海藻糖酶試劑盒說明書

貨號(hào)：MS2606 規(guī)格：100管/48樣海藻糖酶（Trehalase,THL）試劑盒說明書微量法正式測(cè)定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定測(cè)定意義：THL（EC3.2.1.28）廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中。海藻糖酶主要功能在于生物體分解海藻糖生成葡萄糖而直接用于能量供應(yīng)。測(cè)定原理：采用3,5-二硝基水楊酸法測(cè)定THL催化海藻糖產(chǎn)生的還原糖的含量。還原糖與3,5一二硝基水楊酸共熱生成棕紅色的氨基化合物，在一定范圍內(nèi)還原糖的量和反應(yīng)液的顏色深度成正比，由此判斷THL活性的高低。自備實(shí)驗(yàn)用品及儀器：可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、水浴鍋、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水。試劑的組成和配制：提取液：液體100mLX1瓶，4°C保存；試劑一：液體7mLX1瓶,4C保存；試劑二：粉劑X1支，4C保存，用時(shí)加入1mL試劑一，充分溶解待用；用不完的試劑4C保存；試劑三：液體10mLX1瓶，4C保存；試劑四：液體10mLX1瓶，常溫避光保存；樣品測(cè)定的準(zhǔn)備：1、 細(xì)菌或細(xì)胞的處理：收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（104個(gè)）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL提取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率20%或200W，超聲3S，間隔10S，重復(fù)30次）；8000g，4C離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。2、 組織的處理：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積（mL）為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），冰浴中勻漿。8000g，4C離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。3、 血清（漿）的處理：按照血清（漿）體積（mL）:提取液體積（mL）為1：5~10的比例（建議取0.1mL血清（漿）加入1mL提取液），冰浴中勻漿。8000g，4C離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。測(cè)定步驟：1、 分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至550nm，蒸餾水調(diào)零。2、 調(diào)節(jié)水浴鍋至95度。3、 加樣表（在EP管中依次加入下列試劑）：試劑名稱（mL）對(duì)照管測(cè)定管樣本4040試劑一7050物)或25C(其它物種)水浴，準(zhǔn)確反應(yīng)10min試劑三9595試劑四9595試劑二20試劑二207°C(哺乳動(dòng)混勻，95C水浴5min(蓋緊，以防止水分散失)，冷卻后，取200pL至微量石英比色皿或96孔板中分別測(cè)定550nm處測(cè)定管和對(duì)照管吸光值。計(jì)算△A=A測(cè)定管-A對(duì)照管。每個(gè)測(cè)定管需設(shè)一個(gè)對(duì)照管。THL活力計(jì)算：用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下1、 標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定回歸方程為y=1.311x-0.6264；x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度(mg/mL)，y為吸光值。2、 按照蛋白濃度計(jì)算單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生川g葡萄糖定義為一個(gè)酶活力單位。THL活力(pg/min/mgprot)=[1000X(△A+0.6264)：1.311XV1]：(V1XCpr)：T=76X(△A+0.6264):Cpr。3、 按樣本鮮重計(jì)算單位的定義：每g組織每分鐘催化產(chǎn)生1pg葡萄糖定義為一個(gè)酶活力單位。THL活力(pg/min/g鮮重)=[1000X(△A+0.6264)-F1.311XV1]^(WXV1：V2)-FT=76X(AA+0.6264)：W。4、 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算單位的定義：每1萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘催化產(chǎn)生1pg葡萄糖定義為一個(gè)酶活力單位。THL活力(pg/min/104cell)=[1000X(△A+0.6264)：1.311XV1]：(500XV1：V2)-FT=0.152X(AA+0.6264)5、 按血清(漿)體積計(jì)算單位的定義：每mL血清(漿)每分鐘催化產(chǎn)生1pg葡萄糖定義為一個(gè)酶活力單位。THL活力(pg/min/mL)=[1000X(△A+0.6264)：1.311XV1]：(V3XV1：V2)-FT=760X(AA+0.6264)。1000：1mg/mL=1000Pg/mL；V1：加入樣本體積：0.04mL；V2：加入提取液體積，1mL；V3：加入血清(漿)體積，0.1mL；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500萬；T：反應(yīng)時(shí)間，10min；用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下1、 標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定回歸方程為y=0.6555x-0.6264；x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度(mg/mL)，y為吸光值。2、 按照蛋白濃度計(jì)算單位的定義：每mg組織蛋白在每分鐘催化產(chǎn)生1pg葡萄糖定義為一個(gè)酶活力單位。THL 活 力 (pg/min/mgprot)=[1000X(△A+0.6264)-F0.6555XV1]:(V1XCpr)-FT=152X(AA+0.6264):Cpr。3、 按樣本鮮重計(jì)算單位的定義：每g組織每分鐘催化產(chǎn)生1pg葡萄糖定義為一個(gè)酶活力單位。THL活力(pg/min/g鮮重)=[1000X(△A+0.6264)：0.6555XV1]：(WXV1：V2):T=152X(AA+0.6264)：W。4、 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算單位的定義：每1萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘催化產(chǎn)生川g葡萄糖定義為一個(gè)酶活力單位。THL活力(^g/min/104cell)=[1OOOX(△A+0.6264)-F0.6555XV1]^(500XV1^V2):T=0.304X(AA+0.6264)5、按血清(漿)體積計(jì)算單位的定義：每mL血清(漿)每分鐘催化產(chǎn)生川g葡萄糖定義為一個(gè)酶活力單位。THL活力⑴g/min/mL)=[1000X(△A+0.6264)：0.6555XV1]：(V3XV1：V2)：T=1520X(AA+0.6264)。1000：1m