據(jù)，支持舒緩功效宣稱。附錄A（資料性附錄）圖A.測試流程圖3天大斑馬魚卵照片分析、中性28±1C暴露40-45min魚胚胎固定蘇丹黑染色、漂白顯微鏡拍照、粒細胞抑制率計算顯微鏡拍照、照片分析、中性粒細胞抑制率計算圖A.化妝品舒緩功效斑馬魚胚胎中性粒細胞聚集抑制測試流程圖附錄B（資料性附錄）圖B.測試結(jié)束時斑馬魚胚胎拍照圖示*紅色熒光點即為中性粒細胞（A法）。*深色點即為染色的中性粒細胞（B法）。

圖B:斑馬魚胚胎尾部中性粒細胞計數(shù)區(qū)域。參考文獻OECD.TestNo.236:FishEmbryoAcuteToxicity(FET)Test[S],OECDGuidelinesfortheTestingofChemicals,Section2,OECDPublishing,Paris,2003.T/SHRH036-2021化妝品黑色素抑制-斑馬魚胚胎測試方法[S]。T/GDST1-2021斑馬魚胚胎急性毒性測試A法和B法[S]。deOliveiraS,Reyes-AldasoroCC,CandelS,RenshawSA,MuleroV,&CaladoA.Cxcl8(IL-8)mediatesneutrophilrecruitmentandbehaviorinthezebrafishinflammatoryresponse[J].JImmunol.2013,190(8):4349-4359.HasegawaT,HallCJ,CrosierPS,AbeG,KawakamiK,KudoA,&KawakamiA.TraisientinHmmatoyresponsemediatedbyinterleukin-16isrequiredforproperregenerationinzebrafishfinfcld[J].Elife.2017?6:e22716.Heny Lo四esCA,貝eMK,&RenshawSA.Zebrafishasamodelforthestudyofneutiophilbiol