PCR擴增和電泳檢測

PCR擴增和電泳檢測目前一頁\總數(shù)三十一頁\編于十五點電泳觀察PCR反應

實驗步驟目前二頁\總數(shù)三十一頁\編于十五點DNA在體內(nèi)復制的條件是什么？模板：酶：原料、能量：解旋酶、DNA聚合酶等。DNA分子的每條鏈dATP、dGTP、dCTP、dTTP引物：溫和的反應條件目前三頁\總數(shù)三十一頁\編于十五點DNA分子的結構目前四頁\總數(shù)三十一頁\編于十五點合成DNA分子的原料——脫氧核苷三磷酸目前五頁\總數(shù)三十一頁\編于十五點合成DNA分子的原料——脫氧核苷三磷酸dATPdGTPdCTPdTTP目前六頁\總數(shù)三十一頁\編于十五點

聚合反應機理：目前七頁\總數(shù)三十一頁\編于十五點DNA聚合酶目前八頁\總數(shù)三十一頁\編于十五點不同細胞的細胞周期

不同生物細胞

需要的時間細菌一般是20~30分鐘蠶豆根尖細胞17.3小時小鼠十二指腸細胞15.3小時人的肝細胞22小時人的宮頸癌細胞22.5小時PCR技術可在幾小時內(nèi)，將特定核酸序列擴增百萬倍!目前九頁\總數(shù)三十一頁\編于十五點PCR的概念

PCR（PolymeraseChainReaction,聚合酶鏈反應）是指在體外，通過特異DNA引物擴增核酸分子中某個特定區(qū)域的技術。目前十頁\總數(shù)三十一頁\編于十五點

PCR的反應體系DNA模板原料：

dNTP(dATP、dGTP、dCTP、TTP)；酶：Taq聚合酶（嗜熱細菌中分離得到）引物：（單鏈DNA片段）Mg2+（維持酶活性所必需）PCR緩沖液：維持pH，保護Taq酶

目前十一頁\總數(shù)三十一頁\編于十五點PCR技術原理變性退火延伸目前十二頁\總數(shù)三十一頁\編于十五點PCR三步曲

預變性保溫變性90~95℃延伸70~75℃退火40~60℃目前十三頁\總數(shù)三十一頁\編于十五點PCR儀目前十四頁\總數(shù)三十一頁\編于十五點用于PCR的預混液（500L體系）：

ddH2O310L10×butter50LMgCl240LdNTP混合液20L引物125L引物225L模板DNA25L

TaqDNA聚合酶5L

標記一個微量離心管，用取樣器取20L的預混液加入到該管中。目前十五頁\總數(shù)三十一頁\編于十五點反應試劑

用量PCRSuperMix10μL引物Ⅰ（濃度10μM）1μL引物Ⅱ（濃度10μM）1μL模板DNA5μLddH2O3μL總體積20μL目前十六頁\總數(shù)三十一頁\編于十五點微量可調(diào)移液器（一檔吸、二檔排）目前十七頁\總數(shù)三十一頁\編于十五點PCR反應參數(shù)：

變性94℃30s退火52℃30s延伸72℃60s

預變性94℃300s

保溫72℃600s循環(huán)次數(shù)35目前十八頁\總數(shù)三十一頁\編于十五點1、基本概念以瓊脂糖凝膠作為介質(zhì),DNA在外加電場的作用下泳動的技術。2、實驗原理瓊脂糖是一種天然聚合長鏈狀分子，可以形成具有剛性的濾孔，凝膠孔徑的大小決定于瓊脂糖的濃度。瓊脂糖凝膠電泳目前十九頁\總數(shù)三十一頁\編于十五點瓊脂糖凝膠電泳基本原理目前二十頁\總數(shù)三十一頁\編于十五點目前二十一頁\總數(shù)三十一頁\編于十五點制膠使用電泳緩沖液在制膠器上配制1.0%的瓊脂糖凝膠。混樣2μL載樣緩沖液、2μL核酸熒光染料，10μLPCR產(chǎn)物混勻。點樣將上步混好的樣10μL加到凝膠孔中。電泳90V電壓下電泳10~20min。瓊脂糖凝膠電泳的過程目前二十二頁\總數(shù)三十一頁\編于十五點將凝膠倒入制膠器的槽中（60oC）將瓊脂糖加入電泳緩沖液,在微波爐中加熱溶解至透明。制膠目前二十三頁\總數(shù)三十一頁\編于十五點將梳子從制膠槽中拔出

目前二十四頁\總數(shù)三十一頁\編于十五點取出凝膠板放入電泳槽中

向電泳槽中加入電泳緩沖液至沒過凝膠

目前二十五頁\總數(shù)三十一頁\編于十五點

瓊脂糖凝膠電泳中緩沖液的作用1、增加電導率；2、維持電泳過程中的合適的pH。目前二十六頁\總數(shù)三十一頁\編于十五點吸取PCR反應產(chǎn)物10μL。注意吸頭要插入到管底，才能取到PCR產(chǎn)物。

將PCR產(chǎn)物與加樣緩沖液充分混合（吸排幾次）

混樣目前二十七頁\總數(shù)三十一頁\編于十五點常用的上樣緩沖液配方及各成分的作用蔗糖使樣品呈色，便于上樣，形成可見指示帶，預測電泳進程。溴酚藍增加樣品密度，保證DNA均勻沉入加樣孔內(nèi)。核酸熒光染料可嵌合入DNA分子，在特定激發(fā)光源的激發(fā)下可發(fā)出熒光，熒光強度與DNA含量成正比。（需要與加樣緩沖液混合）目前二十八頁\總數(shù)三十一頁\編于十五點加樣目前二十九頁\總數(shù)三十一頁\編于十