egfl7對(duì)胃癌細(xì)胞自噬及生物學(xué)行為的影響結(jié)題

響自噬體形成的關(guān)鍵因一是自噬相關(guān)蛋白以特定的順序發(fā)揮功能[5]。微管相關(guān)蛋白1的3（microtubuleassociatedprotein1lightchain3，LC3）是酵母菌自噬相關(guān)8（Atg8）的同源[6]。它存在水溶性LC3-Ⅰ和脂溶性LC3-Ⅱ兩種不同的類(lèi)型。其中LC3-)偶聯(lián)并形成Ⅰ轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)C3BⅡ，它主要與自噬體膜密切相關(guān)[6]。并且LC3-Ⅱ與LC3-Ⅰ的比值或LC3-Ⅱ與，類(lèi)表皮生長(zhǎng)因子樣結(jié)構(gòu)域7（EGFL7）又叫血管內(nèi)皮素，是一種局限在內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)同類(lèi)型的中卻發(fā)現(xiàn)其表達(dá)過(guò)度，如肝癌[14]，喉鱗狀細(xì)胞癌[15]上皮性癌[16]、腎細(xì)胞癌[17]及胰[18]該因子與腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)如研究發(fā)現(xiàn)EGFL7可以通過(guò)誘導(dǎo)上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（Epithelial-MesenchymalTransition，EMT）促進(jìn)胰細(xì)胞的轉(zhuǎn)移[19]。M.Massimiani，EGFL7MAPK、PI3KJeg3，本課題組在臨床實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)，胃癌組織中EGFL7高表達(dá)，并且EGFL7的表達(dá)水平與胃癌淋的轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)；在細(xì)胞水平發(fā)現(xiàn)EGFL7過(guò)表達(dá)能增加胃癌細(xì)胞的侵襲遷移能力，該過(guò)程與EGFL7過(guò)表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）有關(guān)，且涉及PI3K信號(hào)通路。PI3K的遷移與侵襲過(guò)程。為此，在這里我們?yōu)榱擞^察自噬是否參與EGFL7介導(dǎo)的胃癌細(xì)胞的遷移過(guò)程及作用，我們首先構(gòu)建EGFL7過(guò)表達(dá)質(zhì)粒載體和對(duì)照質(zhì)粒載體，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染至MKN28通過(guò)多種方法檢測(cè)自噬另外自噬藥物抑制劑3-甲基腺嘌（3-Methyladenine，EGFL7第一部 材料與方本實(shí)驗(yàn)所用的人高分化胃細(xì)胞株（MKN28）來(lái)自中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院病理EGFL7過(guò)表達(dá)質(zhì)粒與對(duì)照質(zhì)粒pGPU6/GFP/Neo(圖1)購(gòu)自吉瑪制藥技術(shù)。1pGPU6/GFP/NeopEGFP甘油菌菌株及質(zhì)粒pEGFP-N1（圖2）由呂奔饋贈(zèng)RPMI1640培養(yǎng) 胎牛 BI 胰蛋白 胰蛋白 酵母提取 Tween 無(wú)水乙 蛋白質(zhì) 比色 脫脂奶 伊利引物序 生乙 現(xiàn)代東方精細(xì)化學(xué)品異丙 現(xiàn)代東方精細(xì)化學(xué)品氯 現(xiàn)代東方精細(xì)化學(xué)品溴化乙錠 Proteinladder Thermo丙烯酰 東勝泰博科技過(guò)硫酸 東勝泰博科技6孔 24孔 PVDF LC3B抗 CellEGFL7抗 GAPDH抗 Santa Santa質(zhì)粒大量抽提試劑 康為世BCAProteinAssayReagent Real-timePCR試劑 ECL發(fā)光試劑 長(zhǎng)沙艾杰生物技術(shù)倒置顯微 水浴 醫(yī)用恒溫設(shè)備 新芝生物技術(shù) Awareness，Chromate430高速冷凍離心 CO2培養(yǎng) SANYO無(wú)菌操作 蘇凈安漩渦振蕩 江蘇海門(mén)其林貝爾儀器公恒溫振蕩培養(yǎng) 太倉(cāng)華美生化儀器 小型桌面離心 倒置熒光顯微 60℃烤 躍進(jìn)醫(yī)療器械臺(tái)式滅菌 山東新華醫(yī)療器JY-92-Ⅱ型超聲波細(xì)胞 新芝生物技 移液 半干轉(zhuǎn)膜 液氮 ThermopH METTLER細(xì)胞計(jì)數(shù) 蔡小型垂直電泳槽、電泳 微量移液 PCR ABI377型 PerkinABI-7500Real-timePCR 正置研究級(jí)顯微鏡 半干轉(zhuǎn)膜 凝膠成像系統(tǒng)、分析系 水平凝膠電泳 電泳 胰蛋白 過(guò)濾后分裝，放置4℃冰箱中備用，另外將多余的部分放置-20℃中。（3）胎牛 9ml （4）無(wú)水乙 液體LB胰化蛋白 酵母提取 WesternBlotting丙烯酰胺（神經(jīng)毒性 放置37℃環(huán)境下溶解后，定容至100ml，于棕色瓶中，放置4℃冰箱中保存10%SDS Trisbase(PH=6.8)1 EDTA- 1.5MTrisbase Tris- 甘氨酸 （9）甘氨酸 加入ddH2O定容至800ml，充分混勻，使用前加入甲醇(液：甲醇=4:1)TBS(25mM TBSTTBSTween20：TBS=1:1000脫脂奶 硼 0.5mol／mlEDTA(PH 0.5×TBE（10。(2）EB濃縮液 40.5μg/ml Transwell取0.1g結(jié)晶紫，向其中加入，待完全溶解后用棕色玻璃瓶常溫（2）4%多聚向4g多聚中加入100mlPBS溶液，置于37℃水浴鍋中溶解，4℃避光將紗布浸泡在配有新潔爾滅的液中，取出擰干后擦拭超凈工作臺(tái)的臺(tái)面及各個(gè)側(cè)準(zhǔn)備好高壓滅菌并烘干后的飯盒、鐵筒、細(xì)胞培養(yǎng)瓶，棉、添加10%FBS的；打開(kāi)紫外燈照射30min后加開(kāi)大風(fēng)繼續(xù)照射30min（注意、胰酶等實(shí)驗(yàn)試劑不能3（時(shí)一定要注意避免凍傷水浴箱中，快速輕微晃動(dòng)，盡量使其快速融化；1200rmp，離心5min，并將凍存管置于其中離心；關(guān)閉超凈工作臺(tái)內(nèi)的紫外燈，打開(kāi)日光燈，改開(kāi)小風(fēng)。穿好衣，戴好帽子、口燈，用棉擦拭雙手、指縫區(qū)及工作臺(tái)面（尤其是工作區(qū)域；從離心機(jī)中取出凍存管，用棉擦拭其周?chē)瑏G棄上層凍存液，加入1ml完養(yǎng)基，用滴管輕輕吹打，盡量使細(xì)胞從管壁上完全脫落下來(lái)；4ml將復(fù)蘇好的細(xì)胞放置37℃、5%C02的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)PBS（注意胰蛋白酶不能在紫外燈下照射；如果觀察到細(xì)胞覆蓋率達(dá)90%以上、細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好并且培養(yǎng)基的顏色清亮（表1×PBS1ml0.25明細(xì)胞已經(jīng)被消化，此時(shí)加入含10％FBS的完全培養(yǎng)基10ml終止細(xì)胞消化，將培養(yǎng)以“Z”1ml0.25％胰蛋白酶，輕輕晃動(dòng)，盡可能使胰酶覆蓋全部細(xì)胞；取出試管，觀察到試管底部有白色的沉淀物為細(xì)胞團(tuán)，丟棄上清，用移液槍加入1-1.5ml參照本課題組其他成員之前的實(shí)驗(yàn)操作方法，檢測(cè)胃細(xì)胞株BGC823、SGC7901、MKN28、MKN45GES-1EGFL7本實(shí)驗(yàn)分4組進(jìn)行，分別是：1)MKN28-EGFL7（DMSO）細(xì)胞組：在MKN28細(xì)胞中瞬時(shí)轉(zhuǎn)染EGFL7表達(dá)質(zhì)粒載體后以DMSO溶劑處理細(xì)胞；2)MKN28-EGFL7（3-MA）細(xì)胞組MKN28（DMSO）細(xì)胞組：在MKN28細(xì)胞中，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染帶有無(wú)關(guān)序列的對(duì)照質(zhì)粒載體后以溶劑處理細(xì)胞；4)MKN28-NC（3-MA）MKN283-MA90%3-MA3M，.1細(xì)胞預(yù)處細(xì)胞收集：當(dāng)預(yù)先處理的細(xì)胞融合度達(dá)90%左右時(shí)，丟棄舊的培基，用1×PBS溶液洗3遍，用移液槍加入500ul0.25%胰蛋白酶，待細(xì)胞消化后，轉(zhuǎn)移至1.5mlEP管中（EP管事PBS12000r/min7min，再倒掉上清；EP1ml2.5%.1浸洗：用PBS溶液將細(xì)胞3遍，每次脫水將細(xì)胞洗好后分別放入50%70%90%100%濃度梯度的中脫水重復(fù)2次，15min；浸泡：先配制好環(huán)氧樹(shù)脂混合液以1:1進(jìn)行配置，浸泡PBS溶液3遍置于40℃烘烤箱中烘干；蛋白免疫印跡技術(shù)（Westernblotting）培養(yǎng)細(xì)胞總蛋白的TipEP刮子濾紙預(yù)冷的PBS溶液ddH細(xì)胞裂解液蛋白酶抑制劑膜等實(shí)驗(yàn)用品和實(shí)驗(yàn)試劑；將培養(yǎng)的細(xì)胞從培養(yǎng)取出丟棄舊的培基用預(yù)冷的PBS3遍待其自然晾干100μL30min；將細(xì)胞刮子用自來(lái)水干凈后再用雙蒸水充分淋洗，用干凈的濾紙將其水分吸干；刮1.5ml的EP設(shè)置超聲機(jī)參數(shù)為時(shí)間<5s，間隔6s，共4次；為防止產(chǎn)生氣泡，應(yīng)將超聲機(jī)的探頭伸至EP管底部使細(xì)胞進(jìn)行；至溶液最后不粘稠時(shí)停止；用膜封好EP管的管口將其插入浮標(biāo)并置于沸水浴中8min隨后放置冰上冷卻2min；(7)4℃，12000rpm12min，開(kāi)始離心；1)EPBSAEPBSABSA2mg/ml003)(ODEP25μL和BCA200μL（EP96100μL568nm(ODEPOD04）圖3 BCA法蛋白濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線圖標(biāo)準(zhǔn)曲線為：y(ug/μL)=[1908.2(OD測(cè)-OD空)-178.79]/100從各EP100μL96用酶標(biāo)儀測(cè)定樣品的吸光度值（OD；8%10%12%8%10%12%1.5M將配置好的混合溶液立即灌注于組裝的玻璃板中，確保配制好的分離膠距離梳齒1～1.5cm。表 1M1×Tris-甘氨酸電泳緩沖液加滿(mǎn)小槽，確保無(wú)漏夜。加入的1gel2gel5μL上樣緩沖液以確保各個(gè)孔的壓力達(dá)到平衡；0.6-0.7cm；15s5min；（PVDFdd（PVDF1×（膜PVDF1（2）PVDF.（.（第二天從冰箱中取出PVDF膜，室溫下于搖復(fù)溫丟棄一抗，于搖用臨時(shí)配制的TBST3遍，每次抗中，室溫下于搖孵育2h；丟棄二抗，于搖用TBST洗3遍，每次時(shí)間為10min.7按照ECL光試劑盒的說(shuō)明AB液=1:1比例配制工作液20μL/cm2將配制好的工作液均勻的滴在PVDF膜上，運(yùn)用凝膠成像系統(tǒng)整個(gè)過(guò)程注意避光和整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程都必須嚴(yán)格遵循無(wú)菌無(wú)酶操作的要求，佩戴好、帽子和手套R(shí)NA用棉擦拭移液器和工作臺(tái)臺(tái)面RNA×PBS3遍，甩干里面的液體，倒扣在干凈的濾紙上置于室溫下自然晾干勻的覆蓋在細(xì)胞的表面，盡量使所有的細(xì)胞充解；1.5mLEP412,000g，15min；EP1mLTRIzol0.2mL充分呈乳白色無(wú)分相后（大概15s，于室溫中靜置5min；將離好心的EP管從離心機(jī)中取出，此時(shí)觀察到EP管中的液體分為三層：無(wú)色的上清液EP0.5ml10min；壁緩慢加入1mL用無(wú)酶水配制的75%的，充分混勻，取出EP管，用移液槍吸去乙醇，于室溫下干燥5～10min，待沉淀干燥至透明，用15~20μL無(wú)酶水溶解沉淀，用移液槍吹打沉淀，使RNA完全溶解，置于-80℃冰箱中保存待打開(kāi)紫外分光光度計(jì)機(jī)器，選擇RNA選項(xiàng)，按dilution鍵，輸入稀釋?zhuān)佥攄ilution98μL、sample2μLRNARNAcDNA試 使用 GoScriptTM5X Random PCRNucleotide-

GoScriptTMReverse Total EEGFL75′CAGCGTGTGTACCAGCCCTTCCTCAGAPDH5′TCCTGCACCACCAACTGCTTAGCACC-PremixExTaqTM試劑盒(PromegaqRT-PCR試 使用Nuclease- PCRForward PCRReverse 熒光探針溶液 DNA模 EGFL7瞬時(shí)轉(zhuǎn)染MKN28細(xì)高表達(dá)質(zhì)粒與pGCMV/MCS/IRES/EGFP/Neo-nonspecific對(duì)照質(zhì)粒導(dǎo)入MKN28細(xì)胞中，3-41×10662ml；24h70-808μg12pGCMV/MCS/IRES/Neo-EGFL7+Flag質(zhì)粒DNA8μgpGCMV/MCS/IRES/Neo-nonspecific質(zhì)粒DNA分別溶解于250μL的無(wú)培養(yǎng)基中，充分混勻，于室溫下孵育5min即為A液；將10μL脂-2000溶解于250μL的無(wú)培養(yǎng)基中，室溫下孵育5min即為將AB25-30將6孔板的每個(gè)孔中更換為無(wú)培養(yǎng)基至1500μL，然后分別加pGPU6/GFP/Neo-粒-脂-2000的混合溶液各500μL，輕輕前后搖動(dòng)6孔板，混勻溶液；轉(zhuǎn)染6-8h后，用無(wú)培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞3次，換用含10%正常培養(yǎng)液，繼續(xù)培24-48h.(1)準(zhǔn)備工作：將試管、微量移液槍、Tip頭、直尺、細(xì)胞計(jì)數(shù)板、棉、記號(hào)筆等放置超1h；(2)單層細(xì)胞：將細(xì)胞密度調(diào)整為6.0×105/mL，被檢測(cè)細(xì)胞(MKN28-EGFL73-MA組，MKN28-EGFL7DMSOMKN28-NC3-MAMKN28-NC組細(xì)胞)，每組平行3個(gè)樣本，常規(guī)培200Transwell將試管、微量移液槍、Tip頭、24孔板、Transwell小室、細(xì)胞計(jì)數(shù)板、棉、記1h。水化基底膜：丟棄原小室內(nèi)的培基，并向每個(gè)小室中加入50ul的無(wú)1640培基，緩慢晃動(dòng)小室，使加入的培基均勻分布在小室中；置于37℃、5％CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱1收集細(xì)胞：將轉(zhuǎn)染EGFL7過(guò)表達(dá)質(zhì)粒的MKN28細(xì)胞及對(duì)照細(xì)胞用PBS洗三次，加0.25％胰酶1ml消化細(xì)胞待細(xì)胞消化完全后移至試管中并加入無(wú)培基終止消化；1200rpm5min1%FBS16401×106個(gè)/ml。24間的間隙（即下室）中加入200ul含10%FBS1640培基，然后吸取上述收集的細(xì)胞懸液200ul（即上室2423棉簽擦掉上室底部盡量將上室內(nèi)的細(xì)胞擦去動(dòng)作一定要輕柔避免底部并加入4%聚中固定30min。染色：固定好后，將固定液倒掉，用沾濕的小棉簽再次擦拭上室底部，動(dòng)作一定充分浸泡在0.1%的結(jié)晶紫溶液中10min，再置于雙蒸水中幾次。SPSS16.0forWindows第二部 實(shí)驗(yàn)結(jié)EGFL7mRNAqRT-PCREGFL7mRNA在MKN28細(xì)胞系中分別瞬時(shí)轉(zhuǎn)染pGCMV/MCS/IRES/EGFP/Neo-EGFL7+Flag質(zhì)粒（命名為MKN28-EGFL7）作為實(shí)驗(yàn)組和pGCMV/MCS/IRES/EGFP/Neo-nonspecific質(zhì)粒（命名為MKN28-NC）作為對(duì)照組通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染EGFL7過(guò)表達(dá)質(zhì)粒和NC對(duì)照質(zhì)粒后EGFL7（P<0.05**3MKN28-NC、MKN28-EGFL7EGFL7Westernblotting提取MKN28-EGFL7、MKN28-NC瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的蛋白，通過(guò)Westernblotting檢測(cè)各EGFL7GAPDH4MKN28-NC、MKN28-EGFL7EGFL7Westernblotting在瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞系MKN28-NC、MKN28-EGFL7組細(xì)胞株中加入自噬抑制劑3-MA作為實(shí)驗(yàn)組或加DMSO作為對(duì)照組，24h后提取各組細(xì)胞株中蛋白，通過(guò)Westernblotting實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)各組細(xì)胞株中自噬相關(guān)蛋白LC3B的表達(dá)情況5MKN28-NC、MKN28-EGFL73-MADMSO結(jié)果顯示：過(guò)表達(dá)組細(xì)胞株MKN28-EGFL7與對(duì)照組細(xì)胞株MKN28-NC相比，過(guò)表達(dá)組胃LC3ⅠLC33-Methyladenine(3-MA)實(shí)驗(yàn)組與加入DMSO對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組中3-MA明顯抑制了LC3Ⅰ向LC3Ⅱ轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化。表明，EGFL7的過(guò)EGFL724h后分別加入3-MA自噬抑制劑作為實(shí)驗(yàn)組DMSO作為對(duì)照組，24h后在倒置熒光顯微鏡下觀察綠色熒光斑點(diǎn)的情況。6MKN28-NC、MKN28-EGFL73-MADMSO結(jié)果顯示：過(guò)表達(dá)組細(xì)胞株MKN28-EGFL7與對(duì)照組細(xì)胞株MKN28-NC相比，過(guò)表達(dá)組胃癌細(xì)胞中綠色點(diǎn)狀熒光斑點(diǎn)的數(shù)量明顯增多；加入3-MA實(shí)驗(yàn)組與加入DMSO對(duì)照組相EGFL7將瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞系MKN28-NC、MKN28-EGFL7組細(xì)胞株分別加入3-MA自噬抑制劑作為實(shí)驗(yàn)組DMSO作為對(duì)照組，24h后將各組細(xì)胞初步固定并送電鏡室。結(jié)果顯示：過(guò)表達(dá)組細(xì)胞株MKN28-EGFL7與對(duì)照組細(xì)胞株MKN28-NC相比，在透射電子顯微鏡下觀察到過(guò)表達(dá)組胃癌細(xì)胞中自噬體形成的數(shù)量明顯增多；加入3-MA實(shí)驗(yàn)組與加入DMSO對(duì)照組相比，加入3-MA實(shí)驗(yàn)組自噬小體形成數(shù)量明顯減小。更進(jìn)一步驗(yàn)證了EGFL7的EGFL7在瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞系MKN28-NC、MKN28-EGFL7組細(xì)胞株中用自噬藥物抑制劑3-MA處理細(xì)胞或在細(xì)胞中只加DMSO作為對(duì)照組，24h后通過(guò)Transwell遷移實(shí)驗(yàn)觀察各組細(xì)胞株的遷結(jié)果顯示：過(guò)表達(dá)組MKN28-EGFL7與對(duì)照組MKN28-NC相比，過(guò)表達(dá)組癌細(xì)胞遷移通過(guò)transwell小室微孔的細(xì)胞數(shù)顯著升高(*P<0.05)(圖9)。加入自噬抑制劑組與加入DMSO組相比，加入自噬抑制劑組癌細(xì)胞遷移通過(guò)transwell小室微孔的細(xì)胞數(shù)顯著降低(**P<0.05)(圖9)。這些結(jié)果表明EGFL7過(guò)表達(dá)引起的自噬活性的增加能升高癌細(xì)胞遷移能EGFL7圖 9(*P<0.05,**P<0.05劃痕實(shí)驗(yàn)觀察EGFL7過(guò)表達(dá)后對(duì)胃癌細(xì)胞愈合的影為了進(jìn)一步了解EGFL7過(guò)表達(dá)對(duì)胃癌細(xì)胞遷移能力的影響，我們?cè)偻ㄟ^(guò)劃痕實(shí)驗(yàn)(woundclosureMKN28-NC（DMSO）;MKN28-NC（3-MA）;MKN28-EGFL7（DMSO）;MKN28-EGFL7（3-MA）MKN28-EGFL7MKN28組MKN28-EGFL7組癌細(xì)胞愈合率顯著升高(*P<0.05)。加入自噬抑制劑3-MA實(shí)驗(yàn)組與加入DMSO的對(duì)照組相比，加入3-MA實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞愈合能力減弱最為明顯(**P<0.05)。EGFL71112(*P<0.05,第三部 討60EGFL7EGFL7[122]EGFL7[14]EGFL7的生存與轉(zhuǎn)移相關(guān)聯(lián)。因此本文主要探討EGFL7在該行為中的作用。評(píng)價(jià)自噬最常用的方法之一是比較LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的大小[7，8]，自噬發(fā)生之后，由于LC3與PE結(jié)合后會(huì)不斷轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)C3，因此LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值逐漸增大，該值的大小在一定程度上能反應(yīng)自噬的活性[23，24]我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示EGFL7過(guò)表達(dá)的胃癌細(xì)胞中，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值明顯比對(duì)照組的比值大，表明EGFL7過(guò)表達(dá)在一定程度增加自噬的活性。當(dāng)使EGFL7過(guò)表達(dá)引起的自噬水平的升高。以上研究表明自噬水平的增加可能是由于EGFL7的過(guò)LC3LC3Ⅰ散在分布在胞漿中，當(dāng)自噬被激活時(shí)，LC3ⅠLC3Ⅱ并定位在自噬膜上，此時(shí)在熒光顯微鏡下能觀察到綠色熒光斑點(diǎn)，一個(gè)斑點(diǎn)代[25]EGFL73-MA色熒光斑點(diǎn)的較為稀疏。該結(jié)果在一定程度表明EGFL7的過(guò)表達(dá)能夠明顯增加細(xì)胞內(nèi)的自EGFL7段[26][27]EGFL7EGFL7胞中自噬活性的增加。接下來(lái)我們探討自噬和EGFL7對(duì)胃細(xì)胞遷移行為的影響愈合分劃痕實(shí)驗(yàn)）是評(píng)估細(xì)胞遷移能力的方法之一我們的研究表明EGFL7過(guò)表達(dá)組細(xì)胞的愈合能力顯比對(duì)照組強(qiáng)，當(dāng)加入自噬藥物抑制劑3-MA后，該細(xì)胞的愈合能力明顯減弱，我認(rèn)為這與自噬能夠促進(jìn)EGFL7間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）。。TakeoNitta等研究發(fā)現(xiàn)在膽管癌細(xì)胞中誘導(dǎo)自噬，腫瘤細(xì)胞的侵襲性明顯增加，行為[30]。LiJ行為[31]。研究發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞癌HepG2和BEL7402細(xì)胞經(jīng)饑餓誘導(dǎo)自噬后能促進(jìn)上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT，從而促進(jìn)肝細(xì)胞癌的侵襲和轉(zhuǎn)移。而當(dāng)肝細(xì)胞癌經(jīng)自噬抑制氯喹和Atg3或Atg7處理后，肝細(xì)胞癌的上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化就會(huì)受到抑制并且其侵襲性明顯減弱。EMT在轉(zhuǎn)化過(guò)程中能誘導(dǎo)Beclin1重新表達(dá)，激活細(xì)胞自噬。細(xì)胞可通過(guò)EMT和自噬的協(xié)同作用共同抵抗細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（cytotoxicT-lymphocytes，CTL）的作用[32]。、組織重建轉(zhuǎn)移等許多過(guò)程發(fā)揮重要作用。尤其是在調(diào)節(jié)腫瘤的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移過(guò)程中起到EMT、研究發(fā)現(xiàn)，EGFL7可以通過(guò)誘導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）促進(jìn)胰細(xì)胞的轉(zhuǎn)移[36]，并且EGFL7表達(dá)與TNM分期淋轉(zhuǎn)移以及局部浸潤(rùn)顯著相關(guān)抑制EGFL7的表達(dá)能降低PaCa-2細(xì)胞的侵襲性[37]。M.Massimiani等研究表明，EGFL7通過(guò)激活MAPK、PI3K信號(hào)通路刺激Jeg3細(xì)胞的遷移[20]題組前期研究結(jié)果表明，EGFL7能通過(guò)誘導(dǎo)EMT促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵上述研究表明EGFL7能夠促進(jìn)癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力，并且與EMT有關(guān)；自噬也能通過(guò)EMT促進(jìn)癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力。并且本課題組前期實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，EGFL7誘導(dǎo)上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）促進(jìn)胃癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力，該過(guò)程涉及PI3K信號(hào)通路[38]，而該通路是自噬的經(jīng)典通路之一。因此，我們認(rèn)為本實(shí)驗(yàn)中自噬促進(jìn)EGFL7誘導(dǎo)的胃癌細(xì)胞的遷移能力可能與自噬誘導(dǎo)的EMT過(guò)程有關(guān)。在我們的遷移實(shí)驗(yàn)和愈合實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)EGFL7過(guò)表夠抑制EGFL7過(guò)表達(dá)引起的胃癌細(xì)胞的遷移能力。表明，自噬與EGFL7促進(jìn)的胃癌細(xì)胞的遷綜上所述，EGFL7LC3B3ALC3B臨觀察到的現(xiàn)象：臨用自噬抑制劑3A可以抑制瘤的發(fā)展，治療腫瘤[39。第四部 結(jié)EGFL7誘導(dǎo)的胃MKN28細(xì)胞遷移可能與其誘導(dǎo)的自噬水平的增加有FerlayJ,BrayF,FormanD,etal.Estimatesofworldwideburdenofcancerin2008:GLOBOCAN2008-Ferlay-2010-InternationalJournalofCancer-WileyOnlineLibrary[J].InternationalJournalofCancer,2010.SjoquistKM,BurmeisterBH,SmithersBM,ZalcbergJR,SimesRJ,BarbourA,etSurvivalafterneoadjuvantchemotherapyorchemoradiotherapyforresectableoesophagealcarcinoma:anupdatedmeta-ysis.LancetOncol.2011;12:681–92.[PubMed]DeterRL,DeDC.Influenceofglucagon,aninducerofcellularautophagy,onsomephysicalpropertiesofratliverlysosomes.[J].JournalofCellBiology,1967,33(2):437-LevineB.Autophagyandtheintegratedstressresponse.[J].MolecularCell,2010,40(2)::FengY,HeD,YaoZ,etal.Themachineryofmacroautophagy[J].CellResearch,2013,KabeyaY,MizushimaN,UenoT,etal.LC3,amlianhomologueofyeastApg8p,islocalizedinautophagosomemembranesafterprocessing.EmboJ2000;19:5720-8.KadowakiM,KarimMR.Chapter13CytosolicLC3RatioasatativeIndexofMacroautophagy[J].MethodsinEnzymology,2009,452:199-213.KimuraS,FujitaN,NodaT,etal.Chapter1MonitoringAutophagyinMlianCulturedCellsthroughtheDynamicsofLC3[J].MethodsinEnzymology,2009,452:1-12.LefortS,JoffreC,KiefferY,etal.Inhibitionofautophagyasanewmeansofimprovingchemotherapyefficiencyinhigh-LC3Btriple-negativebreastcancers.[J].Autophagy,2014,ChangY,YanW,HeX,etal.miR-375InhibitsAutophagyandReducesViabilityHepatocellularCarcinomaCellsUnderHypoxicConditions[J].Gastroenterology,2012,MacintoshRL,PaulT,JacquelineT,etal.Inhibitionofautophagyimpairstumorcellinvasioninanorganotypicmodel.[J].CellCycle,2012,11(10):2022-9.ParkerLH,MaikeS,Suk-WonJ,etal.Theendothelial-cell-derivedsecretedfactorEgfl7regulatesvasculartubeformation.[J].Nature,2004,428(6984):754-758.WuF,YangLY.Novelroleforepidermalgrowthfactor-like7inmetastasisofhumanhepatocellularcarcinoma.[J].Hepatology,2009,50(6):1839-1850.J-JL,X-MY,S-HW,etal.Prognosticroleofepidermalgrowthfactor-like7proteinexpressioninlaryngealsquamouscellcarcinoma.[J].JournalofLaryngology&Otology,2011,125(11):1152-7.JinjuO,SungHaeP,TaeSungL,etal.Highexpressionofepidermalgrowthfactor-7iscorrelatedwithpoordifferentiationandpoorprognosisinpatientswithepithelialovariancancer.[J].JournalofGynecologicOncology,2014,25(4):334-341.Han-FengX,LeiC,Xian-DongL,etal.TargetingEGFL7expressionthroughRNAinterferencesuppressesrenalcellcarcinomagrowthbyinhibitingangiogenesis.[J].AsianPacificJournalofCancerPreventionApjcp,2014,15(7):3045-3050.ShenX,HanY,XueX,etal.Epidermalgrowthfactor-like7promotescellinvasionandangiogenesisinpancreaticcarcinoma.[J].Biomedecine[?]Pharmacotherapy,2016,77:167-Yun-LiangW,Feng-LinD,JianY,etal.SuppressionoftheEpidermalGrowthFactor-like7andInhibitionofMigrationandEpithelial-MesenchymalTransitioninHumanPancreaticCancerPANC-1Cells.[J].AsianPacificJournalofCancerPreventionApjcp,2015,16(9):4065-Epidermalgrowthfactor-like7promotesmigrationandinvasionofhumantrophoblastcellsthroughactivationofMAPK,PI3KandNOTCHsignalingpathwaysBrechA,AhlquistT,LotheRA,etal.Autophagyintumoursuppressionandpromotion.[J].MolecularOncology,2009,3(4):366-375.FitchMJ,CampagnoloL,KuhnertF.EGFL7,anovelepidermalgrowthfactorexpressedinendothelialcells.DevDyn.PhilippW,McewanDG,IvanD.TheLC3inctomeataglance.[J].JournalofCellScience,2014,127(1):3-9.KimuraS,FujitaN,NodaT,etal.Chapter1MonitoringAutophagyinMlianCulturedCellsthroughtheDynamicsofLC3[J].MethodsinEnzymology,2009,452:1-12.YangZ,KlionskyDJ.Anoverviewofthemolecularmechanismofautophagy.[J].CurrentTopicsinMicrobiology&Immunology,2009,335(1):1-32.ChafferCL,WeinbergRA.Aoncancercellmetastasis.[J].Science,2011,Van’tVeerLJ,WeigeltB.Roadmaptometastasis.NatMed.TakeoN,YasunoriS,ShanR