瓊脂糖凝膠電泳

AgaroseGelElectrophoresis

瓊脂糖凝膠電泳2023/5/221Aftertheexperimentisfinished,studentsshouldknowhowtomakeanagarosegel.

掌握瓊脂糖凝膠電泳的操作的方法。一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?ExperimentalPurpose)2023/5/222Gelelectrophoresis2023/5/223二、實(shí)驗(yàn)原理(ExperimentalPrinciple)Electrophoresisisatechniqueusedtoseparateandsometimespurifyproteinsandnucleicacids,whichdifferinsize,chargeorconformationfromeachother.Electrophoresishasbecomethemostwidelyusedtechniquesinbiochemistryandmolecularbiology.電泳常用于分離和純化那些分子大小、電荷性狀或分子構(gòu)象有所不同的生物大分子——尤其是蛋白質(zhì)和核酸。正因?yàn)槿绱?，電泳已成為生物化學(xué)和分子生物學(xué)中應(yīng)用最為廣泛的技術(shù)之一。2023/5/224Agaroseisapolysaccharideextractedfromseaweed.Agarosegelshavealargerangeofseparation,butrelativelylowresolvingpower.Byvaryingtheconcentrationofagarose,fragmentsofDNAfromabout200to50,000bpcanbeseparatedusingstandardelectrophoretictechniques.

瓊脂糖是一種海藻多糖，瓊脂糖膠分離范圍很大，但其分辨率卻相對(duì)較低。通過(guò)改變瓊脂糖凝膠的濃度，應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)的電泳技術(shù)可以分離200到50,000bp大小的DNA片斷。瓊脂糖凝膠濃度越大，凝膠就越硬。較高濃度的瓊脂糖膠有利于較小的DNA片斷分離，而較低濃度的瓊脂糖膠則可以分離較大的DNA片斷。Thehighertheagaroseconcentration,the"stiffer"thegel.HigherconcentrationsofagarosehelpintheseparationofsmallDNAs,whilelowagaroseconcentrationsallowresolutionoflargerDNAs.

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Agaroseistypicallyusedatconcentrationsof0.5%to2%.

ThedistanceDNAhasmigratedinthegelcanbejudgedbyvisuallymonitoringmigrationofthetrackingdyes.瓊脂糖膠濃度一般在0.5％到2％之間。

通過(guò)觀察示蹤染料的遷移距離可以判斷DNA的遷移距離。溴酚藍(lán)染料在瓊脂糖凝膠的遷移速率最大。

當(dāng)遷移足夠距離后，就可以通過(guò)Gelview染色來(lái)觀察DNA片斷。Whenadequatemigrationhasoccured,DNAfragmentscanbevisualizedbystainingwithGelview.2023/5/226瓊脂糖凝膠濃度0.3%0.6%0.9%1.2%1.5%2%DNA片段分離范圍6-60kb1-20kb0.5-7kb0.4-6kb0.2-3kb0.1-2kb2023/5/227Gelview

isafluorescentdye.Itisoftenincorporatedintothegelsothatstainingoccursduringelectrophoresis,butthegelcanalsobestainedafterelectrophoresisbysoakinginadilutesolutionofGelview.TovisualizeDNAorRNA,thegelisplacedonaultraviolettransilluminator.

Gelview是一種熒光染料。它可以在做膠時(shí)混入其中在電泳時(shí)進(jìn)行染色，也可以待電泳完成后將凝膠浸泡在稀釋的Gelview溶液中進(jìn)行染色

。但必須將凝膠置于紫外透射儀中才可以對(duì)凝膠中的DNA或RNA進(jìn)行觀察。2023/5/228三、試劑與器材（Reagentsandapparatus）

1.Agarose.2.TBE[5×stocksolution(1liter):54gTrisbase,27.5gboricacid,20ml0.5MEDTA,pH8.0].3.10×loadingbuffer:0.25%bromophenolblue,40%sucroseinwater.4.Equipment:beaker,graduatedcylinder,stirbar,microwave,Panbalance,comb,electrophoresistank,andElectro-phoresisSystem,Ultraviolettransilluminator.5.Gelview2023/5/229Ⅰ.Preparationofthegel（凝膠的制備）

1.制備1％瓊脂糖凝膠。稱取0.5g瓊脂糖，放人錐形瓶中，加入50mL的0.5×TBE緩沖液，放入微波爐加熱至完全溶化，則為1％瓊脂糖凝膠液。（由于蒸發(fā)作用，溶解前在容量瓶上作一個(gè)記號(hào)，溶解后用三蒸水補(bǔ)足）

四、實(shí)驗(yàn)步驟(ExperimentalProcedures)2023/5/22102.制膠器的安裝①取多功能制膠器，洗凈，晾干；②將多功能制膠器放置于一水平位置，選擇12×6cm制膠架，然后選擇1.5mm18teeth的梳子（最大加樣量25μl）；③將所選擇規(guī)格的梳子插入制膠架的定位槽中。2023/5/22113.將熔化的瓊脂糖凝膠液轉(zhuǎn)入Gelview專用的三角瓶中，然后加入Gelview

5μl。4.將冷到60℃左右的瓊脂糖凝膠液，緩緩倒入所選擇的制膠槽內(nèi)，直至有機(jī)玻璃板上形成一層均勻的膠面(注意不要形成氣泡)。5.待膠凝固后（30-60min），輕輕拔掉梳子，將凝膠盤從制膠槽中取出，放入電泳槽內(nèi)。6.加入電泳緩沖液(0.5×)至電泳槽中。

2023/5/2212Ⅱ.LoadingDNAsamples(加樣)

用移液槍緩慢將DNA樣品垂直加入加樣孔直至開(kāi)口下方。1.DNAsamples：

10μl2.Loading

buffer(6X)：2μl3.DNAmarkers

：6μl

Total

12μl2023/5/2213Ⅲ.Gel（電泳）1.接通電泳槽與電泳儀的電源(注意正負(fù)極，DNA片段從負(fù)極向正極移動(dòng))。保持電壓60－80V。2.當(dāng)溴酚藍(lán)染料移動(dòng)到距凝膠前沿1-2cm處，停止電泳。

2023/5/2214Ⅳ.GelInterpretation

（凝膠圖像解釋）TheuncutDNAlanemayhaveseveralbandsinit.ThisoccursbecausethemobilityofplasmidDNAinanagarosegeldependsonitsmolecularconformationaswellasitssizeinbasepairs.PlasmidDNAcanexistinanyoneofthreemajorconformations:未切割的質(zhì)粒DNA在其泳道上也許會(huì)出現(xiàn)幾個(gè)條帶，之所以這樣是由于質(zhì)粒DNA在瓊脂糖凝膠中的遷移距離是由其分子構(gòu)象及其堿基對(duì)大小所決定的。質(zhì)粒DNA以下列三種主要構(gòu)象中的任何一種形式存在：2023/5/2215Su容pe頃r(shí)c助oi旋le僑d--嚴(yán)p捎la賣sm言id適i餃s豆us棍ua幻玉ll能y論se僑en昆a掌s掏asu夜pe頂rc丙oi懼lin毒a脖b計(jì)ac巖te猾ri嫂al夜c繳el辦l.碌T研hi荒s復(fù)fo塘rm琴o甚f姑th白e騾pl馬as斗mi宏d族wi瞇ll匪m癢ov師e姻th個(gè)e猜fa衡st睡es團(tuán)t件th慢ro良ug綁h鼠th飯e荷ge慢l逮du析e蕩to氧i層ts豬c閑om獲pa棚ct國(guó)s淺tr耀uc歇tu鏈re同.超螺掩旋——質(zhì)粒樓在細(xì)撥菌細(xì)壘胞以擦超螺曠旋結(jié)冒構(gòu)存裙在，唉由于眠其結(jié)醉構(gòu)致載密，句它在無(wú)凝膠楊中的巨泳動(dòng)丹速度呆最快純。20津23嘗/5漸/1貼816Ni靜ck愧ed--誰(shuí)Du平ri勝ng刺p俗la性sm膊id辛D司NA旦r紐奉ep擾li附ca嶺ti障on泛,to元po扣is呢om魚(yú)er杰-a架seI儉i禁nt繞ro愛(ài)du令ce僚s貼a小ni咐ck辱i首nt培o施on菊e鍛st招ra譜nd西o童f殊th后e惡DN吹A(chǔ)岸he根li鋪x膝an茶d持un豪co凳il過(guò)s令th液e加pl哲as天mi笨d.魄P農(nóng)hy歇si念ca雕l膛sh般ea錢ri酷ng摧a晝nd價(jià)e今nz指ym殊at漆ic聯(lián)c榴le秧av奸ag仆e沒(méi)du篇ri中ng匪p限la瓶sm放id套i揉so獲la虜ti附on蒼m羽ay脊a袋ls朝o恩in判tr庸od辯uc簽e方ni濫ck況s舅in信to染t偉hesu歉pe拖rc們oi爺le垮dpl互as逐mi譜d筍to近p河ro疤du獲ce臣a庫(kù)r漲el祖ax沒(méi)ed目o卡pe膽n撓ci勿rc利ul取ar凱s柏tr各uc原tu蘆re蓮.切口——在質(zhì)徐粒DN飾A復(fù)制繼過(guò)程拜中，恒拓?fù)淝之悩?gòu)智酶I會(huì)在DN峰A雙螺據(jù)旋中霧的一吃條鏈桑中引叮入一勿個(gè)切添口，隸解開(kāi)紗質(zhì)粒扶的超吧螺旋頁(yè)。在蓄質(zhì)粒朽分離姥過(guò)程很中由圍于物只理剪訴切和凈酶的棋切割脂作用度同樣晌也會(huì)腎在超躁螺旋魂質(zhì)粒馳中引谷入切妄口從茶而產(chǎn)乘生松匆散的帆開(kāi)環(huán)嗽結(jié)構(gòu)浪。這叢種形豎式的收質(zhì)粒康遷移墾速率童介于亂超螺質(zhì)旋和裝線性DN久A之間抽。20籃23塔/5碎/1膚817Li晌ne換ar——Li細(xì)ne御arpl蘿as湯mi殊d視DN塘A膚oc財(cái)cu閥rs租w鑒he黎n蝕da件ma須ge丘r砍es姓ul虎ts抄i愉n圍st白ra綢nd尸n箱ic比ks赴d纏ir闊ec味tl望y冤op間po淹si刻te栗e都ac管h等ot盯he湯r罵on堡t增he泊D睡NA傍h斗el鞠ix純.敞Th爐is慣f騾or論m鴨is屈t蓮he枯s猾lo嫩we廁st萍m何ig存ra窮ti材ng寶f討or儉m躲of俘p津la餐sm消id綢.刪Th策e錢pr仙es找en股ce蠅o帝f繪li析ne蔑ar杰D院NA景i舟n蹲a哄pl穗as詞mi褲d逼pr驕ep筋ar臺(tái)at站io淺n撞is鈔a誕s評(píng)ig感n董of災(zāi)e姐it抬he鉛r顛nu制cl稱ea盈se詢c危on桶ta遇mi貨na解ti蒸on雞o茅r廉sl犬op屋py難l鋒ab贊p崇ro籍ce選du挪re鎖.線性——當(dāng)DN嶄A損傷阿在DN薪A雙鏈肚相對(duì)膊應(yīng)的少兩條晶鏈上隙同時(shí)槽產(chǎn)生惰切口熟時(shí)，姿就會(huì)端出現(xiàn)給線性洗質(zhì)粒DN伶A，這其種DN喝A的泳客動(dòng)速適率最濤慢，消質(zhì)粒近制備汁過(guò)程揉個(gè)出段現(xiàn)線喚性DN眾A說(shuō)明韻存在占核酸材酶污檢染或笛實(shí)驗(yàn)檢操作棍有問(wèn)抬題。20炕23鞋/5響/1亮818五、緩實(shí)驗(yàn)遲結(jié)果(ex化pe研ri大me街nt懶al筒r絞es戴ul士ts)1、DN即A相對(duì)富分子葛質(zhì)量攪標(biāo)準(zhǔn)月物（ma窯ke梅r）2、pU路C1薄9質(zhì)粒DN詞A經(jīng)Ec申oR圖I完全埋酶解3、pU算C1溜9質(zhì)粒DN割A(yù)經(jīng)Ec島oR秘I部分杠酶解4、自皮提的pU自C1石9質(zhì)粒DN賞A（此溪結(jié)果綱提得殿較好濫，為1條帶歇，以寬超螺郊旋為營(yíng)主。柳）20遭23毫/5侵/1圍819六、嗎注意吉事項(xiàng)(No習(xí)te顧s)Th絕e鋒mob灘il田it猜yof愛(ài)t仰he餡D遍NA膨d擱ep后en劣ds察o頂n伙th賺e燈fo泉ll摸ow生in油g戚fa躬ct撿or花s：Mo弄le娛cu候la蠶r眾si御ze聾o寺f吳DN時(shí)ADN凳A的分讓子大揉小——分子欺量越贊小，辟遷移巡壽越快數(shù)。b.Ag僚ar殖os累eco憲nc寒en波tr遞at聾io僅n瓊脂棍糖濃語(yǔ)度——濃度艷越低無(wú)，遷盆移越斯快。c.伙C匠on客fo摔rm侮at湯io茄n忽of膀t核he航D挽