WB原理及操作注意事項(xiàng)詳解

（優(yōu)選）WB原理及操作注意事項(xiàng)詳解目前一頁\總數(shù)三十四頁\編于十七點(diǎn)印跡法(bloting)是指將樣品轉(zhuǎn)移到固相載體上，而后利用相應(yīng)的探測(cè)反應(yīng)來檢測(cè)樣品的一種方法。1975年，Southern建立了將DNA轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜（NC）上，并利用DNA-RNA雜交檢測(cè)特定的DNA片段的方法，稱為Southern印跡法。而后人們用類似的方法，對(duì)RNA和蛋白質(zhì)進(jìn)行印跡分析，對(duì)RNA的印跡分析稱為Northern印跡法，對(duì)單向電泳后的蛋白質(zhì)印跡分析稱為Western印跡法（Westernbloting），對(duì)雙向電泳后蛋白質(zhì)分子的印跡分析稱為Eastern印跡法。

目前二頁\總數(shù)三十四頁\編于十七點(diǎn)原理免疫印跡(immunoblotting)又稱蛋白質(zhì)印跡(Westernblotting)，是根據(jù)抗原抗體的特異性結(jié)合檢測(cè)復(fù)雜樣品中的某種蛋白的方法。該法是在凝膠電泳和固相免疫測(cè)定技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新的免疫生化技術(shù)。由于免疫印跡具有SDS的高分辨力和固相免疫測(cè)定高特異性和敏感性，現(xiàn)已成為蛋白質(zhì)分析的一種常規(guī)技術(shù)。免疫印跡常用于鑒定某種蛋白，并能對(duì)某種蛋白進(jìn)行定性和半定量分析。目前三頁\總數(shù)三十四頁\編于十七點(diǎn)特點(diǎn)1.SDS的高分辨力2.固相免疫測(cè)定高特異性和敏感性目前四頁\總數(shù)三十四頁\編于十七點(diǎn)目前五頁\總數(shù)三十四頁\編于十七點(diǎn)常見問題和注意事項(xiàng)一.蛋白處理與樣品處理二.蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印三.免疫雜交四.信號(hào)檢測(cè)目前六頁\總數(shù)三十四頁\編于十七點(diǎn)一、蛋白處理與樣品處理1.如何選擇裂解液？2.目標(biāo)蛋白含量低怎么辦？目前七頁\總數(shù)三十四頁\編于十七點(diǎn)1.如何選擇裂解液變性裂解液：快速，含有離子型去垢劑，作用強(qiáng)，可迅速從組織和細(xì)胞中提取大量蛋白質(zhì)eg：2*SDS上樣緩沖液非變性裂解液：較溫和，適用于識(shí)別非變性的抗原表位的抗體，可配合免疫沉淀、活性分析等應(yīng)用eg：RIPAbuffer（含TritonX-100，提全細(xì)胞蛋白）TotalproteinExtractionKit(含NP-40，更溫和)WholeCellExtractionKit(最溫和，可做酶活性分析)NuclearExtractionKit(用來提取核蛋白)目前八頁\總數(shù)三十四頁\編于十七點(diǎn)2.目標(biāo)蛋白表達(dá)量低加大上樣體積濃縮樣品超濾離心，快速、高效，且可以起到一定的提純效果，去除一些小分子蛋白增大膠厚度

目前九頁\總數(shù)三十四頁\編于十七點(diǎn)二、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印1.轉(zhuǎn)印不完全2.小分子蛋白的穿流3.免疫檢測(cè)前如何判斷轉(zhuǎn)移效果4.操作規(guī)范目前十頁\總數(shù)三十四頁\編于十七點(diǎn)1.轉(zhuǎn)印不完全要選對(duì)膜！常用的膜有兩種：PVDF：聚偏二氟乙烯NC：硝酸纖維素目前十一頁\總數(shù)三十四頁\編于十七點(diǎn)目前十二頁\總數(shù)三十四頁\編于十七點(diǎn)優(yōu)化轉(zhuǎn)移過程調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)移緩沖液成分：SDS（<0.05%）甲醇（10%-20%小分子除外）延長(zhǎng)凝膠在轉(zhuǎn)移緩沖液中平衡時(shí)間（去除凝膠中的SDS）5-30min目前十三頁\總數(shù)三十四頁\編于十七點(diǎn)InSDSsystems,therunningbufferissupplementedwithSDS.ThisSDSconcentratesfromthecathodereservoirandrunsintothegelbehindthebromophenolbluetrackingdye.Sincemostgelsarerununtilthetrackingdyeisatthebottomofthegel,alloftheexcessSDSremainsinthegelandiscarriedoverintotheblottingprocedure.Ifitisn’tallowedtodiffuseoutofthegelpriortotransfer,itwillinterferewithproteinadsorption.Equilibrationtimescanbeextendedupto30minutes,andsufficientbuffershouldbeusedtoreducetheSDStoaminimallevel.目前十四頁\總數(shù)三十四頁\編于十七點(diǎn)目前十五頁\總數(shù)三十四頁\編于十七點(diǎn)Inthisstudy,radioactiveBSAwasresolvedbySDS,andthegelswereequilibratedintransferbufferforperiodsrangingfrom0to30minutes.ProteinwastransferredtoImmobilon-PtransfermembranebackedupwithapieceofImmobilon-PSQtransfermembranetoadsorbanyBSAnotretainedbytheImmobilon-Ptransfermembrane.Attheendofthetransferperiod,theBSAinthegel,ontheprimaryblot(Immobilon-Ptransfermembrane)andontheback-upblot(Immobilon-PSQtransfermembrane)wasquantified.Retentionimprovedto90%whenthedurationoftheequilibrationperiodwasincreasedto30minutes.Otherproteinshavebeenfoundtobehavesimilarly目前十六頁\總數(shù)三十四頁\編于十七點(diǎn)2.小分子蛋白穿流使用PSQ膜目前十七頁\總數(shù)三十四頁\編于十七點(diǎn)目前十八頁\總數(shù)三十四頁\編于十七點(diǎn)2.小分子的流穿增加甲醇的濃度到30-40%甲醇能幫助蛋白分子與SDS解離，故增加甲醇的濃度也可以降低小分子蛋白的轉(zhuǎn)印速度，避免轉(zhuǎn)印過度也可以減少轉(zhuǎn)移緩沖液種的SDS（但為啥我們實(shí)驗(yàn)室還用含SDS的緩沖液？），或者減少轉(zhuǎn)移時(shí)間，以防止轉(zhuǎn)移過度目前十九頁\總數(shù)三十四頁\編于十七點(diǎn)目前二十頁\總數(shù)三十四頁\編于十七點(diǎn)3.免疫檢測(cè)前如何判斷轉(zhuǎn)移效果目前二十一頁\總數(shù)三十四頁\編于十七點(diǎn)目前二十二頁\總數(shù)三十四頁\編于十七點(diǎn)4.操作要規(guī)范“三明治”結(jié)果如何放置排盡氣泡濾紙更換目前二十三頁\總數(shù)三十四頁\編于十七點(diǎn)膜上有明顯的氣泡,why?靠膜一側(cè)的脹濾紙不平，更換！操作時(shí)氣泡沒有排完全操作很過細(xì)，還是有氣泡，why?目前二十四頁\總數(shù)三十四頁\編于十七點(diǎn)三.免疫雜交

1.低特異性2.高背景目前二十五頁\總數(shù)三十四頁\編于十七點(diǎn)1.低特異性主要原因還是一抗提高一抗和二抗的稀釋度降低SDS中蛋白的上樣量目前二十六頁\總數(shù)三十四頁\編于十七點(diǎn)2.高背景即便是抗體是高特異性的，而且稀釋度也進(jìn)行了優(yōu)化，但還是出現(xiàn)了不能接收的背景問題，why？可能是斑點(diǎn)狀的噪音背景和整體的暗背景，問題出在封閉劑的使用。目前二十七頁\總數(shù)三十四頁\編于十七點(diǎn)2.高背景正確使用封閉劑很關(guān)鍵：eg1：脫脂奶粉不能與生物素化或者刀豆蛋白標(biāo)記的抗體一起使用eg2：檢測(cè)磷酸化的抗體，不能使用含有磷酸酶的封閉劑所以說：適用于一種抗原抗體組合的封閉劑不一定適用于另外組合。甲醇是封閉么？？目前二十八頁\總數(shù)三十四頁\編于十七點(diǎn)2.高背景封閉劑和二抗中的顆粒雜質(zhì)造成解決辦法：提前配置封閉劑（牛奶），充分溶解完全后再用。0.45um濾膜過濾封閉劑目前二十九頁\總數(shù)三十四頁\編于十七點(diǎn)2.背景目前三十頁\總數(shù)三十四頁\編于十七點(diǎn)四.信號(hào)檢測(cè)1.較低的信號(hào)，低靈敏度2.整體高背景和熒光高背景目前三十一頁\總數(shù)三十四頁\編于十七點(diǎn)目前三十二頁\總數(shù)三十四頁\編于十七點(diǎn)1.較低的信號(hào)，低靈敏度增強(qiáng)信號(hào)：優(yōu)化一抗?jié)饪s