siRNA干擾人核糖核酸酶抑制因子在HeLa細胞中的表達鑒定

siRNA攪亂人核糖核酸酶控制因子在HeLa細胞中的表達判斷IdentificationoftheeffectofsiRNAplasmidtargetedcombinationhRIexpressedinHeLacellLIKun1DINGNing1LILin21.DepartmentofClinicalLaboratoryMedicine，MedicalCollegeofDalianUniversity，LiaoningProvince，Dalian*，China；2.DepartmentofClinicalLaboratory，MaternalandChildCareServiceCentreofDalian，LiaoningProvince，Dalian*，China[Abstract]ObjectiveToidentifythesilencingeffectonhumanHeLacellsofasiRNAplasmidpKD-dsRItargetingthegeneofhumanribonucleaseinhibitor（hRI），whichiscapableofexpressioninmammaliancells.MethodsThevectorofpKD-dsRIwasco-transfectedintoHeLacellswiththereporterplasmidofpLNCX-EGFP-C1-hritransfectiongroup），usingthecellstransfectedwiththereporterplasmidofpLNCX-EGFP-C1-hri（controlgroup1），emptyplasmidofpKDtogetherwithpLNCX-EGFP-C1-hri（controlgroup2），andthoseuntransfected（notransfectiongroup）ascontrols.ThesilencingeffectwasdeterminedbyRT-PCR，andtheexpressionlevelofegfp-hriproteinwasdeterminedbyWesternblottingrespectively.ResultsThetranscriptionleveloftheegfp-hrifusiongeneincellsco-transfectedwithpKD-dsRIandreporterplasmiddecreasedby91%and85%，whiletheexpressionleveloftheegfp-hrifusiongenedecreasedby83%and81%，ascomparedwithcontrolgroup1andcontrolgroup2respectively（eachP0.05）.ConclusionTheplasmidofsiRNAtargetinghRIissuccessfullyconstructedandtheproteinofhRIcanbeinhibitedincytomatrixofHeLacellscorrectly.[Keywords]Humanribonucleaseinhibitor；siRNA；Identification惡性腫瘤素來是嚴重威迫人類健康的重要疾病之一。目前其臨床治療仍以傳統(tǒng)的手術(shù)、放、化療為主，擁有很多缺點，如術(shù)后易復(fù)發(fā)、患者難過大、生計質(zhì)量差、生計期短等。搜尋和發(fā)現(xiàn)治療腫瘤的新方法和新路子仍是現(xiàn)在醫(yī)學研究的熱門和難點。目前研究以為，實體瘤的生長依賴于新血管生成，可以經(jīng)過控制腫瘤血管生成達到抗腫瘤作用，因此最近幾年來正成為腫瘤治療研究的熱門領(lǐng)域。核糖核酸酶控制因子（ribonucleaseInhibitor，RI）是廣泛存在于哺乳動物細胞漿內(nèi)的酸性糖蛋白，能經(jīng)過與血管形成因子（Angiogenin，Ang）親密結(jié)合而控制其活性，進而控制實體瘤血管的形成，進而控制腫瘤的生長。因而RI可能為擁有抗腫瘤血管活性的腫瘤控制基因，有望應(yīng)用于腫瘤的基因治療中。為了進一步商議RI的抗腫瘤體系，筆者成立了針對人核糖核酸酶控制因子（hRI）基因的siRNA載體pKD-dsRI。為了考據(jù)該載體的攪亂收效，本實驗用重組綠色熒光蛋白交融hRI的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pLNCX-EGFP-C1-hri充當報告基因，將siRNA載體pKD-dsRI與報告載體共轉(zhuǎn)染到人宮頸癌細胞HeLa中，考據(jù)siRNA表達載體的攪亂收效。資料與方法1.1資料人宮頸癌細胞HeLa由大連大學醫(yī)學院生物化學與分子生物學教研室（以下簡稱“本室”）保存；含H1啟動子的針對hRI的siRNA表達載體pKD-dsRI由本室成立（圖1）。圖1siRNA表達載體pKD-dsRI1.2試劑DL2000DNAMarker、質(zhì)粒提取試劑盒、DEPCH2O購自寶生物工程（大連）有限公司；梭華-SofastR基因轉(zhuǎn)染試劑購自廈門太陽馬生物工程有限公司；RPMI1640培育基、胰蛋白酶、Trizol購于Gibco公司；胎牛血清購自杭州四時青血清生物制品有限公司；PVDF（聚偏二氟乙烯）膜購Biosciences；RT-PCRkit、ECL化學發(fā)光顯色試劑盒購自Sigma公司；兔抗人核糖核酸酶控制因子抗體由本室制備；RIPA蛋白裂解液購自KEYGEN生物；其余實驗中所用的酚、氯仿、異丙醇等試劑均為解析純。1.3細胞培育與轉(zhuǎn)染人宮頸癌細胞HeLa細胞在含10%胎牛血清、雙抗（青霉素100μ/mL，鏈霉素100μg/mL）的RPMI1640培育基于5%的CO2、37℃、90%濕度條件下培育。取對數(shù)生長久細胞按0.5×105～2.0×105/mL鋪板于24孔板中，至細胞達到80%匯片晌用梭華-SofastR轉(zhuǎn)染試劑進行轉(zhuǎn)染。分為四組：空白比較組（未轉(zhuǎn)染組）、pLNCX-EGFP-C1-hri轉(zhuǎn)染組（比較組1）、pKD+pLNCX-EGFP-C1-hri共轉(zhuǎn)染組（比較組2）、pKD-dsRI+pLNCX-EGFP-C1-hri共轉(zhuǎn)染組（攪亂組），每組3復(fù)孔。每組質(zhì)粒共用0.8μg、脂質(zhì)體2μL，共轉(zhuǎn)染組用pLNCX-EGFP-C1-hri0.2μg、pKD-dsRI0.6μg或pKD0.6μg。轉(zhuǎn)染后48～72h收獲細胞。1.4轉(zhuǎn)染細胞中RI基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平的檢測轉(zhuǎn)染24h后，收獲細胞。采納Trizol試劑提取各組細胞的總RNA。使用RT-PCR試劑盒依據(jù)兩步法進行RT-PCR反應(yīng)。以總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板進行PCR反應(yīng)。ri基因上游引物：5“-gacatccagtgtgaggagctgagcg-3“，下游引物：5"-ccagcctcattgatgtcgttgttgc-3"，擴增產(chǎn)物約為527bp；用于檢測轉(zhuǎn)染效果的pLNCX-EGFP-C1-hri質(zhì)粒引物是上游引物：5"-tgatgtcgttgttgctaaccgtgag-3"，下游引物：5"-actctcggcatggacgagctgtac-3"，上游引物位于載體pLNCX-EGFP-C1-hri的egfp基因閱讀框的No.697bp，下游引物位于載體pLNCX-EGFP-C1-hri的MCS的下游地址，擴增產(chǎn)物為583bp；內(nèi)參β-actin的上游引物：5"-gctgtccctgtacgcctctg-3"，下游引物：5"-tgccgatggtgatgacctgg-3"，擴增產(chǎn)物約為300bp。反應(yīng)條件為：94℃2min，94℃30s，55℃30s，72℃4min，循環(huán)25次，72℃4min。PCR產(chǎn)物由Bio-Rad凝膠成像儀攝入凝膠圖像，用ImageLabTM軟件對各個條帶測定其面積及灰度值。用目的蛋白條帶灰度值與β-actin條帶灰度值的比值表示目的蛋白的相對表達強度。攪亂率=相對表達強度空載體組-相對表達強度攪亂組/相對表達強度空載體組。1.5Western-blotting法檢測轉(zhuǎn)染細胞中RI蛋白表達水平1.6統(tǒng)計學方法采納SPSS11.5統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)解析，計量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（x±s）表示，多組間比較采納單要素方差解析，組間兩兩比較采納LSD-t查驗，以P0.05為差別有統(tǒng)計學意義。結(jié)果2.1RT-PCR檢測hri基因在轉(zhuǎn)錄后水平上的表達RT-PCR半定量解析顯示，未轉(zhuǎn)染組細胞的RT-PCR產(chǎn)物在527bp和300bp處可見RI基因和內(nèi)參β-actin基因條帶，RI基因相對表達強度為（0.89±0.05）；比較組1和比較組2的RT-PCR產(chǎn)物在583bp和300bp處均可見egfi-hri基因和內(nèi)參基因條帶，egfi-hri基因相對表達強度分別為（1.69±0.32）和（1.03±0.09）；攪亂組中egfi-hri基因相對表達強度為（0.15±0.04），與比較組1和比較組2對照，分別降落了91%和85%，差別有統(tǒng)計學意義（P0.05）。議論作為體內(nèi)重要的調(diào)治分子，hRI擁有多方面的功能[4-7]，這是由其特別氨基酸序列及結(jié)構(gòu)決定的，其一級結(jié)構(gòu)含有大批的亮氨酸和還原型半胱氨酸，空間結(jié)構(gòu)呈馬蹄形，由富含亮氨酸殘基重復(fù)區(qū)（leucin-richreapeat，LRR）的α/β螺旋折疊結(jié)構(gòu)多次重復(fù)組成[8-11]。目前研究發(fā)現(xiàn)在血小板糖蛋白Ib的α-亞基、人血清富含亮氨酸的α2-糖蛋白、酵母腺氨酸環(huán)化酶、果蠅的chaoptin和果蠅Toll蛋白等多種蛋白中廣泛存在LRR結(jié)構(gòu)域，且相關(guān)實考據(jù)明LRR結(jié)構(gòu)域與膜和蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)的互相作用相關(guān)。另一方面國內(nèi)外研究以為，RI在正常細胞內(nèi)，作為RNase控制劑（Ki=4.0×10-14mol/L），可以保護mRNA和rRNA，使蛋白質(zhì)合成旺盛；作為血管生長因子控制劑Ki=7.1×10-16mol/L），RI可以控制腫瘤血管的形成[13-15，16-17]。其他，發(fā)現(xiàn)RI還擁有抗機體氧化損害的功能[18-19]。綜上所述，筆者以為RI具抗腫瘤作用，可能為腫瘤控制因子。為證明這一推論，筆者成立了針對dsRI介導(dǎo)hri基因的默然。該載體是在

hri的siRNA瞬時載體pKD-H1啟動子（RNApolⅢ）的作用下，產(chǎn)生發(fā)夾樣RNA（shorthairpinRNA