第三液相色譜法

第三液相色譜法演示文稿目前一頁(yè)\總數(shù)四十九頁(yè)\編于五點(diǎn)優(yōu)選第三液相色譜法目前二頁(yè)\總數(shù)四十九頁(yè)\編于五點(diǎn)目前三頁(yè)\總數(shù)四十九頁(yè)\編于五點(diǎn)4.1.1特點(diǎn)

特點(diǎn)：高壓、高效、高速、高靈敏度高沸點(diǎn)、熱不穩(wěn)定有機(jī)及生化試樣的高效分離分析方法。目前四頁(yè)\總數(shù)四十九頁(yè)\編于五點(diǎn)4.1.2.流程目前五頁(yè)\總數(shù)四十九頁(yè)\編于五點(diǎn)4.1.3.主要部件(1)高壓輸液泵主要部件之一，壓力：150～350×105Pa。為了獲得高柱效而使用粒度很小的固定相（<10m），液體的流動(dòng)相高速通過(guò)時(shí)，將產(chǎn)生很高的壓力，因此高壓、高速是高效液相色譜的特點(diǎn)之一。應(yīng)具有壓力平穩(wěn)、脈沖小、流量穩(wěn)定可調(diào)、耐腐蝕等特性目前六頁(yè)\總數(shù)四十九頁(yè)\編于五點(diǎn)(2)梯度淋洗裝置外梯度:

利用兩臺(tái)高壓輸液泵，將兩種不同極性的溶劑按一定的比例送入梯度混合室，混合后進(jìn)入色譜柱。內(nèi)梯度:

一臺(tái)高壓泵,通過(guò)比例調(diào)節(jié)閥,將兩種或多種不同極性的溶劑按一定的比例抽入高壓泵中混合。目前七頁(yè)\總數(shù)四十九頁(yè)\編于五點(diǎn)

流路中為高壓力工作狀態(tài)，通常使用耐高壓的六通閥進(jìn)樣裝置，其結(jié)構(gòu)如圖所示：(3)進(jìn)樣裝置目前八頁(yè)\總數(shù)四十九頁(yè)\編于五點(diǎn)(4)高效分離柱

柱體為直型不銹鋼管，內(nèi)徑1～6mm，柱長(zhǎng)5～40cm。發(fā)展趨勢(shì)是減小填料粒度和柱徑以提高柱效。目前九頁(yè)\總數(shù)四十九頁(yè)\編于五點(diǎn)(5)液相色譜檢測(cè)器

a.紫外檢測(cè)器應(yīng)用最廣，對(duì)大部分有機(jī)化合物有響應(yīng)。特點(diǎn)：

靈敏度高；線形范圍寬；流通池可做的很小（1mm×10mm，容積8μL）；對(duì)流動(dòng)相的流速和溫度變化不敏感；波長(zhǎng)可選，易于操作；可用于梯度洗脫。

目前十頁(yè)\總數(shù)四十九頁(yè)\編于五點(diǎn)b.光電二極管陣列檢測(cè)器光電二極管陣列檢測(cè)器：1024個(gè)二極管陣列，各檢測(cè)特定波 長(zhǎng)，計(jì)算機(jī)快速處理，三維立體譜`圖，如圖所示。目前十一頁(yè)\總數(shù)四十九頁(yè)\編于五點(diǎn)目前十二頁(yè)\總數(shù)四十九頁(yè)\編于五點(diǎn)c.示差折光檢測(cè)器

除紫外檢測(cè)器之外應(yīng)用最多的檢測(cè)器；每種物質(zhì)具有不同的折光指數(shù)；可連續(xù)檢測(cè)參比池和樣品池中流動(dòng)相之間的折光指數(shù)差值。差值與濃度呈正比。目前十三頁(yè)\總數(shù)四十九頁(yè)\編于五點(diǎn)目前十四頁(yè)\總數(shù)四十九頁(yè)\編于五點(diǎn)d.熒光檢測(cè)器

高靈敏度、高選擇性；對(duì)多環(huán)芳烴，維生素B、黃曲霉素、卟啉類化合物、農(nóng)藥、藥物、氨基酸、甾類化合物等有響應(yīng)；激光誘導(dǎo)熒光(LIF)LaserInducedFluorescence體積小，適合毛細(xì)管柱目前十五頁(yè)\總數(shù)四十九頁(yè)\編于五點(diǎn)安培檢測(cè)器電導(dǎo)檢測(cè)器庫(kù)侖檢測(cè)器介電常數(shù)檢測(cè)器極譜檢測(cè)器e.電學(xué)和電化學(xué)檢測(cè)器：目前十六頁(yè)\總數(shù)四十九頁(yè)\編于五點(diǎn)1.流動(dòng)相特性（a）液相色譜的流動(dòng)相又稱為：淋洗液，洗脫劑。流動(dòng)相組成改變，極性改變，可顯著改變組分分離狀況；（b）親水性固定液常采用疏水性流動(dòng)相，即流動(dòng)相的極性小于固定相的極性，稱為正相液液色譜法，極性柱也稱正相柱。（c）若流動(dòng)相的極性大于固定液的極性，則稱為反相液液色譜，非極性柱也稱為反相柱。組分在兩種類型分離柱上的出峰順序相反。（6）液相色譜流動(dòng)相目前十七頁(yè)\總數(shù)四十九頁(yè)\編于五點(diǎn)2.流動(dòng)相類別

按流動(dòng)相組成分：?jiǎn)谓M分和多組分；按極性分：極性、弱極性、非極性；按使用方式分：固定組成淋洗和梯度淋洗。常用溶劑：己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、水。

采用二元或多元組合溶劑作為流動(dòng)相可以靈活調(diào)節(jié)流動(dòng)相的極性或增加選擇性，以改進(jìn)分離或調(diào)整出峰時(shí)間。目前十八頁(yè)\總數(shù)四十九頁(yè)\編于五點(diǎn)3.流動(dòng)相選擇

在選擇溶劑時(shí)，溶劑的極性是選擇的重要依據(jù)。

采用正相液-液分配分離時(shí)：首先選擇中等極性溶劑，若組分的保留時(shí)間太短，降低溶劑極性，反之增加。也可在低極性溶劑中，逐漸增加其中的極性溶劑，使保留時(shí)間縮短。

常用溶劑的極性順序：

水(最大)>甲酰胺>乙腈>甲醇>乙醇>丙醇>丙酮>二氧六環(huán)>四氫呋喃>甲乙酮>正丁醇>乙酸乙酯>乙醚>異丙醚>二氯甲烷>氯仿>溴乙烷>苯>四氯化碳>二硫化碳>環(huán)己烷>己烷>煤油(最小)目前十九頁(yè)\總數(shù)四十九頁(yè)\編于五點(diǎn)4.選擇流動(dòng)相時(shí)應(yīng)注意的幾個(gè)問(wèn)題（a）盡量使用高純度試劑作流動(dòng)相，防止微量雜質(zhì)長(zhǎng)期累積損壞色譜柱和使檢測(cè)器噪聲增加。（b）避免流動(dòng)相與固定相發(fā)生作用而使柱效下降或損壞 柱子。（如使固定液溶解流失；酸性溶劑破壞氧 化鋁固定相等。）（c）試樣在流動(dòng)相中應(yīng)有適宜的溶解度，防止產(chǎn)生沉 淀并在柱中沉積。（d）流動(dòng)相還應(yīng)滿足檢測(cè)器的要求。當(dāng)使用紫外檢測(cè) 器時(shí)，流動(dòng)相不應(yīng)有紫外吸收。目前二十頁(yè)\總數(shù)四十九頁(yè)\編于五點(diǎn)4.2.1.

液-固吸附色譜

liquid-solidadsorptionchromatography

固定相：為固體吸附劑，如硅膠、氧化鋁等，較常使用的是5～10m的硅膠吸附劑；

流動(dòng)相：各種不同極性的一元或多元溶劑。

基本原理：組分在固定相上的吸附與解吸；適用于分離相對(duì)分子質(zhì)量中等的油溶性試樣，對(duì)具有官能團(tuán)的化合物和異構(gòu)體有較高選擇性；

缺點(diǎn)：非線形等溫吸附常引起峰的拖尾；4.2主要分離類型與基本原理目前二十一頁(yè)\總數(shù)四十九頁(yè)\編于五點(diǎn)有機(jī)氯農(nóng)藥殘留量分析固定相：薄殼型硅膠(37～50m)

流動(dòng)相：正己烷流速：1.5mL/min

色譜柱：50cm2.5mm(內(nèi)徑)

檢測(cè)器：差示折光檢測(cè)器

可對(duì)水果、蔬菜中的農(nóng)藥殘留量進(jìn)行分析。目前二十二頁(yè)\總數(shù)四十九頁(yè)\編于五點(diǎn)4.2.2.

液-液分配色譜

liquid-liquidpartitionchromatography

固定相與流動(dòng)相均為液體（互不相溶）；

基本原理：組分在固定相和流動(dòng)相上的分配；

流動(dòng)相：對(duì)于親水性固定液，采用疏水性流動(dòng)相，即流動(dòng)相的極性小于固定液的極性（正相normalphase），反之，流動(dòng)相的極性大于固定液的極性（反相reversephase）。正相與反相的出峰順序相反。

常用溶劑的極性順序：

水(最大)>甲酰胺>乙腈>甲醇>乙醇>丙醇>丙酮>二氧六環(huán)>四氫呋喃>甲乙酮>正丁醇>乙酸乙酯>乙醚>異丙醚>二氯甲烷>氯仿>溴乙烷>苯>四氯化碳>二硫化碳>環(huán)己烷>己烷>煤油(最小)目前二十三頁(yè)\總數(shù)四十九頁(yè)\編于五點(diǎn)固定相：早期涂漬固定液，固定液流失，較少采用；液-液分配及離子對(duì)分離固定相

（1）全多孔型擔(dān)體由氧化硅、氧化鋁、硅藻土等制成的多孔球體；早期采用100μm的大顆粒，表面涂漬固定液，性能不佳已不多見(jiàn)；現(xiàn)采用10μm以下的小顆粒，化學(xué)鍵合制備柱填料；

（2）表面多孔型擔(dān)體

（薄殼型微珠擔(dān)體）30～40μm的玻璃微球，表面附著一層厚度為1～2μm的多孔硅膠。表面積小，柱容量底；目前二十四頁(yè)\總數(shù)四十九頁(yè)\編于五點(diǎn)

化學(xué)鍵合固定相:目前應(yīng)用最廣、性能最佳的固定相；a.硅氧碳鍵型：≡Si—O—C

b.硅氧硅碳鍵型：≡Si—O—Si—

Cc.硅碳鍵型：≡Si—Cd.硅氮鍵型：≡Si—N

穩(wěn)定，耐水、耐光、耐有機(jī)溶劑，應(yīng)用最廣（3）化學(xué)鍵合固定相：將各種不同基團(tuán)通過(guò)化學(xué)反應(yīng)鍵合到硅膠（擔(dān)體）表面的游離羥基上。

目前二十五頁(yè)\總數(shù)四十九頁(yè)\編于五點(diǎn)化學(xué)鍵合固定相的特點(diǎn)（1）傳質(zhì)快，表面無(wú)深凹陷，比一般液體固定相傳質(zhì)快；（2）壽命長(zhǎng)，化學(xué)鍵合，無(wú)固定液流失，耐流動(dòng)相沖擊；耐水、耐光、耐有機(jī)溶劑，穩(wěn)定；

（4）選擇性好，可鍵合不同官能團(tuán)，提高選擇性；（5）有利于梯度洗脫；存在著雙重分離機(jī)制：(鍵合基團(tuán)的覆蓋率決定分離機(jī)理)高覆蓋率：分配為主；低覆蓋率：吸附為主；

目前二十六頁(yè)\總數(shù)四十九頁(yè)\編于五點(diǎn)稠環(huán)芳烴的分析

稠環(huán)芳烴多為致癌物質(zhì)。固定相：十八烷基硅烷化鍵合相流動(dòng)相：20%甲醇-水～100%甲醇線性梯度淋洗，2%/min

流速：1mL/min

柱溫：50oC

柱壓：70104Pa

檢測(cè)器：紫外檢測(cè)器目前二十七頁(yè)\總數(shù)四十九頁(yè)\編于五點(diǎn)4.2.3.

離子交換色譜

ion-exchangechromatography

固定相：陰離子離子交換樹(shù)脂或陽(yáng)離子離子交換樹(shù)脂；

流動(dòng)相：陰離子離子交換樹(shù)脂作固定相，采用酸性水溶液；陽(yáng)離子離子交換樹(shù)脂作固定相，采用堿性水溶液；

基本原理：組分在固定相上發(fā)生的反復(fù)離子交換反應(yīng)；組分與離子交換劑之間親和力的大小與離子半徑、電荷、存在形式等有關(guān)。親和力大，保留時(shí)間長(zhǎng)。

陽(yáng)離子交換：R—SO3H+M+=R—SO3M+H+

陰離子交換：R—NR4OH+X-=R—NR4X+OH-

應(yīng)用：離子及可離解的化合物，氨基酸、核酸等。目前二十八頁(yè)\總數(shù)四十九頁(yè)\編于五點(diǎn)離子交換色譜分離固定相結(jié)構(gòu)類別：（1）薄殼型離子交換樹(shù)脂薄殼玻璃珠為擔(dān)體，表面涂約1%的離子交換樹(shù)脂；（2）離子交換鍵合固定相薄殼鍵合型；微粒硅膠鍵合型（鍵合離子交換基團(tuán)）樹(shù)脂類別：（1）陽(yáng)離子交換樹(shù)脂（強(qiáng)酸性、弱酸性）（2）陰離子交換樹(shù)脂（強(qiáng)堿性、弱堿性）目前二十九頁(yè)\總數(shù)四十九頁(yè)\編于五點(diǎn)4.2.4.離子對(duì)色譜

ionpairchromatography

原理：將一種（或多種）與溶質(zhì)離子電荷相反的離子（對(duì)離子或反離子）加到流動(dòng)相中使其與溶質(zhì)離子結(jié)合形成疏水性離子對(duì)化合物，使其能夠在兩相之間進(jìn)行分配；

陰離子分離：常采用烷基銨類，如氫氧化四丁基銨或氫氧化十六烷基三甲銨作為對(duì)離子；

陽(yáng)離子分離：常采用烷基磺酸類，如己烷磺酸鈉作為對(duì)離子；

反相離子對(duì)色譜：非極性的疏水固定相(C-18柱)，含有陽(yáng)離子Y+的甲醇-水或乙腈-水作為流動(dòng)相，試樣離子X(jué)-進(jìn)入流動(dòng)相后，生成疏水性離子對(duì)Y+X-后；在兩相間分配。目前三十頁(yè)\總數(shù)四十九頁(yè)\編于五點(diǎn)4.2.5.尺寸排斥色譜

size-exclusionchromatography

原理：按分子大小分離。小分子可以擴(kuò)散到凝膠空隙，由其中通過(guò)，出峰最慢；中等分子只能通過(guò)部分凝膠空隙，中速通過(guò)；而大分子被排斥在外，出峰最快；溶劑分子小，故在最后出峰。全部在死體積前出峰；可對(duì)相對(duì)分子質(zhì)量在100-105范圍內(nèi)的化合物按質(zhì)量分離目前三十一頁(yè)\總數(shù)四十九頁(yè)\編于五點(diǎn)M.W.tR目前三十二頁(yè)\總數(shù)四十九頁(yè)\編于五點(diǎn)M.W.tR目前三十三頁(yè)\總數(shù)四十九頁(yè)\編于五點(diǎn)M.W.tR目前三十四頁(yè)\總數(shù)四十九頁(yè)\編于五點(diǎn)M.W.tR目前三十五頁(yè)\總數(shù)四十九頁(yè)\編于五點(diǎn)4.2.6.親和色譜

Affinitychromatograph

原理：利用生物大分子和固定相表面存在的某種特異性親和力，進(jìn)行選擇性分離。先在載體表面鍵合上一種具有一般反應(yīng)性能的所謂間隔臂(環(huán)氧、聯(lián)胺等)，再連接上配基(酶、抗原等)，這種固載化的配基將只能和具有親和力特性吸附的生物大分子作用而被保留。改變淋洗液后洗脫。目前三十六頁(yè)\總數(shù)四十九頁(yè)\編于五點(diǎn)以無(wú)機(jī)、特別是無(wú)機(jī)陰離子混合物為主要分析對(duì)象,在七十年代出現(xiàn)、八十年代迅速發(fā)展。

傳統(tǒng)離子交換色譜存在著兩個(gè)難于解決的問(wèn)題：(1)需要高濃度淋洗液洗脫且洗脫時(shí)間很長(zhǎng)；(2)洗脫后的組分缺乏靈敏、快速的在線檢測(cè)方法。4.3離子色譜法目前三十七頁(yè)\總數(shù)四十九頁(yè)\編于五點(diǎn)1.離子色譜法原理離子交換原理，與傳統(tǒng)離子交換的不同點(diǎn)：采用交換容量非常低的特制離子交換樹(shù)脂為固定相；細(xì)顆粒柱填料，高柱效；采用高壓輸液泵；低濃度淋洗液或本底電導(dǎo)抑制（在分離柱后，采用抑制柱來(lái)消除淋洗液的高本底電導(dǎo)）；可采用電導(dǎo)檢測(cè)器，快速分離分析微量無(wú)機(jī)離子混合物；各種抑制裝置及無(wú)抑制方法的出現(xiàn)，發(fā)展迅速。目前三十八頁(yè)\總數(shù)四十九頁(yè)\編于五點(diǎn)離子色譜連續(xù)抑制裝置圖目前三十九頁(yè)\總數(shù)四十九頁(yè)\編于五點(diǎn)4．離子色譜的應(yīng)用陰離子分析:

雙柱；薄殼型陰離子交換樹(shù)脂分離柱(3×250mm),流動(dòng)相：0.003mol·L-1NaHCO3/0.0024mol·L-1Na2CO3，流量138mL/hr。七種陰離子在20分鐘內(nèi)基本上得到完全分離，各組分含量在3～50ppm。目前四十頁(yè)\總數(shù)四十九頁(yè)\編于五點(diǎn)1.概述

超臨界流體：在高于臨界壓力與臨界溫度時(shí)，物質(zhì)的一種狀態(tài)。性質(zhì)介于液體和氣體之間。超臨界流體色譜(SFC)，80年代快速發(fā)展，具有液相、氣相色譜不具有的優(yōu)點(diǎn):（1）可處理高沸點(diǎn)、不揮發(fā)試樣；（2）比LC有更高的柱效和分離效率。4.4超臨界色譜(SFC)SupercriticalFluidChromatograph目前四十一頁(yè)\總數(shù)四十九頁(yè)\編于五點(diǎn)2.超臨界流體性質(zhì)（1）性質(zhì)介于液體和氣體之間;

具有氣體的低黏度、液體的高密度，擴(kuò)散系數(shù)位于兩者之間。（2）可通過(guò)改變超臨界流體的密度（程序改變）調(diào)節(jié)組分分離（類似于氣相色譜的程序升溫，液相色譜中的梯度淋洗）。

超臨界流體的密度與壓力有關(guān)。目前四十二頁(yè)\總數(shù)四十九頁(yè)\編于五點(diǎn)3.原理SFC的流動(dòng)相：超臨界流體；CO2、N2O、NH3SFC的固定相：固體吸附劑（硅膠）或鍵合到載體（或毛細(xì)管壁）上的高聚物；可使用液相色譜的柱填料。填充柱SFC和毛細(xì)管柱SFC。分離機(jī)理：吸附與脫附。組分在兩相間的分配系數(shù)不同而被分離。通過(guò)調(diào)節(jié)流動(dòng)相的壓力（調(diào)節(jié)流動(dòng)相的密度），調(diào)整組分保留值。目前四十三頁(yè)\總數(shù)四十九頁(yè)\編于五點(diǎn)