DB21T 3378-2021遼寧省松材線蟲病檢驗鑒定技術規(guī)程

ICS65.020.01CCSB16DB21遼寧省地方標準DB21/T3378—2021遼寧省松材線蟲病檢驗鑒定技術規(guī)程TechnicalregulationonquarantineforthepinewiltdiseaseinLiaoningprovince2021-01-30發(fā)布 2021-03-02實施遼寧省市場監(jiān)督管理局發(fā)布DB21/T3378—2021DB21/T3378—2021#附錄G(資料性)

分子生物學鑒定G.1松材線蟲PCR檢測G.1.1線蟲基因組DNA的提取制作線蟲裂解液(200mmol/LTris-HCl、200mmol/LNaC1、100mmol/LEDTA、2%SDS、2%6-mercaptoethanol、200^g/mL蛋白酶K),預冷線蟲裂解液，按照10應線蟲裂解液：1條線蟲比例，將線蟲與裂解液置于離心管中。置于PCR儀，70r條件下保溫處理35min,在95°C條件下保溫處理10min后，12000/min離心2min,取上清液。G.1.2反應體系每反應的混合液總體積為20pL,其中：2.0應10x快速TaqPCR緩沖液；2應2.5mmol/L的dNTP；0.3應快速擴增Taq酶；1.5應10mmol/L的引物組合B；2.0應的模板DNA；補充高壓滅菌重蒸水至20pL。G.1.3反應程序反應混合液在98°C預變性5s,進入循環(huán)98°C變性3s,52°C退火3s,72°C延伸40s,共30個循環(huán)，最后72。延伸211血1。G.1.4結果檢測PCR擴增產(chǎn)物在1.5%的瓊脂糖凝膠上電泳，電泳緩沖液為IxTAE或IxTBE,電壓為5V/cm,電泳時間為30min。置凝膠于302nm透射紫外燈上觀察，拍照。結果參見圖G.1。圖G.；松材統(tǒng)蟲電泳檢測圖譜注：泳道M-標準DNA；47-49松材線蟲；50-52擬松材線蟲G.2松材線蟲自動化分子檢測G.2.1松材線蟲病試劑盒組成成分名稱數(shù)量成分DNA提取試劑A液2ml/管xl管松材線蟲裂解緩沖液DNA提取試劑B液200卩1/管xl管松材線蟲消化酶pCR擴增混合K液500卩1/管xl管含TaqDNA聚合酶，dNTP的溶液PCR擴增混合P液150卩1/管xl管特異性引物、探針線蟲DNA陽性質(zhì)控Y液75卩1/管xl管松材線蟲DNA片段陰性質(zhì)控C液1ml/管xl管無酶水G.2.2適用設備松材線蟲自動化分子檢測系統(tǒng)48，松材線蟲自動化分子檢測系統(tǒng)48A,松材線蟲自動化分子檢測系統(tǒng)mini等松材線蟲熒光定量PCR檢測系統(tǒng)。G.2.3檢測方法將分離的線蟲置于1.5mL懸浮液離心濃縮，取底部液體20pL,加入A液20應,B液2pL；金屬浴中65°C,40min, 95°C,10min； 12000r/min離心3min,取上清液（線蟲DNA溶液）。G.2.4反應體系樣品：線蟲DNA溶液3.5應，加入K液5應，P液1.5應。陽性對照：線蟲DNA陽性質(zhì)控Y液3.5應，加入K液5應，P液1.5應。陰性對照：陰性質(zhì)控C液3.5應，加入K液如L,P液1.5應。G.2.5反應程序?qū)悠?、陽性對照及陰性對照放入機器，選擇儀器中松材線蟲自動檢測程序。G.2.6反應結果松材線蟲自動化分子檢測系統(tǒng)采用自動程序判讀檢測結果，如表G.1、G.2。表G.1松材線蟲自動化分子檢測結果序號顏色苗品來源Ct值判定結果11A125.83含松材線蟲2120.23含松材線蟲31A328.47含松材線蟲41A4”：23.19含松材線蟲51A527.38.含松材線蟲61A621.28、含松材線蟲71陽性對照16.65含松材線蟲81陰性對照不含松材線蟲

表G.2松材線蟲自動化檢測結果表G.2松材線蟲自動化檢測結果G.3實時熒光PCR檢測G.3.1檢測儀器實時熒光PCR儀、高速冷凍離心機。G.3.2引物與探針松材線蟲的引物正向引物序列：5'-GAGCAGAAACGCCGACTT-3'；反向引物序列：5'-CGTAAAACAGATGGTGCCTA-3'；TaqMan探針序列：5'-TGCACGTTGTGACAGTCGT-5'。G.3.3反應體系反應的混合液總體積為20卩L,其中:TaqMan通用PCR預混液10卩L；1011mol/LTaqMan探針1.0UL；10umol/L正向引物Q.5uL；10umol/L反向弓卜物0.5uL；模板DNA1.OuL；ddH207.OuL；G.3.4反應程序反應混合液在95°C預變性lOmin；進入循環(huán)95°C變裡15s,60°C運行35s,共35個循環(huán)。G.3.5檢測結果循環(huán)閾值(Cyclethresholdvalue)Ct值：是在PCR擴增過程中，熒憲信號*暫由本底進入指數(shù)增長階段的拐點所對應的循環(huán)次數(shù)，是實時熒光定量PCR檢測結果判讀的依據(jù)。當檢測樣品30>Ct>12時，含有松材線蟲；Ct>35或者無Ct值，不含松材線蟲；35>Ct>30,可能岀現(xiàn)假陽性，應重新檢測。DB21/T3378—2021DB21/T3378—2021附錄H（規(guī)范性）松材線蟲分子生物學檢驗送檢表表