免疫定性試驗(yàn)結(jié)果判讀周育洋

免疫定性試驗(yàn)結(jié)果判讀周育洋第一頁(yè)，共八十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五今天的復(fù)習(xí)題1、簡(jiǎn)述實(shí)驗(yàn)室選擇免疫定性檢測(cè)敏感性、特異性、預(yù)測(cè)值、符合率的原則，并舉例說(shuō)明。2、簡(jiǎn)述丙肝抗體檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室診斷流程。3、簡(jiǎn)述造成RPR試驗(yàn)假陽(yáng)性的一部分原因。第二頁(yè)，共八十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五本課件免疫定性試驗(yàn)僅指臨床通常使用的基于抗原-抗體反應(yīng)原理的試驗(yàn)抗原-抗體反應(yīng)的特點(diǎn)：*特異性*比例性前帶（抗體多）后帶（抗原多）*可逆性pH離子強(qiáng)度第三頁(yè)，共八十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五抗原抗體反應(yīng)類型沉淀反應(yīng)可溶性抗原凝集反應(yīng)顆粒性抗原補(bǔ)體參于的反應(yīng)中和反應(yīng)標(biāo)記免疫熒光放射

酶標(biāo)發(fā)光金標(biāo)

第四頁(yè)，共八十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五影響抗原-抗體反應(yīng)的因素反應(yīng)物自身的因素：抗原：可溶性顆粒性細(xì)菌細(xì)胞抗體：來(lái)源濃度特異性親和力反應(yīng)環(huán)境條件：電解質(zhì)酸堿度溫度

第五頁(yè)，共八十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五原材料-決定性抗原類型：天然（自然生成，未經(jīng)修飾）變性（或在其它方面改變）合成（用片段和甚至是單獨(dú)的表位）純度：用于純化的方法應(yīng)盡可能的精密。為了允許較小組分的檢測(cè)，應(yīng)該有足夠的量亞型：全面性突變：抗原性改變第六頁(yè)，共八十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五影響因素原材料抗體類型：?jiǎn)慰寺?、混合單克隆、多克隆或單克?多克隆組合。非特異活性：可以來(lái)自“異常”人免疫球蛋白，包括風(fēng)濕因子和異嗜性抗體（抗-反芻類、抗-鳥(niǎo)類或抗-鼠類）。效價(jià)：最佳反應(yīng)的工作稀釋度。推薦的稀釋度應(yīng)該只作為起始點(diǎn)被接受。第七頁(yè)，共八十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五內(nèi)源性干擾因素

類風(fēng)濕因子、補(bǔ)體、異嗜性抗體、治療性抗體、自身抗體、溶菌酶、磷脂、藥物小分子、總蛋白濃度等。第八頁(yè)，共八十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五類風(fēng)濕因子（RF）干擾RF一般為IgM型，亦有IgG和IgA型。RF具有與變性IgG產(chǎn)生非特異結(jié)合的特點(diǎn)。在捕獲法IgM型特異抗體的測(cè)定中表現(xiàn)最為明顯，因?yàn)榇藭r(shí)固相包被的抗體為抗人μ鏈抗體，IgM型RF的存在可使其大量結(jié)合于固相。第九頁(yè)，共八十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五類風(fēng)濕因子干擾的排除稀釋標(biāo)本改變標(biāo)記抗體用變性IgG預(yù)先封閉標(biāo)本中RF測(cè)抗原,可加入還原劑如2-巰基乙醇去除RF使用特異的雞抗體IgY作為標(biāo)記或固相抗體第十頁(yè)，共八十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五補(bǔ)體干擾固相抗體和標(biāo)記二抗的抗體分子可發(fā)生變構(gòu)，從而其Fc段的補(bǔ)體C1q結(jié)合位點(diǎn)被暴露出來(lái)，這樣C1q就成為一個(gè)中介物將二者交聯(lián)起來(lái)，從而出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果。固相抗體也會(huì)因?yàn)榛罨a(bǔ)體的結(jié)合，封閉抗體的抗原表位結(jié)合能力，而引起假陰性結(jié)果或結(jié)果偏低。

第十一頁(yè)，共八十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五補(bǔ)體干擾的排除56℃30min加熱可使標(biāo)本中補(bǔ)體C1q滅活使用特異的雞抗體IgY作為標(biāo)記或固相抗體第十二頁(yè)，共八十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五自身抗體干擾自身抗體如抗甲狀腺球蛋白、抗胰島素等，能與其相應(yīng)靶抗原結(jié)合形成復(fù)合物，在免疫測(cè)定方法中可干擾相應(yīng)抗原抗體的測(cè)定。為避免以上情況出現(xiàn)，可在測(cè)定前用理化方法將其解離。

第十三頁(yè)，共八十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五影響因素--反應(yīng)模式雙抗體（原）夾心法間接法競(jìng)爭(zhēng)法競(jìng)爭(zhēng)中和法捕獲法一步法的增強(qiáng)試劑聚乙二醇，用來(lái)增強(qiáng)抗原-抗體復(fù)合物的生成，加速非特異性綁定和反應(yīng)時(shí)間，但可以引起非免疫化學(xué)沉淀，降低試驗(yàn)的敏感性和特異性。液液相技術(shù)固液相技術(shù)二步法第十四頁(yè)，共八十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五影響因素--信號(hào)放大系統(tǒng)顯色劑：OPD，TMB熒光：4-MUP時(shí)間分辨：稀土元素化學(xué)發(fā)光：魯米諾，吖啶酯類，AMPPD電化學(xué)發(fā)光：三甲基吡啶釕第十五頁(yè)，共八十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五外源性干擾因素溶血、細(xì)菌污染、標(biāo)本貯存時(shí)間過(guò)長(zhǎng)、凝固不全、反復(fù)凍融。第十六頁(yè)，共八十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五標(biāo)本溶血注意避免出現(xiàn)嚴(yán)重溶血。血紅蛋白類似過(guò)氧化物的活性，使反應(yīng)顯色。第十七頁(yè)，共八十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五標(biāo)本被細(xì)菌污染細(xì)菌的生長(zhǎng)，其所分泌的一些酶可能會(huì)對(duì)抗原抗體等蛋白產(chǎn)生分解作用。細(xì)菌的內(nèi)源性酶如大腸桿菌的β-半乳糖苷酶本身會(huì)對(duì)用相應(yīng)酶作標(biāo)記的測(cè)定方法產(chǎn)生非特異性干擾。

第十八頁(yè)，共八十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五標(biāo)本貯存時(shí)間過(guò)長(zhǎng)標(biāo)本在2～8℃下保存時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，IgG可聚合成多聚體，在間接法免疫測(cè)定中會(huì)導(dǎo)致本底過(guò)深、甚至造成假陽(yáng)性。血清標(biāo)本如是以無(wú)菌操作分離，則可以在2～8℃下保存一周，如為有菌操作，則建議冰凍保存。樣本的長(zhǎng)時(shí)間保存，應(yīng)在－70℃以下。

第十九頁(yè)，共八十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五標(biāo)本凝固不全血液采集后，離心分離血清沒(méi)有完全凝固，離出的“血清”并非為完全的血清，其中仍殘留部分纖維蛋白原，易造成假陽(yáng)性結(jié)果。血液標(biāo)本采集后，應(yīng)使其充分凝固后再分離血清，或標(biāo)本采集時(shí)用帶分離膠的采血管或于采血管中加入適當(dāng)?shù)拇倌齽５诙?yè)，共八十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五冰凍保存標(biāo)本避免反復(fù)凍融反復(fù)凍融所產(chǎn)生的機(jī)械剪切力將對(duì)標(biāo)本中的蛋白等分子產(chǎn)生破壞作用，從而引起假陰性結(jié)果。第二十一頁(yè)，共八十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五幾個(gè)統(tǒng)計(jì)學(xué)概念

第二十二頁(yè)，共八十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五正態(tài)分布(Gaussiandistribution)當(dāng)一質(zhì)控物用同一方法在不同的時(shí)間重復(fù)多次測(cè)定，且測(cè)定數(shù)據(jù)足夠多時(shí)，如以橫軸表示測(cè)定值，縱軸表示在大量測(cè)定中相應(yīng)測(cè)定值的個(gè)數(shù)，則可得到一個(gè)兩頭低，中間高，中為所有測(cè)定值的均值，左右對(duì)稱的“鐘形”曲線，亦即正態(tài)分布，又稱高斯分布。第二十三頁(yè)，共八十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五正態(tài)分布的基本統(tǒng)計(jì)學(xué)含義可用均數(shù)（X）、標(biāo)準(zhǔn)差（s）和概率來(lái)說(shuō)明。第二十四頁(yè)，共八十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五重復(fù)性條件是指在短的間隔時(shí)間內(nèi)，在同一實(shí)驗(yàn)室對(duì)相同的測(cè)定項(xiàng)目使用同一方法和同一儀器設(shè)備，由相同的操作者獲得獨(dú)立的測(cè)定結(jié)果的條件。第二十五頁(yè)，共八十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五診斷敏感性（sensitivityofdiagnosis）

是指將實(shí)際患病者正確地判斷為陽(yáng)性（真陽(yáng)性）的百分率。陽(yáng)性預(yù)測(cè)值（positivepredictivevalue,PPV）

是指特定試驗(yàn)方法測(cè)定得到的陽(yáng)性結(jié)果中真陽(yáng)性的比率第二十六頁(yè)，共八十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五診斷特異性（specificityofdiagnosis）

是指將實(shí)際無(wú)病者正確地判斷為陰性（真陰性）的百分率。陰性預(yù)示值(negativepredictivevalue,NPV)

是指特定試驗(yàn)方法測(cè)定得到的陰性結(jié)果中真陰性的比率。第二十七頁(yè)，共八十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五診斷效率

（efficiencyofdiagnosis）是指能準(zhǔn)確區(qū)分患者和非患者的能力。理想測(cè)定方法的診斷效率應(yīng)為100%。第二十八頁(yè)，共八十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五臨床免疫檢測(cè)類型第二十九頁(yè)，共八十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五定量分析：確定被分析物的含量。產(chǎn)生一個(gè)與待測(cè)分析物的濃度相關(guān)的光譜信號(hào)，如果有已知濃度的分析物制劑做校準(zhǔn)，分析物的實(shí)際濃度就可以被確定。第三十頁(yè)，共八十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五定性分析只關(guān)注分析物的有或無(wú)，而不關(guān)心有多少（定量）。又分為用肉眼和經(jīng)驗(yàn)判斷結(jié)果的純定性試驗(yàn)和用讀數(shù)儀根據(jù)CUTOFF值或域值判定結(jié)果的量值化定性試驗(yàn)。陽(yáng)性結(jié)果只說(shuō)明分析信號(hào)超過(guò)了分析閾值（檢測(cè)限）或cut-off值（cut-off值的設(shè)定給出了簡(jiǎn)要的敏感性和特異性組合）。一般針對(duì)感染原和來(lái)自天然感染或免疫接種的相關(guān)抗體的相關(guān)檢測(cè)。第三十一頁(yè)，共八十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五定性免疫檢驗(yàn)方法較多，主要有沉淀試驗(yàn)、凝集試驗(yàn)、熒光免疫試驗(yàn)、酶免疫試驗(yàn)和金標(biāo)法。其中金標(biāo)法雖然是靈敏、特異、快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確率較高的體外診斷方法。但是仍存在不足之處，易出現(xiàn)假陽(yáng)性和假陰性，尤其是國(guó)產(chǎn)的金標(biāo)試劑，所以建議采用ELISA法。第三十二頁(yè)，共八十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五定性免疫檢測(cè)的用途篩選試驗(yàn)用來(lái)檢測(cè)全體人群或人群亞群一個(gè)特征的出現(xiàn)（如感染原或相關(guān)抗體的出現(xiàn)）。一般要求趨向二個(gè)極端：要么有高的臨床敏感性（即超過(guò)95%的臨床檢出率），檢測(cè)結(jié)果保證陰性篩選結(jié)果具有高可能性的沒(méi)有這些特征，而陽(yáng)性結(jié)果可能需要做進(jìn)一步的確證試驗(yàn)；血站系統(tǒng)的傳染病篩查屬于此類。要么有高的特異性，檢測(cè)結(jié)果保證陽(yáng)性篩選結(jié)果具有高可能性的具有這些特征。第三十三頁(yè)，共八十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五診斷試驗(yàn)用來(lái)評(píng)價(jià)具有可疑給予特征（如一種感染的特殊類型）的人。敏感性和特異性應(yīng)該處于相對(duì)平衡狀態(tài)。如果此特征對(duì)治療或預(yù)后考慮很重要，那么敏感性要盡可能的高；而且后續(xù)已有準(zhǔn)確的確證試驗(yàn)，可以不需要高的特異性。感染性疾病的大多數(shù)臨床試驗(yàn)是用于診斷。第三十四頁(yè)，共八十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五

確證試驗(yàn)

獲得篩選或診斷試驗(yàn)陽(yáng)性結(jié)果后，增加的試驗(yàn)用于證明和確認(rèn)此人前面的陽(yáng)性結(jié)果。在這種情況下，主要考慮的性能常常是特異性和陽(yáng)性預(yù)測(cè)值，而不是敏感性和陰性預(yù)測(cè)值；特異性應(yīng)該超過(guò)98到99%。確證試驗(yàn)可以是非免疫化學(xué)的（如，培養(yǎng)或脫氧核糖核酸研究）或免疫化學(xué)的（包括免疫印跡和抗原或抗體中和試驗(yàn)）。如果篩選和診斷試驗(yàn)已具有高的特異性和陽(yáng)性預(yù)測(cè)值，則不需要確證試驗(yàn)。第三十五頁(yè)，共八十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五定性免疫檢驗(yàn)質(zhì)量控制第三十六頁(yè)，共八十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五

已知的弱陽(yáng)性質(zhì)控:每次測(cè)定都應(yīng)至少帶一個(gè)已知的弱陽(yáng)性對(duì)照，從而有助于判斷臨床標(biāo)本的檢測(cè)結(jié)果是否有效。陰性質(zhì)控:必需

每次測(cè)定都必須設(shè)空白對(duì)照、陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照和弱陽(yáng)性對(duì)照。第三十七頁(yè)，共八十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五

CUTOFF值的選擇一個(gè)試驗(yàn)一般不可能有完全的（100%）敏感性、特異性或預(yù)測(cè)值。Cutoff值的選擇和來(lái)自一個(gè)檢測(cè)的結(jié)果報(bào)告，應(yīng)該考慮以下這些性能指標(biāo)哪個(gè)更重要：（1）當(dāng)疾病是嚴(yán)重并且可治療的，應(yīng)該不能漏檢；假陽(yáng)性結(jié)果不會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的精神或經(jīng)濟(jì)創(chuàng)傷；不合適的治療僅有輕微的后果需要高敏感性。（2）當(dāng)疾病是嚴(yán)重的但是不能治療；沒(méi)有疾病時(shí)具有心理或公眾健康價(jià)值；假陽(yáng)性結(jié)果可能引起嚴(yán)重的精神或經(jīng)濟(jì)上的創(chuàng)傷（如HIV抗體的確證試驗(yàn)）需要高特異性。第三十八頁(yè)，共八十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五（3）當(dāng)不合適的治療可能導(dǎo)致嚴(yán)重后果，需要高預(yù)測(cè)值。（4）當(dāng)疾病嚴(yán)重但是可治療，并且假陰性或假陽(yáng)性結(jié)果同樣嚴(yán)重（如引起腦膜炎細(xì)菌抗原的分析）需要高符合率。在確定這些因素的合適平衡點(diǎn)時(shí)，廠商或其它檢測(cè)的研發(fā)者應(yīng)該用來(lái)自三種人群的樣本評(píng)估檢測(cè)的性能：感染疾病的人，沒(méi)有疾病的健康人和非討論疾病患者的病人。廠商應(yīng)該標(biāo)明推薦的cut-off值是怎么定義的以及在什么樣的人群應(yīng)用。理想狀態(tài)，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)該在自己的服務(wù)人群中確定區(qū)間和cut-off值。第三十九頁(yè)，共八十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五純定性試驗(yàn)的質(zhì)控要求

臨床免疫純定性試驗(yàn)大都屬于CLIA’88豁免的技術(shù)（waivedtestingsites），包括免疫沉淀、凝集試驗(yàn)、標(biāo)記免疫的金標(biāo)試紙和斑點(diǎn)滲濾、免疫熒光印跡法等等。對(duì)于FDA等批準(zhǔn)家庭使用的技術(shù)，只要求檢測(cè)裝置有內(nèi)對(duì)照，檢測(cè)結(jié)果滿足說(shuō)明書規(guī)定即可；對(duì)于需要經(jīng)驗(yàn)來(lái)判定結(jié)果的技術(shù)仍需在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，均有質(zhì)控的要求，但國(guó)際上無(wú)具體操作的規(guī)定和資料。第四十頁(yè)，共八十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五根據(jù)顯色或發(fā)光直接判定陰陽(yáng)性的技術(shù)，如金標(biāo)試紙，美國(guó)CDC在“CLIA’88豁免的HIV抗體快速檢測(cè)的質(zhì)量保證指南<2007年版>”中要求：除檢測(cè)裝置的內(nèi)對(duì)照外，每檢測(cè)日或分析批，應(yīng)使用弱陽(yáng)性和陰性外對(duì)照作為質(zhì)控。無(wú)判定標(biāo)準(zhǔn)，一般理解為陰、陽(yáng)性質(zhì)控的檢測(cè)結(jié)果分別為陰性和陽(yáng)性即表明在控，相反則為失控。根據(jù)滴度或稀釋度判定陰陽(yáng)性的技術(shù)，如凝集試驗(yàn)，使用弱陽(yáng)性和陰性外對(duì)照質(zhì)控，陽(yáng)性質(zhì)控結(jié)果在均值上下一個(gè)滴度或稀釋度以及陰性質(zhì)控結(jié)果為陰性即為在控，否則視為失控。第四十一頁(yè)，共八十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五失控原因分析

失控信號(hào)的出現(xiàn)受多種因素的影響，包括質(zhì)控物、試劑、儀器、操作以及質(zhì)控規(guī)則本身等等。一旦出現(xiàn)失控信號(hào)，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)該仔細(xì)地分析原因、查找根源，不要拘泥于推薦的程式化的步驟進(jìn)行，而應(yīng)該根據(jù)誤差的來(lái)源和當(dāng)批工作的實(shí)際開(kāi)展排查工作。偶然誤差造成的失控，首先考慮有無(wú)工作條件的變化，如新的質(zhì)控物、新的試劑、儀器故障、人員變動(dòng)、操作程序變化等等；其次查找儀器校準(zhǔn)、環(huán)境因素（水質(zhì)、溫濕度）等原因。系統(tǒng)誤差造成的失控，首先考慮質(zhì)控物或試劑原因，其次查找儀器校準(zhǔn)問(wèn)題，再次分析操作程序、環(huán)境因素等原因。第四十二頁(yè)，共八十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五失控處理

實(shí)驗(yàn)室在確定失控原因后，應(yīng)有針對(duì)性地采取糾正措施；對(duì)重復(fù)或系統(tǒng)性出現(xiàn)的失控原因需引入預(yù)防措施，必要時(shí)還應(yīng)修改程序文件或作業(yè)指導(dǎo)書。對(duì)于失控批的患者標(biāo)本應(yīng)根據(jù)不同情況采取相應(yīng)的重測(cè)方案：陽(yáng)性失控，重測(cè)所有陰性標(biāo)本；陰性失控，重測(cè)所有陽(yáng)性標(biāo)本。第四十三頁(yè)，共八十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五判讀實(shí)例（1）梅毒試驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)室檢查第四十四頁(yè)，共八十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五TPTreponemapalidumsubsp.palidum

蒼白密螺旋體蒼白亞種梅毒(syphilis)是一種疾病，我們只是做相關(guān)的實(shí)驗(yàn)室檢查，對(duì)結(jié)果的解釋必須結(jié)合病史和患者的臨床情況。第四十五頁(yè)，共八十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五現(xiàn)實(shí)意義梅毒感染率逐年增加，2005年在所有甲乙類傳染病僅次于肺結(jié)核、乙型肝炎、痢疾、淋病居第五位。和艾滋病、淋病、肺結(jié)核等呈復(fù)合感染。梅毒感染率逐年增加，不容忽視假陽(yáng)性率也很高陽(yáng)性率：大樣本輸血員0.58%

低危人群（病員）1.52%~1.61%

其中﹥50歲者占53.3%~62.3%

陽(yáng)性率3.02%~3.15%

我們?cè)趺磻?yīng)答：供血與受血者，手術(shù)，創(chuàng)傷性檢查，院內(nèi)感染控制。（婚檢）必查項(xiàng)目。第四十六頁(yè)，共八十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五實(shí)驗(yàn)室診斷（病原體1）DFM暗視野顯微鏡找Tp：病灶組織液、腫大淋巴結(jié)穿刺液。

§Tp呈白色發(fā)光，運(yùn)動(dòng)快速，開(kāi)塞鉆樣旋轉(zhuǎn)。

§單次陽(yáng)性率＜50%，多灶取樣，連續(xù)檢查。

§注意安全防護(hù)。第四十七頁(yè)，共八十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五實(shí)驗(yàn)室診斷（病原體2）DFAT直接熒光抗體檢查Tp：

§病灶組織液、腫大淋巴結(jié)穿刺液。涂片、干燥、丙酮固定。

§FITC─抗Tp單抗染色，熒光顯微鏡檢查。

§注意安全保護(hù)。第四十八頁(yè)，共八十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五實(shí)驗(yàn)室診斷（病原體3）PCR核酸檢查：敏感性差異大，不能區(qū)分T.pallidum亞種。已建立一些新方法（如MGB-TaqMan探針熒光定量PCR），需廣泛驗(yàn)證。第四十九頁(yè)，共八十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五實(shí)驗(yàn)室診斷（血清學(xué)）非密螺旋體抗體試驗(yàn)（nontreponemalantibodytests,NTrAT）:測(cè)抗類脂抗體（反應(yīng)素regain）。

其靶抗原是宿主細(xì)胞被螺旋體感染后釋放的類脂（lipoidal）物質(zhì)、螺旋體釋放的自身脂蛋白樣物質(zhì)（lipoprotein-likematerial）和心磷脂（cardiolipin）密螺旋體抗體試驗(yàn)（treponemalantibodytests,TrAT）：測(cè)抗Tp特異抗體。其靶抗原是Tp的Nichols株的純化處理物。第五十頁(yè)，共八十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五實(shí)驗(yàn)室診斷（NTrAT）NTrAT：1）VDRL（venerealdiseaseresearchlaboratory）2）RPR（rapidplasmareagin）3）USR（unheatedserumreagin）4）TRUST（toluidineredunheated-serumtest）第五十一頁(yè)，共八十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五NTrAT：抗原為心磷脂、膽固醇、卵磷脂按適當(dāng)比例配制的乙醇溶液

1）VDRL：待測(cè)血清加熱滅活，顯微鏡觀察。

2）USR：血清不加熱顯微鏡觀察。

3）RPR：抗原染成黑色，血清不加熱，肉眼觀察。

4）TRUST：抗原染成紅色，血清不加熱，肉眼觀察。第五十二頁(yè)，共八十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五實(shí)驗(yàn)室診斷（TrAT）★TPHA（T.pallidumhemagglutinationassay）★TPPA（T.pllidumparticleagglutinationassay）★金標(biāo)記免疫層析★ELISA-TP★FTA-ABS（fluorescentTp-antibodyabsorption）★FTA-ABS-DS（FTA-ABSdoublestaining）★免疫印跡試驗(yàn)第五十三頁(yè)，共八十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五TrAT：抗原為梅毒螺旋體Nichols株特異抗原。（1）TPHA：Nichols株超聲或SDS提取抗原，包被甲醛、鞣酸處理的SRBC,遇血清中抗體血凝。血清用Reiter株，牛、羊RBC，正常兔血清和兔睪丸提取物吸收。（2）TPPA：染成紅色明膠顆粒包被抗原。試劑盒中未配吸收劑。（3）ELISA：純化或重組T.pallidum抗原（15000、17000、42000、47000）包被，間接法或雙抗原夾心法。未配吸收劑。

第五十四頁(yè)，共八十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五（4）FTA-ABS:Nichols株制片，丙酮固定，待測(cè)血清用含Reiter株吸收劑吸收。FITC-抗人IgG（IgM）示蹤。（5）FTA-ABS-DS：同上，第一次熒光染色用四甲基異硫氰酸羅達(dá)明標(biāo)記的抗人IgG；第二次熒光染色用FITC標(biāo)記抗Tp抗體。（6）免疫印跡（WB）：Nichols株純化抗原SDS，電轉(zhuǎn)印至NC膜或PVDF膜，待測(cè)血清不吸收，與膜上抗原反應(yīng)，再與酶標(biāo)抗人IgG反應(yīng)，顯色。（7）金標(biāo)記免疫層析：膜條上包被純化的Tp抗原，待測(cè)血清不吸收，與膜端金標(biāo)抗人IgG結(jié)合后層析至測(cè)試區(qū)與Tp抗原結(jié)合，出現(xiàn)呈色條帶。第五十五頁(yè)，共八十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五梅毒血清學(xué)試驗(yàn)敏感性與特異性試驗(yàn)

敏感性特異性

一期二期潛伏三期VDRL78（74~87）10095（88~100）71（37~94）98（96~99）RPR86（77~100）10098（95~100）73（36~96）98（93~99）USR80（72~88）10095（88~100）─99TRUST85（77~86）10098（95~100）─99（98~99）NTrAT第五十六頁(yè)，共八十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五試驗(yàn)

敏感性特異性一期二期潛伏三期FTA-ABS84（70~100）1001009697（94~100）FTA-ABS-DS80（69~90）100100─98（97~100）TPHA76（69~90）10097（97~100）9499（98~100）TPPA80（86~100）100100─96（95~100）ELISA-IgG………………97（97~100）…………99（98~100）注：無(wú)分期資料TrAT第五十七頁(yè)，共八十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五梅毒實(shí)驗(yàn)室檢查難點(diǎn)本屬包括4種對(duì)人致病和至少6種對(duì)人不致病的密螺旋體。Tp和其它該屬螺旋體在形態(tài)學(xué)上無(wú)法區(qū)別；核酸雜交試驗(yàn)DNA同源性≧95%；已知的基因序列高度一致性；蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及與某些單克隆抗體反應(yīng)幾乎相同。因此，只能依靠對(duì)人和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的致病譜來(lái)加以區(qū)別。第五十八頁(yè)，共八十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五螺旋體的分類及致病性螺旋體種類

屬種疾病傳播方式或媒介Ⅰ疏螺旋體（Borrelia）伯氏疏螺旋體萊姆病硬蜱回歸熱螺旋體流行性回歸熱體虱赫姆疏螺旋體地方性回歸熱軟婢奮森疏螺旋體多種口腔感染條件致病Ⅱ短螺旋體（Brachyspira）Ⅲ脊螺旋體（Cristispira）Ⅳ細(xì)絲體（Leptonema）Ⅴ鉤端螺旋體（Leptospira）問(wèn)號(hào)鉤端螺旋體鉤端螺旋體病接觸疫水雙曲鉤端螺旋體Ⅵ小蛇形螺旋體（Serpulina）Ⅶ螺旋體（Spirochaeta）Ⅷ密螺旋體（Treponema）梅毒螺旋體梅毒性傳播雅司螺旋體雅司病皮膚損傷品他螺旋體品他病皮膚損傷地方性螺旋體地方性梅毒粘膜損傷

第五十九頁(yè)，共八十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五梅毒螺旋體結(jié)構(gòu)（1）長(zhǎng)6~20μm,直徑90~180nm，有6~14個(gè)規(guī)則螺旋，兩端尖直。（2）外膜：有三層，含蛋白質(zhì)、類脂、糖，有抗原性，對(duì)溶菌酶抵抗，對(duì)脂溶劑、SDS敏感。第六十頁(yè)，共八十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五（3）胞質(zhì)微絲：有外鞘及內(nèi)核心，含大量蛋白質(zhì)（4）菌體：圓柱形，包括細(xì)胞壁、胞質(zhì)膜、胞質(zhì)。（5）周質(zhì)鞭毛：附著于菌體兩端2~3條或4~6條。第六十一頁(yè)，共八十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五（6）基因組（Nichols株1.131×106bp，1998年）（7）抗原：特異性耐熱多糖抗原（多糖--RNA），非特異性心磷脂、類脂抗原，特異性不耐熱蛋白質(zhì)，包括MW（15.5~190.0×103）的16種，其中15500、17000、42000、47000有特異性。第六十二頁(yè)，共八十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五血清學(xué)試驗(yàn)假陽(yáng)性原因（一）其他的人類宿主相關(guān)螺旋體（1）口腔螺旋體（齒齦間隙牙菌斑）參與齒齦炎、牙周病。（2）皮膚相關(guān)螺旋體（外陰部皮脂腺分泌物）。（3）腸道螺旋體（結(jié)腸、直腸、糞便）參與腹瀉等腸病。

第六十三頁(yè)，共八十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五血清學(xué)試驗(yàn)假陽(yáng)性原因（二）

NTrATTrAT自身免疫病++瘧疾+-免疫接種+-皮膚病

+

+結(jié)核+-麻風(fēng)++靜脈注射毒品+-病毒感染+-心血管病++第六十四頁(yè)，共八十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五

NTrATTrAT熱性病++妊娠+-HIV感染+-其他性傳播病+-老年人-+多次輸血+-Lyme病-+地方性密螺旋體病++技術(shù)誤差++原因不明++第六十五頁(yè)，共八十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五梅毒實(shí)驗(yàn)室診斷注意事項(xiàng)安全防護(hù)。血清學(xué)試驗(yàn)陽(yáng)性只提示檢出相應(yīng)抗體。加強(qiáng)專業(yè)知識(shí)學(xué)習(xí)，結(jié)合臨床病史、病癥綜合分析。改進(jìn)技術(shù)，TrAT要吸收處理。第六十六頁(yè)，共八十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五吸收處理在進(jìn)行TrAT試驗(yàn)時(shí)，待測(cè)血清都應(yīng)先用非致病性密螺旋體的Reiter株的提取物或超聲處理材料和Nichols株培養(yǎng)體兔睪丸提取物、兔血清等進(jìn)行吸收。吸收目的：除去待測(cè)血清中可能存在的與其它非梅毒螺旋體抗原產(chǎn)生交叉反應(yīng)的抗群、抗屬或抗科的特異抗原或抗體。TPHA試驗(yàn)還應(yīng)用超聲處理的綿羊和牛紅細(xì)胞吸收以吸除嗜異性抗體。即使如此，試驗(yàn)的特異性仍只能達(dá)99%左右。第六十七頁(yè)，共八十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五梅毒的實(shí)驗(yàn)室診斷第六十八頁(yè)，共八十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五梅毒的實(shí)驗(yàn)室診斷（新圖解）

有不潔性史有病損者（下疳、皮疹、淋巴穿刺液）DFM\DFAT\PCR陽(yáng)性確診治療陰性無(wú)病損者（血清、血漿）NTrAT（篩選）陽(yáng)性滴定（評(píng)估療效、再感染）TrAT陰性陽(yáng)性陰性假陽(yáng)性2周后復(fù)檢繼續(xù)陰性排除第六十九頁(yè)，共八十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五判讀實(shí)例（2）HCV抗體的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)報(bào)告第七十頁(yè)，共八十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五對(duì)丙肝的認(rèn)識(shí)時(shí)間不長(zhǎng)（1989年），世界各地感染率相差很大，英國(guó)5/萬(wàn)，開(kāi)羅卻高達(dá)26%。全世界至少有2億感染者，急性感染者中有20%-30%不通過(guò)治療也能在2-26周內(nèi)，完全清除病毒，達(dá)到臨床痊愈，不再?gòu)?fù)發(fā)。在血透患者中，體內(nèi)丙肝抗體水平可能很低甚至無(wú)法檢出，隨著時(shí)間推移，也可能存在反復(fù)。第七十一頁(yè)，共八十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五用化學(xué)發(fā)光法或酶聯(lián)免疫法檢測(cè)丙肝抗體，屬于初篩試驗(yàn)。方法本身存在一定的假陽(yáng)性或假陰性，陽(yáng)性結(jié)果中有2-3%不是真的感染丙肝；高危人群（如長(zhǎng)期血透者）陰性結(jié)果中有3-5%卻是真的感染了丙肝。在疾病不同階段這就要求臨床需根據(jù)患者實(shí)際情況，持續(xù)跟蹤檢查，才能正確診治病人。而丙肝的確認(rèn)試驗(yàn)是條帶免疫印跡法，由于試劑昂貴，約2000元/測(cè)試，并未應(yīng)用于臨床實(shí)踐。第七十二頁(yè)，共八十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五HCV抗體的出現(xiàn)不能確定是當(dāng)前感染還是既往感染。HCV抗體的確認(rèn)和NAT&ALT對(duì)HCV感染的醫(yī)療評(píng)估、咨詢和減少不必要的醫(yī)療花費(fèi)與心理傷害有著積極而深遠(yuǎn)的意義。第七十三頁(yè)，共八十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五HCV抗體不能常態(tài)確認(rèn)的原因未建立標(biāo)準(zhǔn)不了解篩查和確認(rèn)實(shí)驗(yàn)的性能及結(jié)果的意義確認(rèn)實(shí)驗(yàn)成本非常之高第七十四頁(yè)，共八十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五HCV感染的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法#篩查試驗(yàn)

ELISA測(cè)抗原，測(cè)抗體

CLIAGIA#確認(rèn)試驗(yàn)免疫印跡試劑（ChironRIBA*HCV3.0）

NAT第七十五頁(yè)，共八十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五初篩實(shí)驗(yàn)的報(bào)告衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心建議：除確認(rèn)試劑用陰性和陽(yáng)性表示外，其余都用有反應(yīng)性或無(wú)反應(yīng)性表示實(shí)驗(yàn)結(jié)果。在做ELISA或CLIA時(shí)，對(duì)有反應(yīng)性結(jié)果的標(biāo)本雙孔復(fù)試。任意一孔有反應(yīng)性，則標(biāo)本被認(rèn)為有重復(fù)反應(yīng)性篩查實(shí)驗(yàn)結(jié)果被認(rèn)為有反應(yīng)性。第七十六頁(yè)，共八十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五對(duì)HCV抗體的測(cè)試應(yīng)包括抗體篩查實(shí)驗(yàn)和對(duì)有重復(fù)反應(yīng)性標(biāo)本的更特異確認(rèn)實(shí)驗(yàn)。要根據(jù)篩查實(shí)驗(yàn)的S/CO比值選擇確認(rèn)實(shí)驗(yàn)路徑。不同人群有不同的S/CO判讀標(biāo)準(zhǔn)。第七十七頁(yè)，共八十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五高危人群（吸毒、肝病、性病等）其中低S/CO比值占2.4～4.9%低危人群（無(wú)償獻(xiàn)血者、軍人、醫(yī)務(wù)工作者）其中低S/CO比值占21.5～33.5%

★

并且他們的假陽(yáng)性率達(dá)35%第七十八頁(yè)，共八十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五國(guó)外試劑ELISA法中S/CO≥3.8或

CLIA法中S/CO≥8.0時(shí)可預(yù)測(cè)≥95%的真陽(yáng)性結(jié)果第七十九頁(yè)，共八十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五國(guó)產(chǎn)ELISA試劑

華美S/CO≥6.0

新創(chuàng)S/CO≥8.6

科華S/CO≥10.0

萬(wàn)泰S/CO≥14.0時(shí)可預(yù)測(cè)≥96%的真陽(yáng)性結(jié)果第八十頁(yè)，共八十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五篩查實(shí)驗(yàn)有重復(fù)反應(yīng)性，且S/CO比值高的標(biāo)本可以直接報(bào)告HCV抗體陽(yáng)性，而不必做確認(rèn)實(shí)驗(yàn)。報(bào)告中應(yīng)該注明：未進(jìn)行確認(rèn)實(shí)驗(yàn)。同時(shí)說(shuō)明：由于高S/CO比值只能預(yù)測(cè)95%的確認(rèn)陽(yáng)性，仍然存在<5%的假陽(yáng)性；臨床應(yīng)根據(jù)實(shí)際情況提出進(jìn)行確認(rèn)實(shí)驗(yàn)。第八十一頁(yè)，共八十五頁(yè)，編輯于2023年，星期