蛋白質(zhì)表達(dá)和抗體制備

關(guān)于蛋白質(zhì)表達(dá)和抗體制備第1頁，課件共32頁，創(chuàng)作于2023年2月常用蛋白表達(dá)系統(tǒng)(host)

原核：大腸桿菌。真核：酵母、昆蟲、哺乳動物、植物。第2頁，課件共32頁，創(chuàng)作于2023年2月大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)大腸桿菌是基因工程研究中采用最多的原核表達(dá)體系。優(yōu)越性：①對大腸桿菌的基礎(chǔ)生物學(xué)、分子遺傳學(xué)等背景知識和基因表達(dá)的調(diào)控機(jī)理已有了深刻了解；②商品化的載體和菌株種類非常齊全；③表達(dá)效率高；④易培養(yǎng)，成本低。缺點(diǎn)：①因分泌能力不足，真核蛋白質(zhì)常形成不溶性的包含體；②蛋白質(zhì)不能糖基化；③其內(nèi)毒素很難除去。

第3頁，課件共32頁，創(chuàng)作于2023年2月酵母表達(dá)系統(tǒng)優(yōu)越性：①蛋白可糖基化，有相對正確的天然結(jié)構(gòu)，可很好的生產(chǎn)分泌型蛋白；②表達(dá)載體為整合型質(zhì)粒，載體中含有與酵母染色體中同源的序列，因而比較容易整合入酵母染色體中，實(shí)現(xiàn)高效率表達(dá)；③表達(dá)載體都為E.coli/PichiaPastoris的穿梭載體，可在獲得克隆后采用E.coli細(xì)胞大量擴(kuò)增。④易培養(yǎng)，成本低,可高密度發(fā)酵。缺點(diǎn)：①糖基化與哺乳動物有所差別；②培養(yǎng)上清多糖濃度高，不利于純化。第4頁，課件共32頁，創(chuàng)作于2023年2月昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)利用重組桿狀病毒在昆蟲細(xì)胞體系中表達(dá)外源蛋白是目前較為流行的表達(dá)方式。優(yōu)越性：①重組蛋白具有完整的生物學(xué)功能，如蛋白的正確折疊、二硫鍵的搭配；②可容納較大片段的外源DNA插入，因此是表達(dá)大片段DNA的理想載體；③可進(jìn)行分泌表達(dá)。缺點(diǎn)：①糖基化與哺乳動物有所差別；②表達(dá)量有限；③作為藥物宿主細(xì)胞未被FDA認(rèn)可；

④培養(yǎng)成本高。第5頁，課件共32頁，創(chuàng)作于2023年2月哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)哺乳動物細(xì)胞常用于表達(dá)高活性的人源重組蛋白。優(yōu)越性：①糖基化與人源蛋白一致；②能表達(dá)天然結(jié)構(gòu)的完整蛋白，活性很高；③可進(jìn)行分泌表達(dá)。缺點(diǎn)：①表達(dá)量低；②培養(yǎng)成本很高，操作繁瑣。第6頁，課件共32頁，創(chuàng)作于2023年2月植物表達(dá)系統(tǒng)優(yōu)越性：①能夠表達(dá)來自動物、細(xì)菌、病毒以及植物本身的蛋白質(zhì)。②易于大規(guī)模培養(yǎng)和生產(chǎn)。③在基因表達(dá)與修飾及安全性方面有特別的優(yōu)勢。缺點(diǎn)：不易提取與純化第7頁，課件共32頁，創(chuàng)作于2023年2月

FactorsinE.coli

proteinexpression

VectorStrainGrowthconditions第8頁，課件共32頁，創(chuàng)作于2023年2月原核表達(dá)載體眾多，常用的有pET(T7promoter)、pQE(T5promoter)、pGEX(GST融合表達(dá))等。各載體適應(yīng)的菌株也不盡相同pET(BL21(DE3))、pQE(M15,JM109)、pGEX(BL21)。對于我們來說，最常用和最需掌握的是pET表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)載體(Vector)

第9頁，課件共32頁，創(chuàng)作于2023年2月Expressionplasmidfeatures第10頁，課件共32頁，創(chuàng)作于2023年2月Lacoperon第11頁，課件共32頁，創(chuàng)作于2023年2月Inductionofexpression第12頁，課件共32頁，創(chuàng)作于2023年2月原核表達(dá)宿主菌名稱特征用途抗性DH5α帶有recAendA突變的克隆菌株，由于DH5α具有deoR變異，可以作為較大質(zhì)粒的宿主菌使用。常用的質(zhì)粒抽提工程菌株,可用于藍(lán)白斑篩選鑒別重組菌株。無BL21lon和ompT蛋白酶缺陷型用于PGEX載體構(gòu)建質(zhì)粒的蛋白表達(dá)無BL21(DE3)lon和ompT蛋白酶缺陷型，含有l(wèi)acI抑制基因和位于lacUV5啟動子下的T7RNA聚合酶基因用于含有T7的pET系列載體構(gòu)建質(zhì)粒的蛋白表達(dá)無BL21(DE3)-RP在BL21(DE3)細(xì)胞的基礎(chǔ)上，具有額外拷貝的argU和proL基因解決了表達(dá)富含AT的基因組蛋白密碼子偏倚性問題氯霉素BL21(DE3)-RIL在BL21(DE3)細(xì)胞的基礎(chǔ)上，具有額外拷貝的argU、ileY和leuWtRNA基因解決了表達(dá)富含AT的基因組蛋白密碼子偏倚性問題氯霉素BL21(DE3)-plysS帶有可以與pET共存的、編碼T7溶菌酶（T7RNA聚合酶的天然抑制物）的質(zhì)粒。pLysS菌株在被誘導(dǎo)前T7RNA聚合酶的基礎(chǔ)表達(dá)被抑制，這樣可以使表達(dá)會影響宿主細(xì)胞生長和活力的重組體在宿主中更穩(wěn)定。帶有pLacI質(zhì)粒的宿主菌產(chǎn)生額外的抑制pETBlue和pTriEx載體基礎(chǔ)表達(dá)的lac阻遏蛋白更嚴(yán)格的本底表達(dá)控制，適合于毒性蛋白和非毒性蛋白的表達(dá)。氯霉素BL21(DE3)-Rosetta-gami（Rosetta-gami）攜帶pRARE2質(zhì)粒的BL21衍生菌，補(bǔ)充大腸桿菌缺乏的七種（AUA,AGG,AGA,CUA,CCC,GGA及CGG）稀有密碼子對應(yīng)的tRNA，提高外源基因、尤其是真核基因在原核系統(tǒng)中的表達(dá)水平，又具有thioredoxinreductase(trxB)和glutathionereductase(gor)兩條主要還原途徑雙突變菌株，顯著提高細(xì)胞中二硫鍵形成幾率，促進(jìn)蛋白可溶性及活性表達(dá)補(bǔ)充7種稀有密碼子，促進(jìn)蛋白可溶性及表達(dá)活性卡那霉素、氯霉素、四環(huán)素Rosetta-Blue帶有recAendAlacIq突變的克隆菌株,高蛋白表達(dá),補(bǔ)充大腸桿菌缺乏的AGG,AGA,AUA,CUA,CCC,GGA六種稀有密碼子對應(yīng)的tRNA。補(bǔ)充稀有密碼子，提高外源基因、尤其是真核基因在原核系統(tǒng)中的表達(dá)水平氯霉素第13頁，課件共32頁，創(chuàng)作于2023年2月所有B型菌株，B834，BL21，BLR，OrigamiB，Rosetta及Tuner都缺乏純化過程中降解蛋白的lon蛋白酶及ompT

外膜蛋白酶。因此，目的蛋白在這些菌株中的穩(wěn)定性要高于帶有這些蛋白酶的菌株。BL21(DE3)是用得最多的表達(dá)菌AD494(DE3)和BL21trxB(DE3)具有trxB突變，而Origami(DE3)，OrigamiB(DE3)和Rosetta-gami(DE3)菌株帶有trxB和gor雙突變。擁有trxB和gor突變的菌株比單具

trxB突變的菌株更有可能促進(jìn)二硫鍵的形成，使蛋白可溶性更好，活性更高多數(shù)氨基酸有不只一個密碼子，而不同的生物使用這61種密碼子的偏好性不同。每種細(xì)胞里，tRNA種類和數(shù)量直接反映了其mRNA使用密碼子的種類和數(shù)量的偏好性。當(dāng)外源目的基因mRNA在E.coli里過表達(dá)，由于密碼子偏愛性不同，會因?yàn)槿狈δ撤N或某幾種tRNA，直接導(dǎo)致翻譯終止或錯誤。tRNA不足會造成翻譯停頓，早期翻譯停止，移碼突變，和氨基酸錯摻等問題。Rosetta菌株是經(jīng)過修飾，專用于帶有大腸桿菌稀有密碼子的真核蛋白表達(dá)的菌株。經(jīng)提高稀有tRNA水平，這些蛋白的表達(dá)會大幅度提高。第14頁，課件共32頁，創(chuàng)作于2023年2月

表達(dá)條件培養(yǎng)基抗生素誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)溫度誘導(dǎo)時機(jī)誘導(dǎo)時間第15頁，課件共32頁，創(chuàng)作于2023年2月載體對表達(dá)的影響pET32,BL21(DE3),表達(dá)蛋白:Trx-His6-EK-IFN(MW35KD)pET43,BL21(DE3),表達(dá)蛋白:Nus-His6-STag-EK-IFN(MW78KD)NIIIMIpspsMNISPU:UninducedcrudeextractI:CrudeextractafterinducedS:LysissupertanantP:Lysisprecipitation第16頁，課件共32頁，創(chuàng)作于2023年2月0.1mMIPTG,incubatefor16hat16℃0.1mMIPTG,incubatefor3hat37℃

NISP

NISP表達(dá)條件對表達(dá)的影響pET21,BL21(DE3)-RIL,表達(dá)的蛋白:His6-REIIBP(MW67KD)U:UninducedcrudeextractI:CrudeextractafterinducedS:LysissupertanantP:Lysisprecipitation第17頁，課件共32頁，創(chuàng)作于2023年2月

增加可溶性和折疊降低蛋白合成速率。溫度。裂解緩沖液的性質(zhì)。融合標(biāo)簽二硫鍵第18頁，課件共32頁，創(chuàng)作于2023年2月pET載體E.coli表達(dá)蛋白流程制備pET載體制備插入DNA將插入片段插入到pET載體上轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌誘導(dǎo)/優(yōu)化表達(dá)目的蛋白放大實(shí)驗(yàn)純化目的蛋白第19頁，課件共32頁，創(chuàng)作于2023年2月蛋白抗體制備

第20頁，課件共32頁，創(chuàng)作于2023年2月多克隆抗體：由某一抗原刺激機(jī)體后產(chǎn)生的抗體，實(shí)際上為針對該抗原分子表面不同抗原決定簇的抗體的混合物，即多克隆抗體。單克隆抗體：由單一B細(xì)胞克隆產(chǎn)生的高度均一、僅針對某一特定抗原表位的抗體，稱為單克隆抗體。通常采用雜交瘤技術(shù)來制備，雜交瘤（hybridoma）抗體技術(shù)是在細(xì)胞融合技術(shù)的基礎(chǔ)上，將具有分泌特異性抗體能力的致敏B細(xì)胞和具有無限繁殖能力的骨髓瘤細(xì)胞融合為B細(xì)胞雜交瘤。用具備這種特性的單個雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)成細(xì)胞群，可制備針對一種抗原表位的特異性抗體即單克隆抗體。第21頁，課件共32頁，創(chuàng)作于2023年2月?lián)墨I(xiàn)及DNAstar軟件分析，確定各蛋白最可能抗原區(qū)序列，PrimerPremier5.0軟件設(shè)計引物，從基因組，擴(kuò)增目的基因。克隆至pET28a載體上。轉(zhuǎn)化至DH5a中，經(jīng)PCR驗(yàn)證重組子。重組子質(zhì)粒再轉(zhuǎn)化至BL21(DE3)菌株中，進(jìn)行小量誘導(dǎo)表達(dá)，確認(rèn)最適條件后，進(jìn)行大量誘導(dǎo)表達(dá)，提取大腸桿菌包涵體，溶菌酶處理，添加去垢劑，超聲破碎后，溶于8MUrea中，經(jīng)鎳柱層析咪唑洗脫，過夜透析，無菌過濾后，免疫家兔，通過化學(xué)發(fā)光Western印跡確定多克隆抗血清的效價。第22頁，課件共32頁，創(chuàng)作于2023年2月抗原基因構(gòu)筑：通過設(shè)計的抗原序列aa的個數(shù)，加上載體上含組氨酸標(biāo)簽序列的42aa，計算是否達(dá)到抗體注射免疫家兔的要求（17-25kDa之間）第23頁，課件共32頁，創(chuàng)作于2023年2月誘導(dǎo)表達(dá)靶蛋白：PCR驗(yàn)證基因產(chǎn)物是否插入載體。轉(zhuǎn)化至DH5a中測序，再轉(zhuǎn)化至BL21中小量誘導(dǎo)表達(dá)各蛋白。探索蛋白表達(dá)最合適的條件，如溫度、誘導(dǎo)時間、IPTG濃度。0h2h4h6h第24頁，課件共32頁，創(chuàng)作于2023年2月大量誘導(dǎo)表達(dá)，分離包涵體：過夜培養(yǎng)25ml菌液，在5：1的錐形瓶:培養(yǎng)基中按1：50比例加入過夜菌液，30-35℃，0.4mMIPTG，按上述優(yōu)化條件大量誘導(dǎo)表達(dá)靶蛋白。5000g,15min,棄上清，加入Bindingbuffer(-Urea,20mMPBS(pH7.8),500mMNaCl)懸浮菌液。加入lysozyme（溶菌酶）至終濃度1mg/ml，室溫放置30min。加入1%Triton-X-100，冰中放置10min。超聲破碎120W，4s，間隔4s,5min。上清另存用于檢測。用Bindingbuffer(-Urea)懸浮洗滌可溶性雜蛋白。上清另存用于檢測。沉淀用Bindingbuffer(+8MUrea)懸浮。取少量上清檢測。其于凍存用于純化。control第25頁，課件共32頁，創(chuàng)作于2023年2月靶蛋白純化:0.45um濾器(whatman)去除細(xì)菌蛋白碎片，以利于進(jìn)行組氨酸標(biāo)簽表達(dá)蛋白的鎳柱層析純化。對蛋白進(jìn)行定量（牛血清白蛋白法）。第26頁，課件共32頁，創(chuàng)作于2023年2月鎳柱層析:層析柱（(Poly-PrepChromatographyColumn,BIORAD)中加入1.5ml50%Ni-NTAHisBindResin，自然沉降，無菌水沖洗，3mlbindingbuffer(+8MUrea)平衡。（流速10ml/h）6ml（至少3ml）bindingbuffer(+8mUrea)洗柱，4mlwashingbuffer((20mMPBS,pH6.0,500mMNaCl,8MUrea)洗柱。6ml10mM(bindingbuffer+),50mM,100mM,150mM,200mMbuffer依次洗柱，洗脫靶蛋白。5ml無菌水沖洗。3mlBindingbuffer(+8MUrea)平衡。保留2mlBindingbuffer(+8MUrea)于柱中，保存于4℃。層析后蛋白樣品需經(jīng)過透析使Urea濃度8M降至2M，和中性條件(pH7.2,PBS)原理：His標(biāo)簽是蛋白質(zhì)重組技術(shù)中經(jīng)常用到的一種標(biāo)簽，其序列為六個組氨酸HHHHHH，其特點(diǎn)是分子量小，基本不改變蛋白質(zhì)的生物結(jié)構(gòu)，不改變蛋白質(zhì)的溶解性，更重要的是它使蛋白質(zhì)的純化變得極為方便，根據(jù)組氨酸上的咪唑環(huán)可以與二價金屬離子結(jié)合的原理，人們可以利金屬離子親