《生物實(shí)驗(yàn)技術(shù)》第六章 切片法

第六章切片法第一節(jié)石蠟包埋切片法*第二節(jié)火棉膠包埋切片法第三節(jié)火棉膠-石蠟雙包埋切片法第四節(jié)碳蠟包埋切片法*第五節(jié)冰凍切片法*第六節(jié)冰凍干燥法第七節(jié)冰凍替代法第八節(jié)振動切片法第九節(jié)半薄切片法

第一節(jié)石蠟包埋切片法

石蠟包埋切片法的優(yōu)缺點(diǎn)

石蠟的性質(zhì)：42～60℃

石蠟的選用：據(jù)標(biāo)本的性質(zhì)、季節(jié)和溫度選用

石蠟的質(zhì)量對切片的影響

石蠟包埋切片法程序取材－固定－脫水－包埋－切片－脫蠟－復(fù)水－染色－脫水－透明－封片第六章容易操作較節(jié)省時間可切薄片連續(xù)切片包埋塊可以長久保存不能切過分硬脆和過大標(biāo)本標(biāo)本易被酒精及熱熔的石蠟損傷一、固定、保存1、10%甲醛固定法

2、Zenker（辛克）液固定法

3、Bouin（波恩）液固定法

第一節(jié)石蠟包埋切片法第六章30%Alc50%Alc

70%Alc（+10%甘油）（保存）第一節(jié)石蠟包埋切片法第六章二、脫水三、透明80%Alc95%Alc100%AlcⅠ、Ⅱ1-2h45min1h?純酒精?二甲苯

二甲苯Ⅰ、Ⅱ30~45min15~30min四、浸蠟

?二甲苯?石蠟純蠟Ⅰ、Ⅱ30~45min各1h細(xì)嫩材料用漸浸蠟法！潮濕季節(jié)CuSO4（溫度高于石蠟熔點(diǎn)2-3℃）透明材料加曙紅第一節(jié)石蠟包埋切片法第六章第一節(jié)石蠟包埋切片法第六章五、包埋提前準(zhǔn)備好:包埋石蠟（溫度高出熔點(diǎn)5-6℃），包埋紙盒，滴管，鑷子，酒精燈，冷水等

注意組織塊定位包埋！自動組織包埋機(jī)第一節(jié)石蠟包埋切片法第六章第一節(jié)石蠟包埋切片法第六章六、切片

（一）切片機(jī)的類型與構(gòu)造

1.輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)（手搖切片機(jī)）轉(zhuǎn)輪刀座及刀夾蠟塊夾（機(jī)頭）厚度控制器微螺旋齒輪推進(jìn)器機(jī)座刀座與刀夾機(jī)頭2.滑行式切片機(jī)第一節(jié)石蠟包埋切片法第六章六、切片

（一）切片機(jī)的類型與構(gòu)造

第一節(jié)石蠟包埋切片法第六章六、切片

（二）切片刀

磨面刀面一次性刀片切片刀示意圖刀背切片刀的維護(hù)：磨刀1、磨刀的用具及附件

2、磨刀石

3、磨刀操作

先粗磨再細(xì)磨磨刀液：水、肥皂水、液體石蠟及其他油劑、

第一節(jié)石蠟包埋切片法第六章六、切片

（二）切片刀

第一節(jié)石蠟包埋切片法六、切片

第六章（三）切片操作

1、蠟塊的修整與固著

修出兩個平行邊材料距平行邊邊緣2-3mm以上切角標(biāo)記材料背腹焊接端留蠟要多蠟墊要厚一些修塊時要求一層一層切,防止蠟塊崩裂第一節(jié)石蠟包埋切片法六、切片

第六章（三）切片操作

2、切片、貼片、展片蠟塊兩平行邊與刀刃平行切片刀的清除角為5o所有的螺絲都要扭緊示切片刀角度調(diào)節(jié)30°清除角：4~6°（5°）第一節(jié)石蠟包埋切片法六、切片

第六章（三）切片操作

2、切片、貼片、展片蛋白膠貼片：酒精燈展片：攤片機(jī)展片：烘片機(jī)展片：攤片機(jī)烘片機(jī)光面朝下，暗面朝上充分展平完全干燥蛋白膠要盡量少水的面積大于蠟帶的面積42℃或37℃免疫組化研究用明膠貼片42℃或37℃第一節(jié)石蠟包埋切片法第六章六、切片

石蠟切片時可能出現(xiàn)的問題，其原因及補(bǔ)救方法：1.切出的蠟帶彎曲不直

石蠟塊的上下兩邊不平行石蠟塊的上下兩邊和刀口不平行刀口鋒利不一，局部產(chǎn)生差異材料未居蠟塊正中央材料大而形不正

2.切片分離不能連成蠟帶

室溫過低石蠟過硬材料邊緣留蠟少刀不鋒利，角度不合適卷成筒狀第一節(jié)石蠟包埋切片法第六章六、切片

石蠟切片時可能出現(xiàn)的問題，其原因及補(bǔ)救方法3.切片附于刀上，皺折在一起

室溫過高石蠟過軟刀口上留有一層石蠟刀口鈍4.切片縱裂

刀有缺口石蠟塊中有顆粒雜質(zhì)刀口上有碎蠟或纖細(xì)絲組織太硬

第一節(jié)石蠟包埋切片法第六章六、切片

石蠟切片時可能出現(xiàn)的問題，其原因及補(bǔ)救方法5.材料發(fā)生裂隙，破碎或脫落

脫水不干凈蠟塊中有透明劑殘留浸蠟時，溫度過高或時間過長脫水劑、透明劑使組織變硬變脆材料太硬或太脆6.石蠟塊將蠟帶抬起或蠟吸在刀上

由于摩擦?xí)r產(chǎn)生靜電石蠟塊上面附有碎蠟屑刀口上附有碎蠟屑

第一節(jié)石蠟包埋切片法第六章七、染色第一節(jié)石蠟包埋切片法第六章七、染色例：愛氏蘇木精與曙紅染色法（HEstaining）

二甲苯?二甲苯?純酒精100%Alc100%Alc95%Alc80%Alc70%Alc50%Alc30%Alc二甲苯蘇木精曙紅復(fù)染?二甲苯?純酒精二甲苯100%Alc95%Alc分色80%Alc70%Alc50%Alc30%Alc流水沖洗樹膠封片第一節(jié)石蠟包埋切片法第六章七、染色例：愛氏蘇木精與曙紅染色法（HEstaining）

只能在70%或80%Alc中可較長時間停留上行脫水下行復(fù)水上、下行酒精要分開顯微鏡觀察控制染色深淺分色是染色成敗的關(guān)鍵常規(guī)脫蠟鱸魚鰓大竹蟶腸大竹蟶唇瓣示例：HE染色結(jié)果鱸魚腸√√示例：HE染色結(jié)果示人工假象脾中福爾馬林色素（褐），右為偏光顯微鏡圖（折射性）示氯化汞沉淀（左），右為偏振光顯微鏡觀察示例：對材料的人為損傷切片操作不當(dāng)引起的問題切片厚，核結(jié)構(gòu)不清切片太薄脫蠟不徹底，染色不均勻透明不佳切片操作不當(dāng)引起的問題分化不良封片不佳，切片呈霧狀封片產(chǎn)生氣泡封片劑太少海得漢鐵釩蘇木精染肌肉纖維鐵蘇木精染骨骼肌HE染色染骨骼肌示例：同一組織不同染色方法的染色結(jié)果胰切片，HE染色示胰島胰切片，Mallory三色染色A細(xì)胞橙色，B細(xì)胞淺紅色示例：據(jù)研究目的選擇合適的染色方法免疫組化ABC法顯示胰島SS細(xì)胞第一節(jié)石蠟包埋切片法第六章七、染色染色過程中，切片脫落的原因及其防治方法：

原因：(1)所用載片不清潔,有油污。(2)粘貼劑已腐敗變質(zhì)。(3)貼片時光面朝上。(4)切片厚而小。(5)組織過硬。(6)切片皺褶未充分伸展。(7)切片尚未完全干燥。補(bǔ)救方法：切片表面涂一層0.5~1%的火棉膠溶液

二甲苯無水乙醇83%酒精?二甲苯?酒精0.5-1%火棉膠常發(fā)生在95%以后的梯度酒精中第六章第二節(jié)火棉膠包埋切片法包埋劑：火棉膠（易溶于酒精乙醚等混液，不溶于水）適用范圍：大型器官、較硬較脆及細(xì)嫩組織的切片程序：固定、沖洗、脫水透化：?酒精?乙醚4-5h;12-24h材料四周的火棉膠呈凍膠狀12%或16%火棉膠包埋透膠：2%、4%、6%、8%、12%1-3天，3-5天2-3天5-10天3-5天5-10天包埋：48h80%酒精硬化或保存切片：70%Alc第六章氯仿不連續(xù)切片，厚15μm滑動切片機(jī)第三節(jié)火棉膠—石蠟雙包埋法固定、沖洗、脫水透明：1/2純酒精

1/2乙醚2%火棉膠2-7天2%火棉膠氯仿修塊常出現(xiàn)問題：1.用氯仿蒸汽凝固火棉膠時，火棉膠不凝固2.石蠟包埋后，石蠟與火棉膠之間分層氯仿透明24h石蠟包埋法制片第六章氯仿量少，蒸汽不足；容器口?。换鹈弈z太稀火棉膠塊在氯仿中透明時間不夠；火棉膠中有水分；透蠟時間不夠第四節(jié)碳蠟包埋切片法碳蠟（carbowax)：即聚乙二醇（polyethleneglycol,PEG)，易溶于水、乙二醇，稍溶于丙酮/酒精等混液。分子量：100，400，600，800，1000，1500，4000，6000液體膏狀白色固體35-40℃50-55℃適于淋巴囊腫病毒檢測的方法：PEG100045min，46℃?PEG1000?PEG150045min,49℃PEG1500,45min,52℃PEG1500或PEG2000包埋*明膠貼片第六章干燥器保存包埋塊！PEG切片，熒光染色冰凍切片，熒光染色牙鲆淋巴囊腫細(xì)胞石蠟切片，HE染色牙鲆淋巴囊腫細(xì)胞PEG切片，HE染色第六章第五節(jié)冰凍切片法3.恒冷箱切片機(jī)2.半導(dǎo)體式冷凍切片機(jī)1.液態(tài)二氧化碳(氯乙烷、甲醇等)作致冷劑的冷凍切片機(jī)一、冰凍切片機(jī)工作原理第六章第五節(jié)冰凍切片法第六章材料：新鮮材料固定材料：AAF液、Cardon液、無水乙醇等固定流水沖洗，切片要貼在包被過的載片上不需要貼片劑載玻片包被方法（補(bǔ)充）L-多聚賴氨酸/蒸餾水=1：10處理載片5min60℃干燥1h或室溫18h1.L-多聚賴氨酸粘附劑：2.APES粘附劑（3-Aminopropyltriethoxysilane)干凈載片丙酮5min2%APES丙酮液2min丙酮或蒸餾水洗2遍37℃干燥2h第五節(jié)冰凍切片法第六章二、冰凍切片1.液態(tài)CO2冰凍法2.半導(dǎo)體制冷冰凍切片法開水管

開電源

切片關(guān)電源關(guān)水管開大閥開小閥切片關(guān)大閥關(guān)小閥氣流小大慢快第五節(jié)冰凍切片法第六章冷凍適宜程度的判定二、冰凍切片第五節(jié)冰凍切片法第六章3.恒冷箱冰凍切片法（1）恒冷箱切片機(jī)的結(jié)構(gòu)抗卷板厚度控制器機(jī)頭重力錘第五節(jié)冰凍切片法第六章（2）恒冷箱切片操作甲醛蒸氣或丙酮固定染色第五節(jié)冰凍切片法第六章冰凍切片注意事項(xiàng)：冷凍要快，避免冰晶形成切片溫度,-20~-25℃,一般最適-22℃注意各種冰凍切片機(jī)的操作順序冰凍切片切好后立即染色固定材料的免疫組化染色時，注意載片的處理FrozenSectionFrozencontrolNotfrozen示例：冰晶的形成第五節(jié)冰凍切片法第六章示例：冰晶對組織的擠壓第五節(jié)冰凍切片法第六章FrozenNotfrozen示例：細(xì)胞核內(nèi)形成的冰晶（空洞）6μm3μm3μm6μm10μm示例：不同厚度冰凍切片的染色效果第六章第六節(jié)冰凍干燥法

一、原理：二、步驟驟冷：-150℃異戊烷干燥：-30~-40

℃，真空包埋：去氣石蠟或碳蠟（室溫）

切片、表貼

（注意防水）固定：蒸氣固定液氮罐冰凍組織第六章冰凍組織保持高度真空，至到去除所有水分。第七節(jié)冰凍替代法一、原理：二、步驟第六章組織快速冰凍(驟冷)，組織內(nèi)的水在低溫(-40℃~-70℃)液體脫水劑中被替代，同時起到固定作用。驟冷：替代：-70~-40℃，醇或丙酮（替代+固定）包埋：切片：預(yù)冷的異戊烷中驟冷10min第八節(jié)振動切片法振動切片機(jī)第六章材料：未固定、未冰凍的新鮮材料用途：神經(jīng)生理學(xué)、神經(jīng)病理學(xué)、實(shí)驗(yàn)病理學(xué)、免疫組織化學(xué)等，在腦片技術(shù)中的應(yīng)用日趨普遍

原理：刀片作單一方向的“拉鋸式”振動制片成功的關(guān)鍵：取得穩(wěn)定的單一方向的振動。且要求有一定的振動頻率和振幅。100~700μm的哺乳動物腦薄片，能在體外腦脊液中存活數(shù)小時第八節(jié)振動切片法第六章第九節(jié)半薄切片法半薄切片：0.5~1μm主要用途：確定超薄切片方向和部位，判斷組織固定和包埋的質(zhì)量。優(yōu)越性及缺陷：第六章一、半薄切片的制片程序取材、固定、脫水、浸透、包埋與聚合、切片、染色、封片F(xiàn)ormalin