醫(yī)學(xué)專題-CD147在胃癌細(xì)胞SGC7901增殖

RNA干擾抑制CD147表達(dá)對(duì)人胃癌細(xì)胞(xìbāo)SGC7901增殖、侵襲和順鉑敏感性的影響王書奎MD,PhD南京醫(yī)科大學(xué)附屬(fùshǔ)南京第一醫(yī)院第一頁(yè)，共四十九頁(yè)。編輯課件報(bào)告(bàogào)內(nèi)容研究背景(bèijǐng)研究目標(biāo)實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果實(shí)驗(yàn)結(jié)論第二頁(yè)，共四十九頁(yè)。編輯課件一、研究(yánjiū)背景第三頁(yè)，共四十九頁(yè)。編輯課件胃癌(wèiái)概況

胃癌最常見的惡性腫瘤之一，惡性腫瘤致死占第二位。其惡性程度較高，轉(zhuǎn)移擴(kuò)散嚴(yán)重，多數(shù)患者(huànzhě)就診時(shí)已屬中晚期，因而死亡率較高。第四頁(yè)，共四十九頁(yè)。編輯課件MMP簡(jiǎn)介(jiǎnjiè)

腫瘤的侵襲(qīnxí)和轉(zhuǎn)移是一個(gè)復(fù)雜的過程，其中細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜的降解是腫瘤轉(zhuǎn)移過程中的重要步驟。這與細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白酶（extracellularmatrixmetalloproteinase，MMP）的參與密不可分。第五頁(yè)，共四十九頁(yè)。編輯課件

MMP是一個(gè)鋅離子依賴的蛋白酶家族，目前已發(fā)現(xiàn)26種。MMP的主要功能是降解細(xì)胞外基質(zhì)。腫瘤(zhǒngliú)細(xì)胞利用MMP的基質(zhì)降解能力遷移到其他部位。在腫瘤與間質(zhì)交界處，MMP往往高表達(dá)。第六頁(yè)，共四十九頁(yè)。編輯課件

20世紀(jì)80年代，Biswas實(shí)驗(yàn)室從人肺癌細(xì)胞株LX-1的細(xì)胞膜上分離得到(dédào)了一種58kDa的糖蛋白，具有刺激成纖維細(xì)胞合成MMP-1的功能，將其命名為腫瘤膠原酶刺激因子（tumorcollagenasestimulatingfactor，TCSF）。第七頁(yè)，共四十九頁(yè)。編輯課件

進(jìn)一步研究表明TCSF不僅能刺激MMP-1的產(chǎn)生，還能刺激MMP-2、MMP-3、MMP-9和MMP-11等的產(chǎn)生，因此將其重命名為細(xì)胞外基質(zhì)金屬酶誘導(dǎo)因子（extracellularmatrixmetalloproteinaseinducer，EMMPRIN)。第六屆人類白細(xì)胞分化抗原協(xié)作組會(huì)議(huìyì)將EMMPRIN命名為CD147。第八頁(yè)，共四十九頁(yè)。編輯課件CD147的結(jié)構(gòu)(jiégòu)

CD147屬單次跨膜糖蛋白，胞外段中的4個(gè)半胱氨酸殘基形成2個(gè)二硫鍵，構(gòu)成(gòuchéng)2個(gè)典型的半球形Ig結(jié)構(gòu)域。

第九頁(yè)，共四十九頁(yè)。編輯課件

細(xì)胞內(nèi)的CD147存在低糖基化（lowglycosylatedCD147，LG）和高糖基化（highglycosylatedCD147，HG）形式，分子量分別(fēnbié)是32~44kDa、45~65kDa。只有HG形式能刺激MMP的產(chǎn)生。第十頁(yè)，共四十九頁(yè)。編輯課件CD147的功能(gōngnéng)

CD147是一種廣泛表達(dá)于細(xì)胞表面，在體內(nèi)分布(fēnbù)廣泛，參與精子發(fā)生、胚胎發(fā)育、腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移、炎癥反應(yīng)、病毒感染等多種生理和病理過程，是一個(gè)多功能的分子。第十一頁(yè)，共四十九頁(yè)。編輯課件

免疫組化實(shí)驗(yàn)證實(shí)CD147在多種惡性腫瘤(èxìngzhǒngliú)中高表達(dá)，包括膀胱癌、皮膚癌、肺癌、乳腺癌、淋巴癌和胰腺癌等。并且腫瘤的惡性程度越高，CD147的表達(dá)水平也越高。第十二頁(yè)，共四十九頁(yè)。編輯課件CD147在腫瘤發(fā)生發(fā)展(fāzhǎn)中的作用

1.促進(jìn)腫瘤(zhǒngliú)的侵襲和轉(zhuǎn)移

CD147就是通過刺激成纖維細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞本身產(chǎn)生多種MMP來降解基底膜和細(xì)胞外基質(zhì)，從而促進(jìn)腫瘤的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移的。第十三頁(yè)，共四十九頁(yè)。編輯課件

2.誘導(dǎo)腫瘤血管(xuèguǎn)生成

血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascularendothelialgrowth

factor，VEGF）是很多情況下血管生成過程的主要調(diào)節(jié)因子，包括腫瘤形成過程。CD147可以誘導(dǎo)VEGF的表達(dá)。第十四頁(yè)，共四十九頁(yè)。編輯課件

3.促進(jìn)腫瘤細(xì)胞多藥耐藥

在多種多藥耐藥的腫瘤細(xì)胞中都觀察到CD147的高表達(dá)。CD147可激活(jīhuó)PI3K/AKT細(xì)胞存活信號(hào)通路。在大多數(shù)惡性腫瘤細(xì)胞中此通路均被激活。第十五頁(yè)，共四十九頁(yè)。編輯課件胃癌(wèiái)中CD147的表達(dá)

日本Toyama大學(xué)的ZhengHC等研究表明：在正常胃黏膜發(fā)展為增生性或化生性胃黏膜，最后(zuìhòu)發(fā)展為胃癌的過程中，CD147的表達(dá)量是逐漸增加的，并且CD147的表達(dá)與腫瘤大小、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及MMP-2、MMP-9和VEGF的表達(dá)呈正相關(guān)。第十六頁(yè)，共四十九頁(yè)。編輯課件胃癌組織(zǔzhī)中CD147的表達(dá)CD147在胃癌組織(zǔzhī)中高表達(dá)第十七頁(yè)，共四十九頁(yè)。編輯課件二.研究(yánjiū)目標(biāo)第十八頁(yè)，共四十九頁(yè)。編輯課件

本實(shí)驗(yàn)旨在運(yùn)用RNA干擾技術(shù)抑制胃癌細(xì)胞株SGC7901中CD147基因的表達(dá)，研究該基因沉默后對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、侵襲能力(nénglì)及化療藥物敏感性的影響，探討CD147在胃癌中的作用。第十九頁(yè)，共四十九頁(yè)。編輯課件三、研究(yánjiū)方法及結(jié)果第二十頁(yè)，共四十九頁(yè)。編輯課件CD147shRNA真核表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定↓轉(zhuǎn)染SGC7901細(xì)胞，篩選穩(wěn)定表達(dá)干擾載體的SGC7901細(xì)胞株↓MTT法檢測(cè)SGC7901細(xì)胞增殖水平的變化↓明膠酶譜法檢測(cè)SGC7901細(xì)胞MMP-2、MMP-9分泌(fēnmì)的變化↓SGC7901細(xì)胞體外侵襲力測(cè)定↓MTT檢測(cè)SGC7901細(xì)胞順鉑敏感性的變化技術(shù)(jìshù)路線技術(shù)路線第二十一頁(yè)，共四十九頁(yè)。編輯課件

胃癌細(xì)胞株SGC7901源自一位56歲女性胃腺癌患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移瘤。研究表明(biǎomíng)其侵襲能力強(qiáng)，惡性程度高。我們前期研究表明(biǎomíng)，該細(xì)胞表面CD147是高表達(dá)的。第二十二頁(yè)，共四十九頁(yè)。編輯課件shRNA（shorthairpinRNA）表達(dá)載體(zàitǐ)的構(gòu)建pSilencer3.1-H1neo第二十三頁(yè)，共四十九頁(yè)。編輯課件shRNA模板(múbǎn)的設(shè)計(jì)示意圖第二十四頁(yè)，共四十九頁(yè)。編輯課件干擾(gānrǎo)靶序列的選擇

參考陳翔等的報(bào)道，選取CD147mRNA370-390和808-828作為靶序列，相應(yīng)的shRNA分別命名為shRNA1和shRNA2。另外，設(shè)計(jì)一個(gè)陰性(yīnxìng)對(duì)照shRNA-control。第二十五頁(yè)，共四十九頁(yè)。編輯課件RNAi靶序列(xùliè)在CD147mRNA上的位置

1AGCGGTTGGAGGTTGTAGGACCGGCGAGGAATAGGAATCATGGCGGCTGC51GCTGTTCGTGCTGCTGGGATTCGCGCTGCTGGGCACCCACGGAGCCTCCG101GGGCTGCCGGCACAGTCTTCACTACCGTAGAAGACCTTGGCTCCAAGATA151CTCCTCACCTGCTCCTTGAATGACAGCGCCACAGAGGTCACAGGGCACCG201CTGGCTGAAGGGGGGCGTGGTGCTGAAGGAGGACGCGCTGCCCGGCCAGA251AAACGGAGTTCAAGGTGGACTCCGACGACCAGTGGGGAGAGTACTCCTGC301GTCTTCCTCCCCGAGCCCATGGGCACGGCCAACATCCAGCTCCACGGGCC351TCCCAGAGTGAAGGCTGTGAAGTCGTCAGAACACATCAACGAGGGGGAGA401CGGCCATGCTGGTCTGCAAGTCAGAGTCCGTGCCACCTGTCACTGACTGG451GCCTGGTACAAGATCACTGACTCTGAGGACAAGGCCCTCATGAACGGCTC501CGAGAGCAGGTTCTTCGTGAGTTCCTCGCAGGGCCGGTCAGAGCTACACA551TTGAGAACCTGAACATGGAGGCCGACCCCGGCCAGTACCGGTGCAACGGC601ACCAGCTCCAAGGGCTCCGACCAGGCCATCATCACGCTCCGCGTGCGCAG651CCACCTGGCCGCCCTCTGGCCCCTCCTGGGCATCGTGGCTGAGGTGCTGG701TGCTGGTCACCATCATCTTCATCTACGAGAAGCGCCGGAAGCCCGAGGAC751GTCCTGGATGATGACGACGCCGGCTCTGCACCCCTGAAGAGCAGCGGGCA801GCACCAGAATGACAAAGGCAAGAACGTCCGCCAGAGGAACTCTTCCTGAG851GCAGGTGGCCCGAGGACGCTCCCTGCTCCACGTCTGCGCCGCCGCCGGAG901TCCACTCCCAGTGCTTGCAAGATTCCAAGTTCTCACCTCTTAAAGAAAAC951CCACCCCGTAGATTCCCATCAT第二十六頁(yè)，共四十九頁(yè)。編輯課件設(shè)計(jì)(shèjì)好的shRNA插入序列shRNA15'-GATCCGTCGTCAGAACACATCAACTTCAAGAGAGTTGATGTGTTCTGACGACTTTTTTGGAAA-3’5'-AGCTTTTCCAAAAAAGTCGTCAGAACACATCAACTCTCTTGAAGTTGATGTGTTCTGACGACG-3'shRNA2

5'GATCCGTGACAAAGGCAAGAACGTCTTCAAGAGAGACGTTCTTGCCTTTGTCATTTTTTGGAAA-3’5'AGCTTTTCCAAAAAATGACAAAGGCAAGAACGTCTCTCTTGAAGACGTTCTTGCCTTTGTCACG-3’shRNA-control5‘GATCCACTACCGTTGTTATAGGTGTTCAAGAGACACCTATAACAACGGTAGTTTTTTTGGAAA-3'5'AGCTTTTCCAAAAAAACTACCGTTGTTATAGGTGTCTCTTGAACACCTATAACAACGGTAGTG-3’第二十七頁(yè)，共四十九頁(yè)。編輯課件2、CD147shRNA表達(dá)(biǎodá)載體的構(gòu)建：

將合成的三對(duì)片段分別用水浴中加熱后退火備用(bèiyòng)，與經(jīng)BamHI和HindIII雙酶切的pSilencer3.1-neo質(zhì)粒連接，構(gòu)建成CD147shRNA表達(dá)載體，重組質(zhì)粒分別命名為pSilencer-shRNA1，pSilencer-shRNA2和pSilencer-shRNA-control。第二十八頁(yè)，共四十九頁(yè)。編輯課件重組質(zhì)粒測(cè)序鑒定(jiàndìng)結(jié)果DNA測(cè)序表明，3個(gè)重組質(zhì)粒構(gòu)建(ɡòujiàn)正確。pSilencer/shRNA1測(cè)序圖（紅線為插入片段）第二十九頁(yè)，共四十九頁(yè)。編輯課件轉(zhuǎn)染及篩選(shāixuǎn)

脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染48h后用含0.4μg/ml的G418的完全(wánquán)培養(yǎng)基篩選2周，然后改為半量維持。將抗G418的陽性細(xì)胞克隆用有限稀釋法分離出來并逐步擴(kuò)增以待進(jìn)一步分析。篩選出的細(xì)胞克隆分別命名為SGC7901/shRNA1，SGC7901/shRNA2和SGC7901/shRNA-control。第三十頁(yè)，共四十九頁(yè)。編輯課件Real-timePCR檢測(cè)(jiǎncè)CD147mRNA表達(dá)水平

與SGC7901相比，SGC7901/shRNA1和SGC7901/shRNA2細(xì)胞中CD147mRNA相對(duì)表達(dá)(biǎodá)量分別下降至72.4%和17.3%

。第三十一頁(yè)，共四十九頁(yè)。編輯課件1234HGLGCD147β-actinLane1:SGC7901.Lane2:SGC7901/shRNA-controlLane3:SGC7901/shRNA1Lane4:SGC7901/shRNA2HG代表(dàibiǎo)高糖基化形式的CD147，LG代表低糖基化形式的CD147。Westernblot結(jié)果與Real-timePCR結(jié)果相符。第三十二頁(yè)，共四十九頁(yè)。編輯課件接種細(xì)胞

培養(yǎng)細(xì)胞

加入MTT呈色

終止培養(yǎng)

比色

結(jié)果計(jì)算

抑制率(%)=(對(duì)照組A值-實(shí)驗(yàn)組A值)／對(duì)照組A值×100%

24h、48h、72h時(shí)間(shíjiān)點(diǎn)MTT細(xì)胞增殖(zēngzhí)實(shí)驗(yàn)第三十三頁(yè)，共四十九頁(yè)。編輯課件

與SGC7901和SGC7901/shRNA-control相比，培養(yǎng)24h、48h、72h后SGC7901/shRNA2細(xì)胞增殖(zēngzhí)能力均顯著降低.而陰性對(duì)照組SGC7901/shRNA-control增殖能力無顯著改變。第三十四頁(yè)，共四十九頁(yè)。編輯課件明膠酶譜法檢測(cè)(jiǎncè)細(xì)胞上清中MMP-2和MMP-9的活性

明膠酶包括72kDa的明膠酶A（基質(zhì)金屬蛋白酶-2，MMP-2）和92kDa的明膠酶B(基質(zhì)金屬蛋白酶-9，MMP-9)。其作用底物(dǐwù)為基底膜中的Ⅳ型膠原和變性的間質(zhì)膠原（明膠），其活性與腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力密切相關(guān)。第三十五頁(yè)，共四十九頁(yè)。編輯課件

明膠酶譜法是一種測(cè)定明膠酶活性的常用方法。收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法可將這兩種明膠酶按分子量大小分開，顯示兩條負(fù)染條帶，根據(jù)條帶的面積(miànjī)和亮度可判定明膠酶的活性。第三十六頁(yè)，共四十九頁(yè)。編輯課件明膠(mínɡjiāo)酶譜結(jié)果MMP-2MMP-9

123Lane1:SGC7901.Lane2:SGC7901/shRNA-control.Lane3:SGC7901/shRNA2**BSGC7901/shRNA2細(xì)胞(xìbāo)上清液中MMP-2和MMP-9的活性明顯降低第三十七頁(yè)，共四十九頁(yè)。編輯課件Transwell原理(yuánlǐ)

Matrigel是從小鼠EHS肉瘤中提取的基質(zhì)(jīzhì)成分，含有層粘連蛋白、Ⅳ型膠原等。將Matrigel鋪在Transwell侵襲小室的多孔濾膜上，能形成與天然基底膜極為相似的基底膜結(jié)構(gòu)。第三十八頁(yè)，共四十九頁(yè)。編輯課件Transwell結(jié)果(jiēguǒ)穿過Transfer侵襲(qīnxí)小室的染成紫色的細(xì)胞（×400）SGC7901SGC7901/shRNA-controlSGC7901/shRNA2第三十九頁(yè)，共四十九頁(yè)。編輯課件SGC7901/shRNA2細(xì)胞(xìbāo)體外侵襲能力顯著降低B*第四十頁(yè)，共四十九頁(yè)。編輯課件順鉑敏感性實(shí)驗(yàn)(shíyàn)

抗腫瘤藥物(yàowù)順鉑的使用濃度以血漿峰濃度（Peak

PlasmaConcentration，PPC)為標(biāo)準(zhǔn)。參照Sondak等的報(bào)道，順鉑的PPC為3.0μg/ml。本實(shí)驗(yàn)中使用的順鉑濃度為：0.01PPC，0.1PPC，10PPC。細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率（%）=[1-OD(cisplatin＋）/OD(cisplatin－)]×100%第四十一頁(yè)，共四十九頁(yè)。編輯課件

與SGC7901和SGC7901/shRNA-control相比(xiānɡbǐ)，順鉑對(duì)SGC7901/shRNA2的抑制率顯著增加***第