蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的測定

關(guān)于蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的測定第1頁，課件共25頁，創(chuàng)作于2023年2月蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)指：蛋白質(zhì)多肽鏈中氨基酸的排列順序，包括二硫鍵的位置。組成一個(gè)蛋白質(zhì)分子的多肽鏈的數(shù)目和多肽鏈中氨基酸的精確序列是蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的兩個(gè)重要方面。其中最重要的是多肽鏈的氨基酸順序，它是蛋白質(zhì)生物功能的基礎(chǔ)。一級結(jié)構(gòu)(PrimaryStructure)第2頁，課件共25頁，創(chuàng)作于2023年2月包括以下幾方面內(nèi)容：①多肽鏈的數(shù)目；②每條多肽鏈中氨基酸的種類、殘基數(shù)目和排列次序；③鏈內(nèi)或鏈間二硫鍵的位置和數(shù)目。第3頁，課件共25頁，創(chuàng)作于2023年2月蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)測定的策略從蛋白質(zhì)開始的蛋白質(zhì)序列分析從DNA開始推蛋白質(zhì)氨基酸序列質(zhì)譜法測定蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)第4頁，課件共25頁，創(chuàng)作于2023年2月從蛋白質(zhì)開始的蛋白質(zhì)序列分析測定的基本戰(zhàn)略測定一級結(jié)構(gòu)的準(zhǔn)備工作測定一級結(jié)構(gòu)的基本步驟第5頁，課件共25頁，創(chuàng)作于2023年2月測定的基本策略用兩種裂解肽鏈的方法,分別得到裂解肽段；分離提純肽段,測出各個(gè)肽段的氨基酸序列；對兩套肽段序列比較,找出重疊肽,確定各肽段位置,拼湊整個(gè)肽鏈的氨基酸排序。第6頁，課件共25頁，創(chuàng)作于2023年2月測定一級結(jié)構(gòu)的準(zhǔn)備工作對樣品純度的要求>97%

對蛋白質(zhì)分子量的測定誤差10%

測定分子中多肽鏈的數(shù)目與種類蛋白質(zhì)的氨基酸組成蛋白質(zhì)的配基蛋白質(zhì)的端基分析第7頁，課件共25頁，創(chuàng)作于2023年2月測定一級結(jié)構(gòu)的基本步驟測定蛋白質(zhì)分子中多肽鏈的數(shù)目拆分蛋白質(zhì)分子中的多肽鏈測定多肽鏈的氨基酸組成分析多肽鏈的N末端和C末端斷裂多肽鏈內(nèi)的二硫鍵多肽鏈斷裂成肽段測定各個(gè)多肽段的氨基酸順序確定肽段在多肽鏈中的次序確定原多肽鏈中二硫鍵的位置第8頁，課件共25頁，創(chuàng)作于2023年2月測得相對分子質(zhì)量Mr

很多方法可用于確定蛋白質(zhì)的相對分子量，如：滲透壓、擴(kuò)散系數(shù)、沉降系數(shù)凝膠過濾、凝膠電泳等，測定末端氨基酸數(shù)xX÷(m/Mr)=n(蛋白質(zhì)分子中肽鏈數(shù)目)（m為樣品質(zhì)量）蛋白質(zhì)中多肽鏈數(shù)目的確定第9頁，課件共25頁，創(chuàng)作于2023年2月蛋白質(zhì)中多肽鏈的拆分變性：8mol/L尿素或6mol/LHCI，或高濃度鹽溶液如有二硫鍵交聯(lián)：巰基乙醇，或過氧乙酸處理凝膠過濾或電泳分離不同肽鏈第10頁，課件共25頁，創(chuàng)作于2023年2月多肽鏈的拆分第11頁，課件共25頁，創(chuàng)作于2023年2月氨基酸組成分析酸水解：堿水解：甲基磺酸水解：優(yōu)點(diǎn)：不破壞色氨酸，經(jīng)堿中和后可直接上機(jī)自動(dòng)分析缺點(diǎn)：不能有碳水化合物存在中和點(diǎn)不易掌握計(jì)算出各種氨基酸分子比多肽鏈分子量確定氨基酸組成第12頁，課件共25頁，創(chuàng)作于2023年2月末端氨基酸分析N末端氨基酸分析丹黃酰氯法(DNS)：優(yōu)點(diǎn)：可直接層析或電泳分離，熒光檢測定性定量；靈敏度高(較二硝基氟苯法高100倍)

二硝基氟苯(DNFBorFDNB)法；氨肽酶法；第13頁，課件共25頁，創(chuàng)作于2023年2月多肽—OC—CH—NH2+R+HCI弱堿性+DNS-氨基酸酸水解游離氨基酸有機(jī)溶劑萃取溶于水定量

+定性確定N末端氨基酸確定肽鏈數(shù)目多肽—OC—CH—NH—RDNS-氨基酸第14頁，課件共25頁，創(chuàng)作于2023年2月將肽鏈裂解成小片斷要求：斷裂點(diǎn)較少，專一性較強(qiáng)、產(chǎn)率高酶裂解法：常用的酶：胰蛋白酶：僅斷裂Lys、Arg羧基形成的肽鍵（但）糜蛋白酶：位點(diǎn)：Tyr、Phe、Trp羧基肽鍵胃蛋白酶：位點(diǎn)：兩種疏水性氨基酸形成的肽鍵嗜熱菌蛋白酶：專一性較差金黃色葡萄球菌蛋白酶（Glu蛋白酶）：梭狀芽孢桿菌蛋白酶（Arg蛋白酶）：化學(xué)裂解法：溴化氰法：專一性斷裂蛋氨酸羧基形成的肽鍵第15頁，課件共25頁，創(chuàng)作于2023年2月可得到合適大小的肽片斷第16頁，課件共25頁，創(chuàng)作于2023年2月Cyanogenbromide(溴化氰法）第17頁，課件共25頁，創(chuàng)作于2023年2月肽段氨基酸序列的測定Edman降解法：一次可連續(xù)測定60~70個(gè)氨基酸；程序復(fù)雜，工作量大；酶降解法：質(zhì)譜法：第18頁，課件共25頁，創(chuàng)作于2023年2月Edman降解法測定N-末端氨基酸EdmanreagentPTC-多肽少一個(gè)N-末端氨基酸的肽鏈層析色譜鑒定重復(fù)①②③與DNS法聯(lián)合①②③第19頁，課件共25頁，創(chuàng)作于2023年2月肽片斷在多肽鏈中排列次序的確定(見p179)第20頁，課件共25頁，創(chuàng)作于2023年2月多肽鏈中二硫鍵位置的確定第21頁，課件共25頁，創(chuàng)作于2023年2月多肽鏈氨基酸系列的直接測定：最初于1954年由英國劍橋大學(xué)的Sanger實(shí)驗(yàn)室建立；現(xiàn)主要由編碼蛋白質(zhì)的基因的核苷酸順序推導(dǎo).蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫美國生物醫(yī)學(xué)基金會(huì)的PIR(ProteinInformationResourceorProteinIdentificationResource);美國政府的GenBank(GeneSequenceDataBank)歐洲的EMBL(EuropeanMolecularBiologyLaboratoryDataBank)（歐洲分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)庫）可從“AltasofProteinSequence