深圳大學(xué)理科選修《遺傳學(xué)發(fā)現(xiàn)》課件重組DNA

重組DNA大腸埃希菌俗名大腸桿菌是人和動物腸道中最主要的細(xì)菌之一是正常菌群的成員出生后數(shù)小時(shí)就進(jìn)入腸道，并伴隨終生能合成維生素B和K，供人體利用能抑制腐敗菌及病原菌（如金黃色葡萄球菌、志賀菌屬）真菌（如白念珠菌）的過度增殖異位寄居時(shí)可引起腸外感染某些菌株有致病性—消化道感染，導(dǎo)致腹瀉等每個(gè)人每天平均從糞便中排出1011到1013個(gè)可作為糞便污染的檢測指標(biāo)常作為細(xì)菌的模式生物廣泛用于科學(xué)研究基因工程的工具菌生物學(xué)性狀形態(tài)與染色G-

桿菌，1~3μm（短桿菌）兩端鈍圓、無芽孢有周鞭毛有普通菌毛/性菌毛能運(yùn)動衛(wèi)生細(xì)菌學(xué)檢查大腸菌群指37OC24h內(nèi)發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣包括埃希菌屬、枸櫞酸桿菌屬、克雷伯菌屬及腸桿菌屬等大腸菌群指數(shù)指1000ml被檢樣品中的大腸菌群數(shù)生活飲用水的水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)coli-index≤3個(gè)我國2007年開始實(shí)施的衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定每100ml生活飲用水中，不得檢出總大腸菌群、耐熱大腸菌群和大腸埃希菌

1、細(xì)菌培養(yǎng)--平板培養(yǎng)劃線法培養(yǎng)涂布法培養(yǎng)大腸桿菌的培養(yǎng)限制性內(nèi)切酶EcoRI內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶:一種在特殊核甘酸序列處水解雙鏈DNA的內(nèi)切酶。Ⅰ型限制性內(nèi)切酶既能催化宿主DNA的甲基化，又催化非甲基化的DNA的水解；而Ⅱ型限制性內(nèi)切酶只催化非甲基化的DNA的水解。分子剪刀沃納?阿爾伯1929年生于瑞士。蘇黎士工科大學(xué)畢業(yè)后，在日內(nèi)瓦大學(xué)獲得博士學(xué)位。1971年起，任巴塞爾大學(xué)教授。在研究噬菌體的遺傳現(xiàn)象時(shí)，成功地分離出DNA的限制性酶和甲基化修飾酶，為此獲1978年諾貝爾生理學(xué)醫(yī)學(xué)獎。限制—修飾現(xiàn)象Kλ（B）λ（B）：能夠在大腸桿菌B菌株上生長的λ噬菌體第一次感染K菌株，形成的噬菌斑很少，生長受寄主限制Kλ（K）存活下來的噬菌體再次感染K菌株，則形成的噬菌斑很多，不受限制EOP:Efficiencyofplating（生長在不同寄主中的λ噬菌體的成斑率，表示限制程度）說明K和B菌株中存在一種限制系統(tǒng)可排除外來的DNA；10-4的存活率是由宿主限制系統(tǒng)作用的結(jié)果產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因何在甲基化酶：能使細(xì)胞自身核酸的內(nèi)切酶識別序列的堿基甲基化，從而使自身核酸免受內(nèi)切酶水解——細(xì)菌的“防御”系統(tǒng)核酸內(nèi)切酶：識別并水解外源DNA（外來核酸在內(nèi)切酶識別序列上沒有甲基化修飾作保護(hù)）研究發(fā)現(xiàn)：原來是由兩種酶配合完成，一種是起修飾作用的甲基化酶，另一種是核酸內(nèi)切酶限制修飾限制—修飾體系Kλ（B）λ（K）λ（B）：能夠在大腸桿菌B菌株上生長的λ噬菌體Kλ（K）再次感染K菌株，則形成的噬菌斑很多，不受限制（K菌株已經(jīng)對其進(jìn)行了修飾）λ（B）噬菌體感染大腸桿菌K菌株后，其DNA大部分被內(nèi)切酶降解了，但有極少部分能在特定序列甲基化，避免被酶解，因此有少量噬菌斑形成。在限制修飾系統(tǒng)中，限制作用是指一定類型的細(xì)菌可以通過限制性酶的作用，破壞入侵的外源DNA（如噬菌體DNA等），使得外源DNA對生物細(xì)胞的入侵受到限制；

而宿主細(xì)胞自身的DNA分子合成后，通過修飾酶的作用：在堿基中特定的位置上發(fā)生了甲基化而得到了修飾，可免遭自身限制性酶的破壞，這就是限制修飾系統(tǒng)中修飾作用的含義。限制—修飾體系，其功能就是保護(hù)自身的DNA，分解外來的DNA，以保護(hù)和維持自身遺傳信息的穩(wěn)定，這對細(xì)菌的生存和繁衍具有重要意義。分類核酸外切酶核酸內(nèi)切酶核酸酶從核酸鏈的一端開始，一個(gè)接一個(gè)地消化降解核苷酸從核酸鏈分子內(nèi)部切割3’，5’磷酸二酯鍵，使之?dāng)嗔研纬尚∑魏怂醿?nèi)切酶：按限制性酶的組成、限制和修飾活性、切斷核酸的情況不同，分三類（I，II，III），通常指的是II型。

命名法HindIII同一菌株中所含的多個(gè)不同的限制性核酸內(nèi)切酶如從流感嗜血桿菌d菌株（Haemophilusinfluenzaed）先后發(fā)現(xiàn)3種限制性酶，則分別命名為HindI，HindII，HindIII大腸桿菌R菌株REscherichia嗜血流感桿菌d株dinfflluenzaeHaemophiillus株名（型號）種名的頭兩個(gè)字母宿主屬名的第一個(gè)字母coli前3個(gè)字母代表來源的生物隨后1個(gè)字母或阿拉伯?dāng)?shù)字代表菌株最后1個(gè)羅馬字母代表發(fā)現(xiàn)或鑒定的次序

基本雀特征識別遼并切團(tuán)割雙繁鏈DN槽A（環(huán)塑狀或貴線狀躲）分飛子中4-唉8b昌p的特勻定序駐列結(jié)構(gòu)樹特征手：旋叢轉(zhuǎn)對跨稱的徑回文升結(jié)構(gòu)切割限后產(chǎn)查生的凳末端誓：Co糧he居si南ve氧t套er備mi劈燕nu屢s言or泊B悔lu濟(jì)nt雨e酷nd（粘朗性末聾端或牢平末宅端）Ec精oRI的識桑別序抗列5’譜…G概C械TG鍵A遲A成T火T瘡CG稅A容G浩…滿3’3’貪…C導(dǎo)G樣AC敗T捆T柱A樓A籍GC習(xí)T波C首…山5’Ec誦oRI的切刃割位帽點(diǎn)質(zhì)粒質(zhì)粒兆是一仿種染色錢體外的學(xué)穩(wěn)定況遺傳魚因子缺，大劣小從1~菊20合0k挽b不等煙，為疼雙鏈罩、閉茅環(huán)的DN偉A分子，并切以超螺枯旋狀態(tài)悅存在匯于宿主著細(xì)胞中。洗質(zhì)粒駱主要掃發(fā)現(xiàn)悶于細(xì)菌、放線孝菌和真菌細(xì)胞撫中，額它具麥有自球主復(fù)制和轉(zhuǎn)錄能力箭，能畜在子藝代細(xì)胞中保麥持恒殊定的刷拷貝穩(wěn)數(shù)，刮并表權(quán)達(dá)所助攜帶斜的遺傳嗎信息。質(zhì)脅粒的凡復(fù)制賊和轉(zhuǎn)酷錄要肉依賴任于宿洽主細(xì)裕胞編輸碼的是某些做酶和蛋白巴質(zhì)，如松離開也宿主啦細(xì)胞船則不場能存餃活，膀而宿主即使篩沒有濫它們辜也可貴以正飄常存攏活。極質(zhì)粒淺的存棒在使臟宿主躺具有滴一些蛋額外毀的特境性，盲如對克抗生素素的都抗性隨等。萊德渠伯格接（19缺25尾~2馬00部8），握美國考遺傳果學(xué)家喝。細(xì)菌巷遺傳招學(xué)的具創(chuàng)始烘人之姨一。19速25年5月23日生膜于美器國蒙舌特克拜萊市兔。19下44年獲哥倫匆比亞內(nèi)大學(xué)學(xué)士陽學(xué)位之，以盆后曾摸在醫(yī)能學(xué)院斃學(xué)習(xí)部，不釘久轉(zhuǎn)結(jié)入耶魯樹大學(xué)，于19厭47年獲誦博士憲學(xué)位點(diǎn)。19粱59年起輩任斯坦霧福醫(yī)剪學(xué)院教授侮兼遺承傳學(xué)翼系主提任。19燙62年任累肯尼跑迪分載子醫(yī)扒學(xué)實(shí)很驗(yàn)室菠主任淋。他在最耶魯角大學(xué)繭期間冊，發(fā)叫現(xiàn)細(xì)菌徹的遺厭傳重捐組。19歪46年，悔他和E.投L.塔特獅姆發(fā)現(xiàn)旦遺傳帝重組誰的普畜遍性燈。19孤52年發(fā)控現(xiàn)細(xì)蔽菌的F因子。19晶52年發(fā)圖現(xiàn)沙會門氏藝菌中渣的普寇遍性環(huán)轉(zhuǎn)導(dǎo)涌，19元53年發(fā)包現(xiàn)大腸持桿菌的溫辱和噬絮菌體λ在染蘭色體腦上占那有一志定位溉置。19屋56年發(fā)削現(xiàn)λ噬菌松體能劫進(jìn)行貢局限枝性轉(zhuǎn)俘導(dǎo)。摔他們佩的研宴究工抽作還駱包括陽應(yīng)用門細(xì)菌惕的有酒性生議殖和懷轉(zhuǎn)導(dǎo)跨進(jìn)行址細(xì)菌咸的免粱疫學(xué)知和代亂謝作價(jià)用等譜方面竹的研百究。19堵58年他糧和G.包W.比德膝爾和E.鞋L.塔特稍姆共排同獲健得諾晝貝爾兼生理假學(xué)或拿醫(yī)學(xué)臥獎。接合腥現(xiàn)象創(chuàng)的發(fā)撒現(xiàn)接合答：指通羊過細(xì)續(xù)菌細(xì)知胞的此直接囑接觸蒼，遺延傳物悟質(zhì)從供體轉(zhuǎn)移藍(lán)到受體并發(fā)拜生重悲組的蔥過程塘。19魚46年萊德語伯格和塔瓜特姆發(fā)現(xiàn)雅了細(xì)菌盲的接慮合。細(xì)菌鉤的雜俊交實(shí)疲例（19鈴46）不同遺營養(yǎng)皇缺陷置型的懷大腸統(tǒng)桿菌填（K1棗2）：A菌株計(jì)：me稿t-bi恢o-th鍬r+le版u+th掩i+，B菌株濟(jì)：me秧t+bi云o+th屯r-le聰u-th閑i-這種宅野生字型細(xì)欄胞如綢何出趁現(xiàn)的凡？U型管矮實(shí)驗(yàn)垂：A、B菌株駁分別壞培養(yǎng)裳在基診本培乳養(yǎng)基饅上一邊軟加壓憤和吸伴引使曠培養(yǎng)武液充散分混遺合結(jié)果困任何福一臂啦的培譜養(yǎng)基都上均煉未長唉出野果生型部細(xì)菌另。結(jié)論子：菌輸株A與菌治株B細(xì)胞勿直接釣接觸旨（接蠻合）肥是野俱生型感細(xì)胞嘆出現(xiàn)爹的必壩要條弟件；過兩菌淚株直塵接接技觸后洗導(dǎo)致械遺傳胸物質(zhì)鑒轉(zhuǎn)移自，進(jìn)扛而發(fā)稠生基權(quán)因重錢組，聰產(chǎn)生停野生悶型細(xì)處菌。試驗(yàn)?zāi)_證明址：接合僻過程誓是一案種單向棍轉(zhuǎn)移，A菌株且遺傳洲物質(zhì)B菌株努，從藍(lán)供體訴到受芽體。用大貓腸桿污菌K1煩2的菌粥株A和菌后株B，首毯先用智高劑茶量的鏈霉良素處理具菌株A或菌隆株B，把鉛處理如過的視菌株A跟未胡處理它過的拌菌株B混合示，或聰把處門理過鳳的菌庸株B跟未兄處理甜過的著菌株A混合色，發(fā)胖現(xiàn)結(jié)駱果大濕不相上同：⑴到F因子盒：致宏育因昌子或毯稱性猛因子翅，是桶一種醉附加重體。攜帶F因子閣的菌依株稱即為供翼體菌簡或雄有性，束用F＋表示壤。未攜拿帶F因子叛的菌自株為唉受體踢菌或功雌性摸，用F－表示筋。F因子團(tuán)及F＋向F－的轉(zhuǎn)恨移⑵削F因子霧的結(jié)真構(gòu)染色魚體外騰遺傳慮物質(zhì)鳳（質(zhì)刑粒）堂，環(huán)厘狀DN眠A，9×1會04bp，大德約為庸大腸氣桿菌敗環(huán)狀寄染色午體的2%，具無有40教~6貸0個(gè)蛋怕白質(zhì)你基因烘。每個(gè)荒細(xì)胞鏟（F＋）有2~毒4個(gè)。F因子顧分為我三個(gè)調(diào)區(qū)域援：自主勞復(fù)制擋區(qū)：有殿轉(zhuǎn)移蠢的起夢點(diǎn)和2個(gè)復(fù)統(tǒng)制起民點(diǎn)。姓復(fù)制住起點(diǎn)Or術(shù)iT是在膀染色貫體轉(zhuǎn)炕移時(shí)譜進(jìn)行滾環(huán)慰復(fù)制時(shí)的遙復(fù)制解起點(diǎn)煮；Or國iV是在司營養(yǎng)愿時(shí)期形，即涼游離辯在細(xì)湊胞質(zhì)行中獨(dú)立捎復(fù)制時(shí)的動復(fù)制擇起點(diǎn)續(xù)。轉(zhuǎn)移雞區(qū)：主思要有栽合成性傘兄毛即F纖毛（Fpi宗li）的殊操縱猜子。F纖毛役是由衫性傘毛桐蛋白會構(gòu)成遙，呈勸管狀隙，又貧叫接弊合管球。通釘過接鎖合管揪可將奏供體少和受失體細(xì)奸胞相斷聯(lián)。肆共30震kb長，郵有40個(gè)基綁因與DN致A的轉(zhuǎn)缺移有管關(guān)。重組念區(qū)：有4個(gè)插超入順東序（IS），遣通過縱和宿臘主染督色體上的IS同源篇重組睜或通迎過轉(zhuǎn)魚座，F(xiàn)因子聲可以妙整合播到宿坡主不也同位千點(diǎn)上驕。⑶蠻F因子旱的三協(xié)種狀致態(tài)②有一圈個(gè)自自主狀僅態(tài)的F因子子，即F＋細(xì)胞才；③帶有州一個(gè)售整合睜的F因子從的細(xì)缺胞叫高頻盈重組兼細(xì)胞，Hf路r細(xì)胞約。①沒有F因子櫻，即F－細(xì)胞螺；F＋與F－菌（1）有F因子變的細(xì)則菌稱謀為F＋，細(xì)獅菌增麗殖時(shí)許可把F因子貨傳遞能給后塞代細(xì)彩胞（漠通過字自主密復(fù)制迷）。（2）沒室有F因子歲的細(xì)肢菌稱新為F－，F(xiàn)＋細(xì)菌襪經(jīng)吖羽啶橙處財(cái)理而掏丟失星，成櫻為F－。F因子脾一經(jīng)露丟失纏，細(xì)胞霉中便鑄不再被出現(xiàn)壩；（3）F＋可以澆和F－雜交刻，而暴不能丸和F＋雜交輕；（4）F＋菌與F－菌混租合（層即F＋×F－）1小時(shí)隨后，獄約95哄%的F－菌轉(zhuǎn)啞變?yōu)镕＋菌，綠而原幼來的F＋仍然照保留疫有F因子友。(1隊(duì))伍F纖毛扎合成屈：由性傘橋毛蛋苦白構(gòu)成相，接合梢管使供夢體和兩受體斤細(xì)胞圓接觸顆。(2膀)轉(zhuǎn)移劉啟動疲：F因子握從轉(zhuǎn)裕移復(fù)謎制起于點(diǎn)(Or生iT)開始客向F－轉(zhuǎn)移嘴（5’端首鈴先進(jìn)際入受吩體）。(3姑)單鏈臣轉(zhuǎn)移證，滾顛環(huán)復(fù)倆制。F纖毛剛與接熱合管F＋×F－Hf即r是F因子堪整合銜到E.腔co抱li染色饞體上趕的結(jié)鼻果E.辱co疏li染色扯體上愚有20個(gè)以誤上的萄整合田位點(diǎn)園；整合太通過IS等同蜜源重厚組或駕轉(zhuǎn)座鹽實(shí)現(xiàn)負(fù)；F因子矮有多谷個(gè)整翻合位香點(diǎn)，徑主要熱在IS蹦3處。分子堆克隆pU士C1畏8pU福C1蜘9含四孕個(gè)部沫分：（1）來著自pB墻R3飛22的質(zhì)月粒復(fù)池制起匪點(diǎn)（or獲i）；（2）am桃pr;（3）大碌腸桿謠菌β半乳洲糖苷搶酶基瓦因（la剛cZ’）的脆啟動冬子及置其編蜻碼α-肽鏈拆的DN館A序列損；（4）多果克隆座位點(diǎn)歸（MC媽S）la絨cZ`Or粒iAm豎prMC訊S藍(lán)白逝斑篩卵選重綱組子芹的原瓜理：la好cZ’編碼β半乳框糖苷光酶的α肽，饞在異危丙基惜硫代-梨β-團(tuán)D-半乳睛糖苷圾（IP左TG）的廢誘導(dǎo)他下，懲使呈惡色底補(bǔ)物5-溴-4包-氯-3林-吲哚-晝β-層D-半乳鑄糖苷導(dǎo)（X-奔ga償l）被躁分解絞產(chǎn)生接藍(lán)色勸。因案此攜鉗帶空順載體錘的大脅腸桿泰菌呈聚藍(lán)色斗菌落斃。外源璃基因泡的插淹入使α肽失委活，董因而癥攜帶蹲外源蹦基因盛的重鋤組子攀菌落捎呈白煙色。利用態(tài)菌落咸顏色評篩選溉重組詠?zhàn)覲U干C質(zhì)粒折載體離的優(yōu)宇點(diǎn)：基因葡組小率，拷逼貝數(shù)洪高，DN籃A產(chǎn)量吧高；有La媽cZ篩選胞標(biāo)記六，La姜cZ基因澡插入賠失