高級生物化學(xué)蛋白質(zhì)性質(zhì)和分離

關(guān)于高級生物化學(xué)蛋白質(zhì)性質(zhì)和分離第1頁，課件共165頁，創(chuàng)作于2023年2月一、蛋白質(zhì)的變性與復(fù)性蛋白質(zhì)在某些物理和化學(xué)因素作用下，其特定的空間構(gòu)象被破壞，也即有序的空間結(jié)構(gòu)變成無序的空間結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致其理化性質(zhì)改變和生物活性的喪失。1.蛋白質(zhì)變性的概念2.變性的本質(zhì)次級鍵（有時包括二硫鍵）被破壞，天然構(gòu)象解體。變性不涉及一級結(jié)構(gòu)的破壞DenaturationP233第2頁，課件共165頁，創(chuàng)作于2023年2月3.變性理論

1931年，我國生物化學(xué)前輩吳憲提出了“蛋白質(zhì)變性后，其肽鏈由原來緊密有序的構(gòu)象變成了松散無序的構(gòu)象”。這就是變性作用，并且認(rèn)為天然蛋白質(zhì)的緊密構(gòu)造及晶體結(jié)構(gòu)是由分子中的次級鍵互相聯(lián)系而形成的，所以容易被物理的和化學(xué)因素所破壞，這個觀點(diǎn)反映了蛋白質(zhì)變性本質(zhì)。4.

變性的因素①物理因素：高溫、高壓、紫外線、電離輻射、超聲波②化學(xué)因素：強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、有機(jī)溶劑、重金屬鹽等。（如十二烷基硫酸鈉即SDS、尿素、鹽酸胍）變性理論和變性的因素第3頁，課件共165頁，創(chuàng)作于2023年2月變性的因素作用機(jī)理清潔劑丙醇丙酮凝結(jié)使糾纏第4頁，課件共165頁，創(chuàng)作于2023年2月常用的變性劑：尿素尿素：與多肽主鏈競爭氫鍵；增加非極性側(cè)鏈在水中的溶解度，從而降低疏水相互作用。尿素或者胍第5頁，課件共165頁，創(chuàng)作于2023年2月變性劑：十二烷基硫酸鈉（SDS）第6頁，課件共165頁，創(chuàng)作于2023年2月5、變性蛋白質(zhì)的特性生物活性喪失或者降低，如：Hb變性不能輸送O2,酶變性失去催化作用。物性理質(zhì)改變，如：溶解度降低，粘度升高，密度降低，失去結(jié)晶能力，旋光值改變，光譜發(fā)生變化。(分子量不變）化學(xué)性質(zhì)改變，如結(jié)構(gòu)的伸展松散而暴露，易與化學(xué)試劑反應(yīng)，易為蛋白質(zhì)水解酶所分解。

制備活性蛋白質(zhì)時嚴(yán)防蛋白質(zhì)變性。第7頁，課件共165頁，創(chuàng)作于2023年2月1.酶在有底物存在時比沒有底物存在時更穩(wěn)定，解釋原因？-2012年山東大學(xué)生物化學(xué)2.二硫鍵多蛋白質(zhì)難變性3.膠原蛋白有特殊共價(jià)鍵4.純化一個耐熱穩(wěn)定的酶是否需要低溫處理？5、一般的酶都是低溫保存，但低溫不穩(wěn)定性酶在低溫時變性，推測其機(jī)理。-2012年中山大學(xué)生物化學(xué)6.酶敏感性的概念？思考題第8頁，課件共165頁，創(chuàng)作于2023年2月思考題臨床醫(yī)學(xué)上，變性因素常被應(yīng)用來消毒及滅菌。此外,防止蛋白質(zhì)變性也是有效保存蛋白質(zhì)制劑（如疫苗等）的必要條件。誤服重金屬解毒方式?長期從事重金屬作業(yè)的人吃高含蛋白質(zhì)類食物？

一種發(fā)生在蛋白質(zhì)內(nèi)部的Ala-Val突變導(dǎo)致蛋白質(zhì)喪失活性，然而，如果這種蛋白質(zhì)在第二位置發(fā)生Ile-Gly的突變，可使蛋白質(zhì)恢復(fù)活性，試提出一種合理的解釋。

-江南大學(xué)2009年生物化學(xué)第9頁，課件共165頁，創(chuàng)作于2023年2月思考題

蛋白質(zhì)變性后的現(xiàn)象

-2011四川大學(xué)生物化學(xué)第10頁，課件共165頁，創(chuàng)作于2023年2月核酸的變性(一)、DNA的變性(denaturation)1

定義：在某些理化因素作用下，DNA雙鏈解開成兩條單鏈的過程。2

方法：過量酸，堿，加熱，變性試劑如尿素、酰胺以及某些有機(jī)溶劑如乙醇、丙酮等3變性后其它理化性質(zhì)變化：OD260增高 粘度下降

比旋度下降 浮力密度升高酸堿滴定曲線改變 生物活性喪失DNA的變性是爆發(fā)式的P508第11頁，課件共165頁，創(chuàng)作于2023年2月增色效應(yīng)

增色效應(yīng)：DNA變性后對260nm紫外光收增加的現(xiàn)象。

DNA分子中堿基間電子的相互作用是紫外吸收的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，但雙螺旋結(jié)構(gòu)有序堆積的堿基又“束縛”了這種作用。變性DNA的雙鏈解開，堿基中電子的相互作用更有利于紫外吸收，故產(chǎn)生增色效應(yīng)。不同來源DNA的變化不一，如大腸桿菌DNA經(jīng)熱變性后，其260nm的光密度值可增加40%以上，其它不同來源的DNA溶液的增值范圍多在20~30%之間。

假定一個DNA大分子最初全部是雙螺旋結(jié)構(gòu)，在熱變性后A260nm上升30%以上第12頁，課件共165頁，創(chuàng)作于2023年2月DNA和蛋白質(zhì)變性的比較

DNA降解：指多聚核苷酸中的磷酸二酯鍵斷裂，使分子量下降，其過程不可逆。DNA變性：空間結(jié)構(gòu)遭到破壞，一級結(jié)構(gòu)完好共價(jià)鍵完好，一般是可逆的。比較DNA和蛋白質(zhì)變性的異同-2012中南大學(xué)生物化學(xué)第13頁，課件共165頁，創(chuàng)作于2023年2月

4、DNA的熔解溫度（Tm）TmDNA的變性是爆發(fā)式的，變性作用發(fā)生在一個很窄的溫度范圍內(nèi)。第14頁，課件共165頁，創(chuàng)作于2023年2月

DNA的熔解溫度（Tm）：（1）定義：DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)失去一半時對應(yīng)的溫度。

變性劑如甲酰胺、尿素、甲醛等破壞氫鍵，妨礙堿基堆積，使Tm下降。DNA的Tm一般在82—95℃之間（2）影響DNA熔解溫度Tm值的因素:①DNA均一性：

②G-C含量：G-C含量與Tm值成正比。③介質(zhì)中離子強(qiáng)度：第15頁，課件共165頁，創(chuàng)作于2023年2月1、概念:若蛋白質(zhì)變性程度較輕，去除變性因素后，可緩慢地重新自發(fā)折疊成原來的構(gòu)象，恢復(fù)或部分恢復(fù)其原有的構(gòu)象和功能，稱為復(fù)性(renaturation)

這種變性也稱為可逆變性。2、方法：透析或超濾除去變性劑，或稀釋3、舉例：有些蛋白質(zhì)的變性作用是可逆的，其變性如不超過一定限度，經(jīng)適當(dāng)處理后，可重新變?yōu)樘烊坏鞍踪|(zhì)。

7、蛋白質(zhì)的復(fù)性第16頁，課件共165頁，創(chuàng)作于2023年2月牛胰核糖核酸酶變性和復(fù)性第17頁，課件共165頁，創(chuàng)作于2023年2月1DNA復(fù)性(renaturation)的定義

在適當(dāng)條件下，變性DNA的兩條互補(bǔ)鏈可恢復(fù)天然

的雙螺旋構(gòu)象，這一現(xiàn)象稱為復(fù)性。

熱變性的DNA經(jīng)緩慢冷卻后即可復(fù)性，這一過程稱為退火(annealing)。2DNA復(fù)性后的理化性質(zhì)變化減色效應(yīng):DNA復(fù)性時，其溶液OD260降低DNA的復(fù)性粘度上升浮力密度降低生物活性部分恢復(fù)第18頁，課件共165頁，創(chuàng)作于2023年2月熱變性DNA在緩慢冷卻時可以復(fù)性，快速冷卻不能復(fù)性。

①序列簡單的分子復(fù)性快，如poly(dT)和poly(dA)識別快②DNA片段愈大，擴(kuò)散速度愈低，復(fù)性慢③離子強(qiáng)度↑→有利于復(fù)性④DNA濃度↑→復(fù)性↑復(fù)性速度與DNA的濃度成正比

⑤

環(huán)狀DNA易復(fù)性一般認(rèn)為比Tm低25℃左右的溫度是復(fù)性的最佳條件，越遠(yuǎn)離此溫度，復(fù)性速度就越慢影響復(fù)性的因素第19頁，課件共165頁，創(chuàng)作于2023年2月復(fù)性速度可用Co·t衡量Cot1/2值：（1）概念：當(dāng)C/CO＝１/2時的Cot值定義為Cot1/2值，

Cot1/2＝１/K，即復(fù)性一半時的Cot值.（2）影響Cot1/2值的因素：不同的DNA

的Cot1/2值是不同的與k值有關(guān)；而且DNA分子序列的復(fù)雜性影響K值．DNA分子序列的復(fù)雜性（X值）：

(1)定義為：最長的沒有重復(fù)序列的核苷酸對的數(shù)值．

如（ATATAT）,其X值為2,（ATGC）（ATGC）n的X值為4．(2)X值與Cot1/2值的關(guān)系，X=K·Cot1/2

Cot1/2是與基因組的大小成正比的第20頁，課件共165頁，創(chuàng)作于2023年2月Cot1/2

表明基因組所包含不同序列的總長度復(fù)性的Cot1/2

與其復(fù)雜度成正比。任何DNA

的復(fù)雜度可以通過與復(fù)雜度已知的DNACot1/2

比較得出。通常以大腸桿菌DNA

作為標(biāo)準(zhǔn)。假設(shè)4.2×106

bp

大腸桿菌基因組由不同序列組成第21頁，課件共165頁，創(chuàng)作于2023年2月（1）陽離子可以中和DNA中所帶負(fù)電荷的磷酸基團(tuán)，減弱DNA鏈間的靜電作用，促進(jìn)兩條互補(bǔ)的多核苷酸的相互靠近，從而促進(jìn)DNA的復(fù)性。（2）溫度升高可使DNA變性，因此溫度降低到熔點(diǎn)以下可以促進(jìn)DNA的復(fù)性。（3）DNA鏈的濃度增加可以加快互補(bǔ)鏈隨機(jī)碰撞的速度，從而促進(jìn)DNA的復(fù)性。試述下列因素如何影響DNA的復(fù)性過程。(1)陽離子的存在(2)低于Tm的溫度(3)高濃度的DNA鏈思考第22頁，課件共165頁，創(chuàng)作于2023年2月

在復(fù)性反應(yīng)中如何知道單鏈已經(jīng)結(jié)合成雙鏈了呢可以通過哪些法來檢測？

(1)減色效應(yīng)(hpochromiceffcef)

測定光密度,即OD值(opticaldensity),DNA從單鏈變成雙鏈，OD260減少30%

(2)羥基磷灰石柱層析

羥基磷灰石對雙鏈DNA吸附較牢,不易吸附單鏈

思考判斷：蛋白質(zhì)構(gòu)象變化是分子內(nèi)的共價(jià)鍵斷裂導(dǎo)致的。廈門大學(xué)2009年生物化學(xué)考研試題廈第23頁，課件共165頁，創(chuàng)作于2023年2月蛋白質(zhì)變性后，其性質(zhì)有哪些變化？并解釋

四川大學(xué)2011、廈門大學(xué)2005生物化學(xué)2.蛋白質(zhì)變性主要由于氫鍵的破壞這一概念是由Anfinsen提出來的（是非題-）復(fù)旦大學(xué)2000年3.蛋白質(zhì)變性的實(shí)質(zhì)是非共價(jià)鍵斷裂，天然構(gòu)象解體，但共價(jià)鍵未發(fā)生斷裂。（是非題

-）中國科學(xué)院06年4.1所有變性蛋白質(zhì)都可以復(fù)性。（是非題-）4.2核酸變性后對紫外光的吸收能力增強(qiáng)。（是非題+）4.3核酸熱變性有何特點(diǎn)？Tm值和Cot值分別表示什么？各有何應(yīng)用價(jià)值？華東師范大學(xué)2006年思考題第24頁，課件共165頁，創(chuàng)作于2023年2月

江蘇大學(xué)2004年碩士研究生入學(xué)考試生物化學(xué)試卷5.1核酸變性或降解時，出現(xiàn)減色效應(yīng)。（是非題-）5.2結(jié)晶蛋白質(zhì)都是變性蛋白質(zhì)。（是非題-）5.3鹽析法可使蛋白質(zhì)沉淀，但不引起變性，所以常用于蛋白質(zhì)的分離和純化。（是非題+）5.4蛋白質(zhì)的變性是蛋白質(zhì)分子立體結(jié)構(gòu)的破壞，因此常涉及肽鍵的斷裂。（是非題-）5.5變性DNA的復(fù)性與

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等有關(guān)。思考題第25頁，課件共165頁，創(chuàng)作于2023年2月6．下列關(guān)于蛋白質(zhì)變性的敘述，哪項(xiàng)是錯誤的（）?

A．生物活性降低或喪失

B．蛋白質(zhì)空間構(gòu)象破壞

C．280nm光吸收反應(yīng)增強(qiáng)

D．溶解度增加

E．易被蛋白酶水解江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院2005年醫(yī)學(xué)生物化學(xué)（碩士）7.雙鏈DNA分子中GC含量越高，Tm值就越大（判斷？）

復(fù)旦大學(xué)2000年8.DNA的Tm值（）

A.只與DNA鏈的長短有直接關(guān)系

B.與GC堿基對的含量成正比

C.與AT堿基對的含量成正比D.與堿基組成無關(guān)

E.所有真核生物Tm都一樣湛江海洋大學(xué)2003年

思考題第26頁，課件共165頁，創(chuàng)作于2023年2月8．中山大學(xué)生物化學(xué)試題8.1變性溫度與DNA分子中的G－C含量成()關(guān)系8.2尿素是蛋白質(zhì)的變性劑，高濃度尿素可拆開蛋白質(zhì)分子中的二硫鍵。(判斷正誤題)

8.3簡述導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性的原因。在實(shí)驗(yàn)操作中，可采取哪些手段減少蛋白質(zhì)分離純化過程中的變性機(jī)會？

8.4酶的抑制劑通過使酶蛋白變性而引起酶活力的降低或失活(判斷正誤題)。9.一段DNA的Tm為83攝氏度，求ATCG百分比？-廈大2012生化思考題第27頁，課件共165頁，創(chuàng)作于2023年2月9.DNA變性時，隨著結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的變化，下述變化除何種外均會發(fā)生。(

)A.發(fā)生螺旋－線團(tuán)轉(zhuǎn)換B.沉降系數(shù)增加

C.減色效應(yīng)D.黏度下降10.

堿基堆積力在穩(wěn)定核酸結(jié)構(gòu)中非常重要。（1）堿基堆積力的化學(xué)本質(zhì)究竟是什么。（2）在核酸結(jié)構(gòu)中，經(jīng)?？吹浇Y(jié)合的金屬元素，他們所起的作用是什么。（3）氫鍵也參與穩(wěn)定核酸的結(jié)構(gòu)，但在哪一方面不同于堿基堆積力和金屬離子與核酸的作用

-江南大學(xué)2009年生物化學(xué)

11.簡述導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性的主要因素，如何在蛋白質(zhì)分離純化中減少其變性的機(jī)會。

-江南大學(xué)2010年生物化學(xué)思考題第28頁，課件共165頁，創(chuàng)作于2023年2月12.

有兩份DNA樣品，一份含腺嘌呤32%，另外一份含17%，求兩份樣品的鳥嘌呤，胞嘧啶，胸腺嘧啶的相對比例，并分析當(dāng)中那個可能取自于嗜熱菌，依據(jù)是什么？

-2012暨南大學(xué)生物化學(xué)13.何為核酸變性，何為增色效應(yīng)，產(chǎn)生增色效應(yīng)的原因是什么？-2012年山東師范大學(xué)生物化學(xué)14.從生物樣品中提取天然蛋白時，為什么一般要求用緩沖液而且有一定離子強(qiáng)度？為什么強(qiáng)調(diào)在低溫下操作而不是常溫。

-中國農(nóng)業(yè)大學(xué)2010年生物化學(xué)思考題第29頁，課件共165頁，創(chuàng)作于2023年2月（一）蛋白質(zhì)的兩性電離

蛋白質(zhì)分子除兩端的氨基和羧基可解離外，氨基酸殘基側(cè)鏈中某些基團(tuán)，在一定的溶液pH條件下都可解離成帶負(fù)電荷或正電荷的基團(tuán)。

在蛋白質(zhì)分子中，游離的α—NH2和α—COOH相距較遠(yuǎn)，靜電引力減弱，故：

a末端的α—NH2的pK′值減少

b末端的α—COOH的pK′值增大二、蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)P291第30頁，課件共165頁，創(chuàng)作于2023年2月蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)(isoelectricpoint,pI)

當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)溶液處于某一pH時，蛋白質(zhì)解離成正、負(fù)離子的趨勢相等，即成為兼性離子，凈電荷為零，此時溶液的pH稱為蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)。在等電點(diǎn)時蛋白質(zhì)的溶解度最小，在電場中不移動。第31頁，課件共165頁，創(chuàng)作于2023年2月

pH=pI時，蛋白質(zhì)凈電荷為零，蛋白質(zhì)分子在電場中不移動

pH＞pI

時，蛋白質(zhì)凈電荷為負(fù)，蛋白質(zhì)分子在電場中向陽極移動

pH＜pI

時，蛋白質(zhì)凈電荷為正，蛋白質(zhì)分子在電場中向陰極移動在pI時，蛋白質(zhì)失去了膠體的穩(wěn)定條件，即沒有相同電荷相互排斥的作用。所以不穩(wěn)定，溶解度最小，易沉淀。溶液中蛋白質(zhì)顆粒

可用pI-pH衡量蛋白質(zhì)或氨基酸所帶電荷第32頁，課件共165頁，創(chuàng)作于2023年2月

判斷氨基酸所帶的凈電荷，用pI-pH比pH-pI更好，為什么？

當(dāng)一種氨基酸的凈電荷用q=pI-pH表達(dá)時，若q為正值，則該氨基酸帶正電荷；若q為負(fù)值，則該氨基酸帶負(fù)電荷。 q值的正與負(fù)和該氨基酸所帶電荷的種類是一致的。如果采用q=pH-pI來表達(dá)，則會出現(xiàn)相反的結(jié)果，即q為負(fù)值時，氨基酸帶正電荷；q為正值時，氨基酸帶負(fù)電荷。因此，用pI-pH更好。思考題第33頁，課件共165頁，創(chuàng)作于2023年2月思考題第34頁，課件共165頁，創(chuàng)作于2023年2月1．處于等電點(diǎn)的蛋白質(zhì)（）

a.分子不帶電荷b.分子最不穩(wěn)定,易變性

c.分子帶的電荷最多d.易聚合成多聚體

e.易被蛋白酶水解

2．將蛋白質(zhì)溶液的PH值調(diào)節(jié)到其等電點(diǎn)時（）

a.可使蛋白質(zhì)穩(wěn)定性增加

b.可使蛋白質(zhì)表面的凈電荷不變

c.可使蛋白質(zhì)表面的凈電荷增加

d.可使蛋白質(zhì)膠體溶液穩(wěn)定性降低，易于沉淀。

e.對蛋白質(zhì)表面水化膜無影響思考題第35頁，課件共165頁，創(chuàng)作于2023年2月

中國科學(xué)院2002年研究生入學(xué)試題（判斷）3.1酶的最適pH與酶的等電點(diǎn)是兩個不同的概念,但兩者之間有相關(guān)性,兩個數(shù)值通常比較接近或相同.3.2蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)和它所含的酸性氨基酸殘基和堿性氨基酸殘基的數(shù)目比例有關(guān)3.3蛋白質(zhì)在處于等電點(diǎn)時的溶解度A.最小;B.最大;C.與等電點(diǎn)沒有關(guān)系.4.1．溶液的pH可以影響氨基酸的等電點(diǎn)（判斷）.

南京大學(xué)20005、在某一溶液中含有三種蛋白質(zhì)，其性質(zhì)如下

a

相對分子質(zhì)量40000

等電點(diǎn)8.5b

400005.9c

600005.9設(shè)計(jì)一個方案純化這三種蛋白。蘇州大學(xué)2005思考題第36頁，課件共165頁，創(chuàng)作于2023年2月2、蛋白質(zhì)的等離子點(diǎn)（特征常數(shù)）

蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)在有中性鹽存在下可以發(fā)生明顯的變化，原因是蛋白質(zhì)分子中某些解離基團(tuán)與中性鹽中的離子相結(jié)合。蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)在一定程度上決定于介質(zhì)中離子的組成。

等離子點(diǎn)（isoionicpoint）：沒有其它鹽類干擾時，蛋白質(zhì)質(zhì)子供體基團(tuán)解離出來的質(zhì)子數(shù)與質(zhì)子受體基團(tuán)結(jié)合的質(zhì)子數(shù)相等時的pH稱為等離子點(diǎn)(蛋白質(zhì)的等離子點(diǎn)：指在純水中（即沒有其它鹽類存在）蛋白質(zhì)的正離子數(shù)等于負(fù)離子數(shù)的pH值。)第37頁，課件共165頁，創(chuàng)作于2023年2月（二）、蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)1.蛋白質(zhì)溶液穩(wěn)定的因素：

蛋白質(zhì)分子大小屬于膠體質(zhì)點(diǎn)范圍（1）水化層：分子表面上親水基團(tuán)在水溶液中能與水分子起水化作用（2）雙電層（電荷）：分子表面上的可解離基團(tuán)，在適當(dāng)?shù)膒H條件下，都帶有相同的電荷，與其周圍的反離子構(gòu)成穩(wěn)定的雙電層。

P299第38頁，課件共165頁，創(chuàng)作于2023年2月2、蛋白質(zhì)的沉淀（1）概念：蛋白質(zhì)分子發(fā)生凝聚，從溶液中析出的現(xiàn)象。（2）原理：破壞穩(wěn)定因素：水化膜和雙電層（3）沉淀方法：①鹽析法②有機(jī)溶劑沉淀③重金屬鹽沉淀?xiàng)l件:pH＞pI(Pr-M+)

④某些酸類沉淀?xiàng)l件：pH＜pI(Pr+X-)

⑤加熱變性沉淀沉淀⑥等點(diǎn)的沉淀第39頁，課件共165頁，創(chuàng)作于2023年2月①鹽析法定義：加高濃度中性鹽使蛋白質(zhì)沉淀析出的現(xiàn)象。

常用的中性鹽主要有硫酸銨，優(yōu)點(diǎn)是溫度系數(shù)小而溶解度大（另外：NaCl、NaSO4等）。原理：破壞蛋白質(zhì)膠體周圍的水化膜，中和了蛋白質(zhì)分子的電荷，使蛋白質(zhì)沉淀而析出。分段鹽析：調(diào)節(jié)鹽濃度，可使混合蛋白質(zhì)溶液中的幾種蛋白質(zhì)分段析出。蛋白質(zhì)不變性溫度;pH值;蛋白質(zhì)濃度影響鹽析的因素有：第40頁，課件共165頁，創(chuàng)作于2023年2月鹽析法-實(shí)例分析蛋清中加硫酸銨至50%飽和度，則球蛋白先析出；繼續(xù)加入硫酸銨至飽和，則清蛋白沉淀析出。微生物發(fā)酵生產(chǎn)酶制劑就是采用鹽析的作用原理，從發(fā)酵中把目的酶分離提取。實(shí)驗(yàn)室常用的鹽析試劑為硫酸銨的原因：中山大學(xué)2009

第41頁，課件共165頁，創(chuàng)作于2023年2月②有機(jī)溶劑沉淀

有機(jī)溶劑（和水互溶）乙醇、丙酮等。

原理：有機(jī)溶劑引起蛋白質(zhì)沉淀的主要原因是（1）加入有機(jī)溶劑使水溶液的介電常數(shù)降低，因而增加了兩個相反電荷基團(tuán)之間的吸引力，促進(jìn)了蛋白質(zhì)分子的聚集和沉淀。（2）有機(jī)溶劑引起蛋白質(zhì)沉淀的另一種解釋認(rèn)為與鹽析相似，有機(jī)溶劑與蛋白質(zhì)爭奪水化水，致使蛋白質(zhì)脫除水化膜，而易于聚集形成沉淀。低溫蛋白質(zhì)不變性有機(jī)溶劑沉淀蛋白質(zhì)時，介電常數(shù)的增加使離子間的靜電作用的減弱而致（判斷）復(fù)旦大學(xué)2002生物化學(xué)第42頁，課件共165頁，創(chuàng)作于2023年2月有機(jī)溶劑沉淀

pH=pI時，可加速蛋白質(zhì)沉淀。

低溫（0℃∽4℃）。第43頁，課件共165頁，創(chuàng)作于2023年2月有機(jī)溶劑沉淀注意事項(xiàng)有機(jī)溶劑長時間作用于蛋白質(zhì)會引起變性，操作時需注意：（1）低溫操作：提取液和有機(jī)溶劑都需事先冷卻。向提取液中加入有機(jī)溶劑時，要邊加邊攪拌，防止局部過熱，引起變性。（2）有機(jī)溶劑與蛋白質(zhì)接觸時間不能過長，在沉淀完全的前提下，時間越短越好，要及時分離沉淀，除去有機(jī)溶劑。實(shí)例分析：食品級的酶制劑的生產(chǎn)，中草藥注射液、胰島素的制備大都用有機(jī)溶劑分離沉淀蛋白質(zhì)。有機(jī)溶劑的添加量最好不超過沉淀目的酶所必要的數(shù)量，多加有機(jī)溶劑會使更多的色素、糊精及其它雜質(zhì)沉淀。第44頁，課件共165頁，創(chuàng)作于2023年2月③重金屬鹽沉淀

氯化高汞、硝酸銀、醋酸鉛、三氯化鐵等。蛋白質(zhì)變性重金屬與蛋白質(zhì)形成不溶性鹽而沉淀。第45頁，課件共165頁，創(chuàng)作于2023年2月反應(yīng)條件:

pH

<

pI

NH3+PrCOO-

NH3+Pr

COOHH+X-

NH3+

X-Pr

COOH不溶性蛋白鹽

苦味酸、單寧酸、鎢酸、鞣酸、三氯乙酸等。X-：酸根蛋白質(zhì)變性

機(jī)理：在酸性條件下，蛋白質(zhì)帶正電，可以與生物堿試劑的酸根離子結(jié)合而產(chǎn)生沉淀。④

生物堿試劑和某些酸類沉淀第46頁，課件共165頁，創(chuàng)作于2023年2月生物堿試劑和某些酸類沉淀實(shí)例分析實(shí)例分析：在啤酒生產(chǎn)工藝中有麥芽汁加啤酒花煮沸的工序，其目的之一就是借酒花中的單寧類物質(zhì)懷變性蛋白質(zhì)或鹽形成沉淀，使麥芽汁得以澄清，從而防止成品啤酒產(chǎn)生蛋白質(zhì)混濁。“柿石癥”的產(chǎn)生就是由于空腹吃了大量的柿子，柿子中含有大量的單寧酸，使腸胃中的蛋白質(zhì)凝固變性而成為不能被消化的“柿石”第47頁，課件共165頁，創(chuàng)作于2023年2月⑤等電點(diǎn)沉淀：蛋白質(zhì)不變性，原理？第48頁，課件共165頁，創(chuàng)作于2023年2月⑥加熱變性沉淀實(shí)例分析：我國很早便創(chuàng)造了將大豆蛋白質(zhì)的濃溶液加熱并點(diǎn)入少量鹽鹵（含MgCl2）的制豆腐方法，這是成功地應(yīng)用加熱變性沉淀蛋白的一個例子。老豆腐：鹽鹵作凝固劑（含水量80%—85%）嫩豆腐：石膏或葡萄糖酸內(nèi)酯作凝固劑制（含水量為85%—90%）第49頁，課件共165頁，創(chuàng)作于2023年2月思考題1.蛋白質(zhì)溶液出現(xiàn)沉淀與蛋白質(zhì)變性存在必然的關(guān)系。

-中國科學(xué)院2005年生物化學(xué)判斷題2.蛋白質(zhì)沉淀劑都能引起蛋白質(zhì)明顯的變性

2003年福州大學(xué)生物化學(xué)蛋白質(zhì)沉淀未必變性，變性未必沉淀第50頁，課件共165頁，創(chuàng)作于2023年2月A.可逆沉淀

在發(fā)生沉淀反應(yīng)時，分子內(nèi)部、空間結(jié)構(gòu)并未發(fā)生顯著變化，基本上保持原有的性質(zhì)，沉淀因素除去后，能再溶于水溶液中。這種作用稱為可逆沉淀反應(yīng)。如大多數(shù)蛋白質(zhì)的鹽析作用或在低溫下用乙醇（或丙酮）短時間作用于蛋白質(zhì)以及利用等電點(diǎn)的沉淀，提純蛋白質(zhì)時，常利用此類反應(yīng)。B.不可逆沉淀/變性沉淀在發(fā)生沉淀反應(yīng)時，內(nèi)部結(jié)構(gòu)、空間構(gòu)象遭到破壞，失去原來的天然性質(zhì)，這時蛋白質(zhì)已發(fā)生變性。這種變性蛋白質(zhì)的沉淀不能再溶解于原來溶劑或水溶液中的作用稱為不可逆沉淀反應(yīng)或變性沉淀。重金屬鹽、生物堿試劑，強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、加熱、震蕩、超聲波、有機(jī)溶劑等都能使蛋白質(zhì)發(fā)生不可逆沉淀反應(yīng)。沉淀類型第51頁，課件共165頁，創(chuàng)作于2023年2月沉淀DNA1、預(yù)冷無水乙醇沉淀DNA（0.6倍體積的異丙醇）

DNA溶液是DNA以水合狀態(tài)穩(wěn)定存在，當(dāng)加入乙醇時，乙醇會奪去DNA周圍的水分子，使DNA失水而易于聚合。一般實(shí)驗(yàn)中，是加2倍體積的無水乙醇與DNA相混合。2.在用乙醇沉淀DNA時，為什么一定要加NaAc或NaCl

？

在pH為8左右的溶液中，DNA分子是帶負(fù)電荷的，加一定濃度的NaAc或NaCl，使Na+中和DNA分子上的負(fù)電荷，減少DNA分子之間的同性電荷相斥力，易于互相聚合而形成DNA鈉鹽沉淀。在用乙醇沉淀DNA時可使B-DNA向A-DNA轉(zhuǎn)化？第52頁，課件共165頁，創(chuàng)作于2023年2月沉淀DNA1.酒精沉淀核酸時，下列何種長度核苷酸不能被沉淀（）

10；

20；

50；

100

中國科學(xué)院2003年生物化學(xué)

2.與氨基酸相似的蛋白質(zhì)性質(zhì)是:

A,高分子性質(zhì)B,膠體性質(zhì)C,沉淀性質(zhì)D,兩性性質(zhì)E,變性性質(zhì)

青島大學(xué)2009年

生物化學(xué)第53頁，課件共165頁，創(chuàng)作于2023年2月（三）蛋白質(zhì)的紫外吸收大部分蛋白質(zhì)均含有帶芳香環(huán)的苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。這三種氨基酸的在280nm附近有最大光吸收。因此，大多數(shù)蛋白質(zhì)在280nm

附近顯示強(qiáng)的吸收。蛋白質(zhì)的OD280與其濃度呈正比關(guān)系，因此可作蛋白質(zhì)定量測定利用這個性質(zhì)，可以對蛋白質(zhì)進(jìn)行定性定量鑒定。第54頁，課件共165頁，創(chuàng)作于2023年2月比色管第55頁，課件共165頁，創(chuàng)作于2023年2月三、蛋白質(zhì)的分子大小和形狀蛋白質(zhì)是分子量很大的生物分子，相對分子質(zhì)量大于6000，最高可達(dá)40000000（煙草花葉病毒）。測分子量的方法：★化學(xué)組成測定最低分子量★SDS法★凝膠過濾法★滲透壓法★擴(kuò)散系數(shù)法★沉降系數(shù)法和沉降平衡法第56頁，課件共165頁，創(chuàng)作于2023年2月

利用化學(xué)分析定量測定蛋白質(zhì)中某一特殊元素的含量，并假定蛋白質(zhì)分子中含1個這種元素，即可測算最低Mr。

如：用化學(xué)分析法測定血紅蛋白質(zhì)中含F(xiàn)e0.34％，則

最低Mr=55.84×100/0.34=16700；

用其它方法測定，其實(shí)際Mr為16700的4倍，由此可知，血紅蛋白含有4個Fe的原子，而不是1個Fe。

牛血清白蛋白含Trp0.58%

最低M=35200，實(shí)際為69000，含2個Trp1、根據(jù)化學(xué)成分測定最小相對分子質(zhì)量一個蛋白質(zhì)樣品中氮素含量1.2g，則含蛋白質(zhì)為（）廈門大學(xué)2009第57頁，課件共165頁，創(chuàng)作于2023年2月例題：一種純酶含亮氨酸（Mr131）1.65%，含異亮氨酸

（Mr131）2.48%，求最低相對分子質(zhì)量。解：按照Leu的百分含量計(jì)算，最低MrX1：

X1=(100

131)/1.65=7939.4按照Ile的百分含量計(jì)算最低MrX2：

X2=(100

131)/2.48=5282.3由于X1和X2數(shù)字差異較大，提示這種酶含Leu和Ile不止1

個，為了估算Leu和Ile的個數(shù)，首先計(jì)算：

X1/X2=7939.4/5282.3≈1.5

這種酶含任何氨基酸的個數(shù)均應(yīng)是整數(shù)，說明該酶至少含有2個Leu，3個Ile，其最低相對分子質(zhì)量為：

7939.42=15878.8或5282.3×3=15846.9根據(jù)化學(xué)成分測定最小相對分子質(zhì)量第58頁，課件共165頁，創(chuàng)作于2023年2月2、根據(jù)滲透壓測定平均分子量滲透壓摩爾數(shù)等電點(diǎn)附近稱重第59頁，課件共165頁，創(chuàng)作于2023年2月3、擴(kuò)散系數(shù)法測定平均分子量擴(kuò)散：由于濃度差引起的溶質(zhì)分子的凈遷移。擴(kuò)散的熱力學(xué)驅(qū)動力是熵的增加。擴(kuò)散系數(shù)D：等于當(dāng)濃度梯度為一個單位時，在一秒鐘內(nèi)通過1cm2面積所擴(kuò)散的溶質(zhì)量。擴(kuò)散系數(shù)隨Mr的增加而降低，但對Mr的變化不敏感。對球形的大分子來說，擴(kuò)散系數(shù)與Mr的立方根成反比。第60頁，課件共165頁，創(chuàng)作于2023年2月擴(kuò)散系數(shù)法測定平均分子量第61頁，課件共165頁，創(chuàng)作于2023年2月

沉降速度法

在高速離心力作用下，蛋白質(zhì)的沉降速度與分子大小和形狀有關(guān)，因?yàn)槌两迪禂?shù)S大體上和分子量成正比關(guān)系，故可應(yīng)用超速離心法測定蛋白質(zhì)分子量，但對分子形狀高度不對稱的大多數(shù)纖維狀蛋白質(zhì)不適用。超速離心法既可以用來測定蛋白質(zhì)的分子量也可以用作分離純化蛋白質(zhì)。4.沉降分析法分為沉降速度法和沉降平衡法兩種，也可以用于蛋白質(zhì)或DNA的分離第62頁，課件共165頁，創(chuàng)作于2023年2月沉降分析法-沉降速度法沉降系數(shù)：溶質(zhì)顆粒在單位離心場中的沉降速度，用S表示。一個S單位，為1×10-13秒。相對分子質(zhì)量越大，S值越大。蛋白質(zhì)的沉降系數(shù)：1～200S。

s=————vω2x

沉降系數(shù)：質(zhì)量1克的物質(zhì)在離心場中受到1dyn的離心力作用下，1秒鐘下降的距離。第63頁，課件共165頁，創(chuàng)作于2023年2月沉降分析法-

（B）.沉降平衡法

在離心過程中，外圍高濃度區(qū)的蛋白質(zhì)向中心擴(kuò)散，如轉(zhuǎn)速較低，二者可達(dá)到穩(wěn)定平衡。此時測定離心管中不同區(qū)域的蛋白濃度，可按下式計(jì)算分子量：其中C2和C1是離軸心距離為x2和x1時的蛋白質(zhì)濃度。沉降平衡法的優(yōu)點(diǎn)是不需要擴(kuò)散系數(shù)，且離心速度較低（8000－20000轉(zhuǎn)每分）。但要達(dá)到平衡常常需要幾天時間。M=2RTln(C2/C1)÷[ω2(1－Vρ)(x22－x12)]第64頁，課件共165頁，創(chuàng)作于2023年2月比較：核酸的沉降特性P515（1）密度梯度超速離心測定核酸的浮力密度：

8MCsCl，45000rpm，16h

密度梯度：1.80g/ml→1.55g/ml

平衡時：浮力密度=CsCl密度=離心力ρ=ρ0+4.2ω2（r2-r02）×10-10（2）密度梯度超速離心測定DNA的G-C含量

G-C含量與DNA的浮力密度之間呈正比關(guān)系

ρ=0.1xG-C+1.658xG-C=（ρ-1.658）×10

但是5-甲基胞嘧啶多的DNA，其實(shí)際浮力密度會降低，低于理論值？。第65頁，課件共165頁，創(chuàng)作于2023年2月核酸的沉降特性與超速離心的應(yīng)用超螺旋DNA或RNA＞DNA變性DNA＞雙鏈DNA＞蛋白質(zhì)，變性程度越大，浮力密度越大密度（3）密度梯度超速離心研究核酸的構(gòu)象（4）密度梯度超速離心純化

RNA或不同構(gòu)象的DNA第66頁，課件共165頁，創(chuàng)作于2023年2月5、凝膠過濾法

原理：凝膠過濾所用介質(zhì)為凝膠珠，其內(nèi)部為多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。一定型號的凝膠網(wǎng)孔大小一定，只允許相應(yīng)大小的分子進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部，大分子則被排阻在外。洗脫時大分子隨洗脫液從顆粒間隙流下來，洗脫液體積小；小分子在顆粒網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中穿來穿去，歷程長，后洗脫下來，洗脫體積大。也可以用于蛋白質(zhì)分離純化。

洗脫體積：自加入樣品開始到該組分的洗脫峰峰頂（即收集液中該組分濃度最大時）出現(xiàn)時所流出的洗脫液體積。第67頁，課件共165頁，創(chuàng)作于2023年2月凝膠過濾法第68頁，課件共165頁，創(chuàng)作于2023年2月凝膠過濾法測定樣品蛋白質(zhì)分子量的方法：①測得幾種標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的洗脫體積〔Ve〕；②以相對分子質(zhì)量對數(shù)（logM）對Ve作圖,得標(biāo)準(zhǔn)曲線；③再測出未知樣品洗脫體積〔Ve〕；④從標(biāo)準(zhǔn)曲線上可查出樣品蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量。第69頁，課件共165頁，創(chuàng)作于2023年2月（二）、SDS電泳來測定蛋白質(zhì)的分子量

蛋白質(zhì)在電場中的遷移率取決于它所帶的凈電荷以及分子大小和形狀等因素。加入SDS（十二烷基磺酸鈉）和少量巰基乙醇，則蛋白質(zhì)分子的遷移率主要取決于它的分子量，而與原來所帶電荷、分子形狀無關(guān)。

SDS是變性劑，它能破裂蛋白質(zhì)分子中的氫鍵和疏水作用。巰基乙醇打開二硫鍵，因此使蛋白質(zhì)分子處于伸展?fàn)顟B(tài)。此時SDS以其烴鏈與蛋白質(zhì)分子的側(cè)鏈結(jié)合成復(fù)合物，大約每兩個氨基酸殘基結(jié)合一個SDS分子。第70頁，課件共165頁，創(chuàng)作于2023年2月SDS的兩個作用

1、由于SDS是陰離子，使多肽表面覆蓋的負(fù)電荷遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過蛋白質(zhì)分子原有的電荷量，消除了原來的電荷差異。

第71頁，課件共165頁，創(chuàng)作于2023年2月SDS的兩個作用

2、改變了蛋白質(zhì)單體分子的構(gòu)象，都成雪茄狀，不同蛋白質(zhì)的SDS復(fù)合物的短軸長度都相同，長軸長度隨其分子量的大小成正比變化。第72頁，課件共165頁，創(chuàng)作于2023年2月SDS電泳

SDS電泳電泳時，它的遷移率一般電泳時它的遷移率第73頁，課件共165頁，創(chuàng)作于2023年2月SDS電泳來測定蛋白質(zhì)的分子量的方法①用SDS和巰基乙醇（打開二硫鍵）處理蛋白質(zhì)變性并與SDS結(jié)合，形成SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物，使得不同蛋白質(zhì)分子均帶負(fù)電（SDS帶負(fù)電），且荷質(zhì)比相同；不同蛋白質(zhì)分子具有相似的構(gòu)象。②用幾種標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量的對數(shù)值對它們的遷移率作圖③測出待測樣品的遷移率④從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出樣品的相對分子質(zhì)量第74頁，課件共165頁，創(chuàng)作于2023年2月SDS電泳來測定蛋白質(zhì)的分子量的方法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：以標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)分子量的對數(shù)log(M)為縱坐標(biāo)，Rf值為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。第75頁，課件共165頁，創(chuàng)作于2023年2月Disc(native)(自然性電泳法)第76頁，課件共165頁，創(chuàng)作于2023年2月NoncovalentcovalentHowaboutcovalentlink?或巰基乙醇★此方法只能測得亞基肽鏈的相對分子質(zhì)量第77頁，課件共165頁，創(chuàng)作于2023年2月SDS：十二烷基磺酸鈉

1、溶解膜蛋白及脂肪，從而使細(xì)胞膜破裂2、溶解核膜和核小體，使其解聚，將核酸釋放出來，使蛋白質(zhì)與核酸分離3、使蛋白質(zhì)變性沉淀4、對核酸酶有抑制作用5、屏蔽蛋白質(zhì)電荷：SDS6、改變蛋白質(zhì)形狀：SDS

簡要說明下列5種試劑在生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用

SDS，EDTA，SephadexG-25，瓊脂糖和緩沖液

-2009南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生物化學(xué)第78頁，課件共165頁，創(chuàng)作于2023年2月SDS：十二烷基磺酸鈉

1．下列哪種方法可用于測定蛋白質(zhì)分子量（）

a.SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳b.凱氏定氮法

c.280/260nm紫外吸收比值d.熒光分光光度法

e.茚三酮反應(yīng)

2．蛋白質(zhì)變性是由于（）

a.蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)改變b.蛋白質(zhì)亞基解聚

c.蛋白質(zhì)空間構(gòu)象破壞d.輔基脫落

e.蛋白質(zhì)水解第79頁，課件共165頁，創(chuàng)作于2023年2月四、蛋白質(zhì)分離純化的一般原則鹽析、等電點(diǎn)沉淀、有機(jī)溶劑沉淀層析和電泳第80頁，課件共165頁，創(chuàng)作于2023年2月保存方法：①晶體保存：結(jié)晶過程本身也伴隨著一定程度的提純。能否結(jié)晶不僅是純度的一個指標(biāo)，也是判斷制品是否有活性的指標(biāo)。純度越高，溶液越濃，越容易結(jié)晶。結(jié)晶方法：使溶液略處于過飽和狀態(tài)。降低溫度、鹽析、加有機(jī)溶劑、調(diào)節(jié)pH、接入晶種。②凍干粉保存：③溶液保存：加入抗凍劑（50%甘油）后-20-70℃保存。第81頁，課件共165頁，創(chuàng)作于2023年2月蛋白質(zhì)純化的一般注意事項(xiàng)操作盡可能置于冰上或者冷庫內(nèi)進(jìn)行；不要太稀，蛋白質(zhì)濃度維持在μg/mlmg/ml；合適的pH，除非是進(jìn)行聚焦層析，所使用的緩沖液pH避免與pI相同；使用蛋白酶抑制劑，防止蛋白酶對目標(biāo)蛋白的降解；避免樣品反復(fù)凍融和劇烈攪拌，以防蛋白質(zhì)變性；緩沖溶液成分盡量模擬細(xì)胞環(huán)境；在緩沖溶液加入0.11mmol/LDTT（或-巰基乙醇），防止蛋白質(zhì)的氧化；加110mmol/LEDTA金屬螯合劑，防止重金屬對目標(biāo)蛋白的破壞；使用滅菌溶液，防止微生物生長。第82頁，課件共165頁，創(chuàng)作于2023年2月五、分離純化蛋白質(zhì)第83頁，課件共165頁，創(chuàng)作于2023年2月思考題1.說出5種分離蛋白質(zhì)的方法及依據(jù)-中山大學(xué)2012生物化學(xué)

2.怎樣從組織中分離提純某一特定蛋白質(zhì)？（簡述主要步驟和使用的方法）

-華南理工大學(xué)2009生物化學(xué)第84頁，課件共165頁，創(chuàng)作于2023年2月（一）、根據(jù)分子大小和形狀的差異：①透析和超濾法：除去小分子物質(zhì)②密度梯度離心法③凝膠過濾法方法

1、透析和超過濾

透析：根據(jù)的是蛋白質(zhì)不能通過半透膜的性質(zhì)，而水和無機(jī)鹽等小分子自由通過，此方法只能將蛋白質(zhì)和小分子物質(zhì)分開，不能將不同蛋白質(zhì)分開。第85頁，課件共165頁，創(chuàng)作于2023年2月超過濾超過濾：是利用外加壓或離心使水和其他分通過半透膜，蛋白質(zhì)留在膜上。

濃縮：使用超濾來增加所需大分子溶質(zhì)的濃度，即大分子被超濾膜截留而小分子和溶劑可自由通過。梯度分離：按分子大小梯度分離樣品中的溶質(zhì)分子時，超濾是一種經(jīng)濟(jì)有效的方法。脫鹽／純化：脫鹽即從大分子溶液中去除鹽、非水性溶劑和小分子物質(zhì)的過程。超濾的主要應(yīng)用：第86頁，課件共165頁，創(chuàng)作于2023年2月透析和超過濾1、輔酶或輔基的判斷2、可逆抑制劑和不可逆抑制劑判斷3、蛋白質(zhì)濃縮除鹽或小分子化合物4、牛胰核糖核酸酶本性和復(fù)性試驗(yàn)第87頁，課件共165頁，創(chuàng)作于2023年2月2.密度梯度（區(qū)帶）離心

在密度梯度介質(zhì)中進(jìn)行的依密度而分離的離心法。各組分會依其密度分布在與其自身密度相同的液層中。密度梯度可以離心前預(yù)先制備(如疊加不同濃度蔗糖、甘油)或在離心中自然形成(如使用氯化銫時)?？捎糜诜治鲂突蛑苽湫偷碾x心分離。通常分為速率區(qū)帶離心和等密度離心兩種方式。

第88頁，課件共165頁，創(chuàng)作于2023年2月密度梯度（區(qū)帶）離心第89頁，課件共165頁，創(chuàng)作于2023年2月3、凝膠過濾又稱分子篩層析，是根據(jù)分子大小分離蛋白質(zhì)混合物最有效的方法之一。常用葡聚糖凝膠（商品名為Sephadex)和瓊脂糖凝膠（商品名Sepharose）。網(wǎng)孔大小—用交聯(lián)劑與葡聚糖或瓊脂糖的比例實(shí)現(xiàn)。大分子先洗脫下來，小分子后洗下來。（保持天然酶狀態(tài)）

凝膠過濾可用于：蛋白質(zhì)分離純化、分子量鑒定、或濃縮除鹽第90頁，課件共165頁，創(chuàng)作于2023年2月葡聚糖凝膠（商品名為Sephadex)交聯(lián)葡聚糖凝膠的種類有G-10，G-15，G-25，G-50，G-75，G-100，G-150，和G-200。G后面的阿拉伯?dāng)?shù)為凝膠得水值的10倍。例如，G-25為每克凝膠膨脹時吸水2.5克，同樣G-200克每克千膠吸水20克。因此，“G”反映，凝膠的交聯(lián)程度，膨脹程度及分部范圍。后面的阿拉伯?dāng)?shù)字越大,表示交聯(lián)越小,凝膠孔徑越大,分子量分離范圍越大.凝膠的溶脹體積.

當(dāng)我們從生物組織中用鹽析法提取蛋白質(zhì)后，常需要進(jìn)行蛋白質(zhì)的脫鹽工作，可介質(zhì)為葡聚糖凝膠G-25用適當(dāng)?shù)南疵搫┻M(jìn)行洗脫，經(jīng)凝膠層析，就可以將大分子蛋白質(zhì)與小分子鹽類分離。蛋白質(zhì)和鹽哪個先洗脫？第91頁，課件共165頁，創(chuàng)作于2023年2月凝膠過濾第92頁，課件共165頁，創(chuàng)作于2023年2月凝膠過濾1．今有下列蛋白質(zhì)的混合物：

A.分子量12000pI=10

B.分子量62000pI=4

C.分子量28000pI=7

D.分子量9000pI=5

若不考慮其它因素，當(dāng)它們：

（1）流經(jīng)陰離子交換劑DEAE纖維素，用線性鹽梯度洗脫時（2）流經(jīng)SephadexG-50凝膠排阻柱時；這些蛋白質(zhì)的洗脫順序如何？6、有一個多亞基球狀蛋白質(zhì)，其肽鏈間有二硫鍵。試問由一下那種方法，可以測得該蛋白質(zhì)的分子量？請說明理由。（1）SDS（2）等密度沉降（3）凝膠過濾法2008年中國農(nóng)業(yè)大學(xué)生物化學(xué)第93頁，課件共165頁，創(chuàng)作于2023年2月（二）利用溶解度差別的分離方法：鹽析法有機(jī)溶劑沉淀法等電點(diǎn)沉淀法重金屬鹽選擇性沉淀法（pH》pI，蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷）生物堿和酸選擇性沉淀法（pH《pI，蛋白質(zhì)帶正電荷）熱處理沉淀法（銅鋅SOD，65℃、15分鐘、穩(wěn)定第94頁，課件共165頁，創(chuàng)作于2023年2月

1.等電點(diǎn)沉淀和PH控制

在等電點(diǎn)時，蛋白質(zhì)分子以兩性離子形式存在，其分子凈電荷為零，此時蛋白質(zhì)分子顆粒在溶液中因沒有相同電荷的相互排斥，分子相互之間的作用力減弱，其顆粒極易碰撞、凝聚而產(chǎn)生沉淀，所以蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)時，其溶解度最小，最易形成沉淀物。

不同的蛋白質(zhì)，具有不同的等電點(diǎn)。在生產(chǎn)過程中應(yīng)根據(jù)分離要求，除去目的產(chǎn)物之外的雜蛋白第95頁，課件共165頁，創(chuàng)作于2023年2月2、有機(jī)溶劑分級分離法（1）定義：利用不同蛋白質(zhì)在不同濃度的有機(jī)溶劑中的溶解度不同而使蛋白質(zhì)分離的方法，稱為有機(jī)溶劑沉淀法。經(jīng)常使用的有機(jī)溶劑是乙醇和丙酮。（2）作用機(jī)理：

（1）降低水溶液的介電常數(shù)，使溶質(zhì)溶解度降低；（2）破壞大分子周圍水膜，使溶解度降低。（3）優(yōu)點(diǎn)：比鹽析法析出的沉淀容易過濾或離心分離，分辨力比鹽析法好，溶劑也容易除去。第96頁，課件共165頁，創(chuàng)作于2023年2月3、鹽溶和鹽析常用的鹽：為溶解度大的中性鹽，如(NH4)2SO4、NaCl、MgCl2、NH4Cl、KCl等的飽和溶液鹽溶：低濃度的中性鹽在蛋白質(zhì)分子表面形成雙電層使蛋白質(zhì)溶解度增加；鹽析：高濃度的中性鹽破壞蛋白質(zhì)分子表面的水化層使蛋白質(zhì)溶解度降低，發(fā)生沉淀析出。（PH多在PI）分段鹽析：不同蛋白質(zhì)鹽析所需的鹽濃度不同，蛋白質(zhì)溶液中，逐漸增大鹽濃度，不同蛋白質(zhì)先后析出，稱分段鹽析（例如：半飽和硫酸銨溶液可沉淀可卵清球蛋白，而飽和硫酸銨溶液沉淀卵清清蛋白）第97頁，課件共165頁，創(chuàng)作于2023年2月鹽溶第98頁，課件共165頁，創(chuàng)作于2023年2月鹽析第99頁，課件共165頁，創(chuàng)作于2023年2月有A,B,C

三種蛋白質(zhì),在PH=7進(jìn)行電泳，結(jié)果如下圖。若在PH=7用中性鹽沉淀這三種蛋白質(zhì)，哪種首先沉淀，其次是哪一種，最后是哪一種？

從電泳結(jié)果可知

PH7時C蛋白帶電最多，B蛋白次之，A最少，在PH7時用中性鹽沉淀，帶電最少的首先沉淀。因此

A先沉淀，其次是B，最后是C。思考題第100頁，課件共165頁，創(chuàng)作于2023年2月（三）根據(jù)電荷不同的分離方法

電泳：帶電顆粒在電場中移動的現(xiàn)象。分子大小不同的蛋白質(zhì)所帶凈電荷密度不同，遷移率不同，電泳時可以分開自由界面電泳：又稱移動界面電泳，是指在沒有支持介質(zhì)的溶液中進(jìn)行的電泳。其裝置復(fù)雜，價(jià)格昂貴，費(fèi)時費(fèi)力，不便于推廣應(yīng)用。區(qū)帶電泳：是指有支持介質(zhì)的電泳，待分離物質(zhì)在支持介質(zhì)上分離成若干區(qū)帶。支持介質(zhì)的作用主要是防止電泳過程中的對流和擴(kuò)散，以使被分離的成分得到最大分辨率的分離。電泳和離子交換層析第101頁，課件共165頁，創(chuàng)作于2023年2月支持介質(zhì)種類的不同，區(qū)帶電泳可分為：①紙電泳：用濾紙作為支持介質(zhì)，多用于核苷酸的定性定量分析。②醋酸纖維素薄膜電泳：醫(yī)學(xué)上，常用于分析血清蛋白、胎盤球蛋白，其優(yōu)點(diǎn)是簡便迅速，便于保存照相，比紙電泳分辨率高。以上二種類型的電泳，由于介質(zhì)的孔徑度大，沒有分子篩效應(yīng)，主要靠被分離物的電荷多少進(jìn)行分離。第102頁，課件共165頁，創(chuàng)作于2023年2月支持介質(zhì)種類的不同，區(qū)帶電泳可分為：③淀粉凝膠電泳：多用于同工酶分析，凝膠鋪厚些，可一層一層剝層分析（一板多測）。天然淀粉經(jīng)加工處理即可使用，但孔徑度可調(diào)性差，并且由于其批號之間的質(zhì)量相差很大，很難得到重復(fù)的電泳結(jié)果，加之電泳時間長，操作麻煩，分辨率低，實(shí)驗(yàn)室中已很少使用。④瓊脂糖凝膠電泳：一般用于核酸的分離分析。瓊脂糖凝膠孔徑度較大，對大部分蛋白質(zhì)只有很小的分子篩效應(yīng)。⑤聚丙烯酰胺凝膠電泳：可用于核酸和蛋白質(zhì)的分離、純化及檢測。其分辨率較高。聚丙烯酰胺和瓊脂糖是目前實(shí)驗(yàn)室最常用的支持介質(zhì)第103頁，課件共165頁，創(chuàng)作于2023年2月聚丙烯酰胺凝膠電泳

PAGE根據(jù)其有無濃縮效應(yīng)，分為連續(xù)系統(tǒng)和不連續(xù)系統(tǒng)兩大類。

連續(xù)系統(tǒng)電泳體系中緩沖液pH值及凝膠濃度相同，帶電顆粒在電場作用下，主要靠電荷效應(yīng)不同和分子篩效應(yīng)進(jìn)行分離。

不連續(xù)系統(tǒng)中由于緩沖液離子成分，pH，凝膠濃度及電位梯度的不連續(xù)性，帶電顆粒在電場中泳動不僅有電荷效應(yīng)，分子篩效應(yīng)，還具有濃縮效應(yīng)，因而其分離條帶清晰度及分辨率均比前者更佳。第104頁，課件共165頁，創(chuàng)作于2023年2月濃縮效應(yīng)：樣品膠中間濃縮膠下層分離膠第105頁，課件共165頁，創(chuàng)作于2023年2月聚丙烯酰胺凝膠電泳示意圖第106頁，課件共165頁，創(chuàng)作于2023年2月

1.某蛋白質(zhì)溶液分別用SDS和陽離子交換柱層析進(jìn)行分析，得到如圖所示的結(jié)果。關(guān)于該溶液中蛋白質(zhì)的組成，你的結(jié)論是什么？思考題陽離子交換柱層析進(jìn)行分析SDS2.比較說明SDS(SDS-聚丙烯酰胺電泳)和瓊脂糖凝膠電泳的物質(zhì)浙江大學(xué)2004第107頁，課件共165頁，創(chuàng)作于2023年2月

2、等電聚焦電泳：

在電泳支持介質(zhì)中加入載體兩性電解質(zhì)通以直流電后在正負(fù)極之間形成穩(wěn)定、連續(xù)和線性的pH梯度，蛋白質(zhì)在pH梯度凝膠中受電場力作用下泳動，它的分離僅僅決定于其本身的等電點(diǎn)。

當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)分子一旦到達(dá)它的等電點(diǎn)位置，分子所帶凈電荷為0，就不能再遷移。如果它向等電點(diǎn)兩側(cè)擴(kuò)散，凈電荷就不再為0，都會被陰極或陽極吸引回來，直至回到凈電荷為0的位置，因此蛋白質(zhì)在與其本身pI相等的pH位置被聚焦成窄而穩(wěn)定的區(qū)帶。這種效應(yīng)稱之為“聚焦效應(yīng)”。保證了蛋白質(zhì)分離的高分辨率，是等電聚焦最為突出的優(yōu)點(diǎn)。第108頁，課件共165頁，創(chuàng)作于2023年2月等電聚焦電泳：第109頁，課件共165頁，創(chuàng)作于2023年2月2Delectrophoresis1stdimensionSeparationbasedonpIisoelectricfocusing2nddimensionNormalSDS第110頁，課件共165頁，創(chuàng)作于2023年2月

3、離子交換層析法離子交換層析（IonExchangeChromatography簡稱為IEC）是以離子交換劑為固定相，特定的離子溶液為流動相，依據(jù)各種離子或離子化合物與離子交換劑的結(jié)合力不同進(jìn)行分離純化的層析方式。由于蛋白質(zhì)也有等電點(diǎn)，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)處于不同的pH條件下，其帶電狀況也不同。如：陰離子交換基質(zhì)結(jié)合帶有負(fù)電荷的蛋白質(zhì)，所以這類蛋白質(zhì)被留在柱子上，然后通過提高洗脫液中的鹽濃度等措施，將吸附在柱子上的蛋白質(zhì)洗脫下來。結(jié)合較弱的蛋白質(zhì)首先被洗脫下來。第111頁，課件共165頁，創(chuàng)作于2023年2月

Ionexchangechromatography離子交換劑由基質(zhì)、電荷基團(tuán)（或稱功能基團(tuán)）和反離子

組成?；|(zhì)一般是不溶性聚合物，如樹脂，纖維素，葡聚糖，醇脂糖等；

樹脂－N+(CH3)—

OH-

纖維素－O—CH2—COO-—Na＋

基質(zhì)電荷基團(tuán)

反離子

陽離子交換樹脂：

陰離子交換樹脂：陽離子交換劑：CM（羧甲基）陰離子交換劑：DEAE（二乙胺乙基）第112頁，課件共165頁，創(chuàng)作于2023年2月離子交換基質(zhì)陽離子交換樹脂-負(fù)電荷+++陰離子交換樹脂-正電荷---蛋白質(zhì)+蛋白質(zhì)PI=3PI=7PI=10蛋白質(zhì)-第113頁，課件共165頁，創(chuàng)作于2023年2月離子交換基質(zhì)陽離子交換樹脂-負(fù)電荷陰離子交換樹脂-正電荷---1.蛋白質(zhì)+蛋白質(zhì)1.PI=32.PI=73.PI=102.蛋白質(zhì)+3.蛋白質(zhì)+第114頁，課件共165頁，創(chuàng)作于2023年2月(2)洗脫方法在離子交換層析過程中，常用梯度溶液進(jìn)行洗脫，而溶液的梯度則是由鹽濃度或酸堿度的變化形成的。一種是增加離子強(qiáng)度的梯度溶液。二、改變pH值的梯度溶液，如果使用的是陽離子交換劑，pH值應(yīng)從低到高遞增；如果使用的是陰離子交換劑，pH值應(yīng)從高到低遞減。陽離子交換劑適合分離PI>7的蛋白質(zhì)(先用pH值低于7的緩沖液處理)陰離子交換劑適合分離PI<7的蛋白質(zhì)(先用pH值高于7的緩沖液處理)第115頁，課件共165頁，創(chuàng)作于2023年2月

1.SDS測定蛋白質(zhì)分子量的方法是根據(jù)蛋白質(zhì)分子所帶電荷不同（判斷）。蘇州大學(xué)2004

2.SDS是根據(jù)蛋白質(zhì)分子極性大小來對它們進(jìn)行分離的一種電泳技術(shù)（判斷）.

中國科學(xué)院微生物研究所

3.下列有關(guān)核酸電泳和SDS電泳說法錯誤的是

A.核酸電泳和SDS電泳中DNA和蛋白均向正極泳動；

B.SDS不連續(xù)垂直電泳中，上層是分離膠，下層濃縮膠

C.RNA分離需要變性條件下的瓊脂糖凝膠電泳；

D.核酸電泳中溴化乙啶結(jié)合DNA的堿基對，在紫外下顯色

中國計(jì)量學(xué)院2008年

思考題第116頁，課件共165頁，創(chuàng)作于2023年2月

1、極性的硅膠和氧氣鋁以及非極性的活性碳等具有吸附能力

2、吸咐層析法是：利用物質(zhì)與不同蛋白質(zhì)的吸附能力的強(qiáng)弱不同達(dá)到分離目的。

3、蛋白質(zhì)提純中，最廣泛和最有效的是結(jié)晶磷酸鈣即羥基磷灰石。（四）蛋白質(zhì)的選擇吸附分離羥基磷灰石第117頁，課件共165頁，創(chuàng)作于2023年2月疏水作用層析疏水層析利用高鹽吸附、低鹽洗脫的原理利用蛋白質(zhì)表面存在的疏水區(qū)域的強(qiáng)度、大小不同，而被吸附到連接有疏水基團(tuán)的層析介質(zhì)上。離子強(qiáng)度增大可增強(qiáng)吸附能力，因此常常在2mol/L或3mol/LNaCl溶解樣品，洗脫時可通過降低鹽濃度、增加乙二醇濃度進(jìn)行梯度洗脫。第118頁，課件共165頁，創(chuàng)作于2023年2月

原理：利用分子間具有專一親和力而設(shè)計(jì)的層析技術(shù)。

專一親和力分子對：酶與底物、特異性抗原與抗體、DNA和RNA、激素和其受體

載體：使親和物固相化的水不溶性化合物。如：纖維素、聚丙烯酰胺凝膠、瓊脂糖凝膠、聚苯乙烯、乙烯、多孔玻璃。Affinitychromatography（五）根據(jù)配體特異性的分離—親和層析第119頁，課件共165頁，創(chuàng)作于2023年2月從總RNA分離純化mRNA-親合層析法第120頁，課件共165頁，創(chuàng)作于2023年2月假定你發(fā)現(xiàn)一種新的蛋白質(zhì)：蛋白質(zhì)X

1.

如何得到這種蛋白質(zhì)?-蛋白質(zhì)的分離、純化技術(shù)

2.這種蛋白質(zhì)的大?。?（SDS）

3.

它的pI是多少？-（等電聚焦）

4.

其他細(xì)胞或其他生物體內(nèi)是否存在？-Western印跡）

5.其一級結(jié)構(gòu)如何？

（序列分析）

6.其三維結(jié)構(gòu)又如何？

X-射線衍射和核磁共振思考：從蛋白質(zhì)粗提液分離一種靶酶，說明每一步原理，如何鑒定靶酶純度

-中國海洋大學(xué)2012生物化學(xué)思考題：蛋白質(zhì)研究方法第121頁，課件共165頁，創(chuàng)作于2023年2月已知蛋白質(zhì)X是一種真核生物蛋白質(zhì)。某實(shí)驗(yàn)室利用大腸桿菌對該蛋白質(zhì)進(jìn)行了表達(dá)，以獲得一定量的高純度的蛋白質(zhì)進(jìn)行研究。蛋白質(zhì)X特性如下：

①相對分子質(zhì)量為49500；

②等電點(diǎn)為4.2；

③具有磷酸水解酶活性，最適pH=8.0；

④在大腸桿菌中表達(dá)時容易形成包涵體。

請為該蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)一套最有效的純化方案。要求：

①純化方案開始于收集菌體，終止于蛋白質(zhì)X的鑒定，實(shí)驗(yàn)分步進(jìn)行；②充分利用已知條件；③解釋每一步操作的理由；北京師范大學(xué)2006年思考題第122頁，課件共165頁，創(chuàng)作于2023年2月包涵體包涵體是外源基因在原核細(xì)胞中表達(dá)時，尤其在大腸桿菌中高效表達(dá)時，形成的由膜包裹的高密度、不溶性蛋白質(zhì)顆粒，在顯微鏡下觀察時為高折射區(qū)，與胞質(zhì)中其他成分有明顯區(qū)別。分析：（1）.用緩沖液漂洗菌體細(xì)胞，離心收集菌體（2）.破碎細(xì)胞，離心收集包涵體（3）.破碎包涵體釋放蛋白質(zhì)（4）.根據(jù)等電點(diǎn)和分子量設(shè)計(jì)分離方式（5）.根據(jù)活性鑒定分離得到的酶第123頁，課件共165頁，創(chuàng)作于2023年2月思考題1.怎樣從組織中分離提純某一特定蛋白質(zhì)？（簡述主要步驟和使用的方法）（20分）華南理工大學(xué)2006生物化學(xué)2.1在一抽提液中含有三種蛋白質(zhì),其性質(zhì)如下:

蛋白質(zhì)

相對分子質(zhì)量

等電點(diǎn)A

20000

8.5B

21000

5.9C

5000

6.0試設(shè)計(jì)一個方案來分離純化這三種蛋白質(zhì)。2若細(xì)胞色素C，?-乳球蛋白，一種未知蛋白質(zhì)和血紅蛋白用凝膠過濾分離時，其洗脫體分別為118、58、37與24ml，試問未知蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量。(假定所有蛋白質(zhì)都是球形的,相對分子質(zhì)量都是在凝膠過濾的分級分離范圍內(nèi)。)

華東師范大學(xué)2007年生物化學(xué)

第124頁，課件共165頁，創(chuàng)作于2023年2月思考題中山大學(xué)2010年生物化學(xué)

第125頁，課件共165頁，創(chuàng)作于2023年2月核酸的分離純化1細(xì)胞的破碎液氮研磨法、化學(xué)處理法(SDS等）生化法（溶菌酶、纖維素酶等）2核蛋白的解聚、變性蛋白的去除

核酸與蛋白質(zhì)的結(jié)合力主要是正負(fù)靜電吸力(核酸與堿性蛋白的結(jié)合)、氫鍵和非極性的范德華力。

2.1

加入濃鹽溶液：核酸-蛋白質(zhì)加入NaCl后，破壞靜電吸力，使氫鍵破壞，核蛋白解聚第126頁，課件共165頁，創(chuàng)作于2023年2月核酸的分離純化

2.2加入SDS:SDS除有破胞和抑制核酸酶的作用外，還具有使核酸從蛋白質(zhì)上游離出來的功能2.3氯仿抽提

酚／氯仿混合使用能增加去除蛋白的效果，并對核酸酶有抑制作用。氯仿比重大，能加速有機(jī)相與水相分層，減少殘留在水相中的酚，同時氯仿具有去除植物色素和蔗糖的作用。在酚/氯仿抽提核酸提取液時，需要振搖，為防止起泡和促使水相與有機(jī)相的分離，再加上一定量的異戊醇（氯：異戊醉=24：1）。第127頁，課件共165頁，創(chuàng)作于2023年2月核酸沉淀

（1）乙醇優(yōu)點(diǎn)：對鹽類沉淀少，沉淀中所含跡量乙醇易揮發(fā)除去，不影響以后實(shí)驗(yàn)。缺點(diǎn)：需要量大，一般要求低溫操作。（2）異丙醇

優(yōu)點(diǎn)：需體積小，速度快，適于濃度低、體積大的DNA樣品沉淀。一般不需低溫長時間放置。

缺點(diǎn)：易使鹽類、蔗糖與DNA共沉淀．異丙醇難以揮發(fā)除去。所以，最后用70％乙醇漂洗數(shù)次。第128頁，課件共165頁，創(chuàng)作于2023年2月核酸的分離純化(1)電泳:(2)層析法:層析法是利用不同物質(zhì)某些理化性質(zhì)的差異而建立的分離分析方法。包括吸附層析、親和層析、離子交換層析等方法在內(nèi)的層析法。(3)密度梯度離心法:密度梯度離心也用于核酸的分離和分析。雙鏈DNA、單鏈DNA、RNA和蛋白質(zhì)具有不同的密度,因而可經(jīng)密度梯度離心形式形成不同密度的純樣品區(qū)帶,該法適用于大量核酸樣本的制備。在進(jìn)行密度梯度超離心時，RNA比DNA沉降快（判斷）第129頁，課件共165頁，創(chuàng)作于2023年2月核酸的分離純化

1.如何鑒定新提取細(xì)胞總RNA的質(zhì)量（完整性）、純度和濃度

(1)RNA可以使用非變性或變性凝膠電泳進(jìn)行檢測。在非變性電泳中，可以分離混合物中不同分子量的RNA分子，凡是無法確定分子量。只有在變性情況下，RNA分子完全伸展，其泳動率才與分子量成正比。判斷RNA提取物的完整性是進(jìn)行電泳的主要目的之一。完整的未降解的RNA制品的電泳圖譜應(yīng)可清晰看到18srRNA、28srRNA、5srRNA的三條帶，且28srRNA的亮度應(yīng)為18srRNA的兩倍。(3)光吸收可以測濃度中山大學(xué)2009生物化學(xué)第130頁，課件共165頁，創(chuàng)作于2023年2月核酸的定量測定RNADNA磷酸+戊糖+