細胞生物學技術課件 課件一-激光共聚焦掃描顯微鏡原理功能

激光掃描共聚焦顯微鏡

（LaserScanningConfocalMicroscope，LSCM）--基本原理及實例應用李真西7-1032015-10研究生細胞生物學技術一種觀察工具，需要前面的實驗做基礎免疫組化、細胞化學、原位雜交、細胞轉染……激光掃描共聚焦顯微鏡

LaserScanningConfocalMicroscope,LSCM什么是LSCM用來做什么？？它和熒光顯微鏡的關系？它和電子顯微鏡的關系？觀察的信號如何而來？激光掃描共聚焦顯微鏡

LaserScanningConfocalMicroscope,LSCM激光共聚焦顯微鏡的原理第一部分泛指將微小(分辨率0.2μM)不可見或難見物品之影像放大,而能被觀察的工具。目鏡光源聚焦旋鈕光闌和聚光器載物臺物鏡顯微鏡（Microscope）用于研究熒光或熒光標記物質的光學顯微鏡。熒光顯微鏡

FluorescenceMicroscope照相裝置光源（汞燈）標記了熒光的樣品基本原理紫外、藍、綠高壓汞燈被熒光探針染色的生物樣本激發(fā)被標記結構的熒光光學圖像光學成像濾鏡分光分光鏡(長通短反)物鏡共聚焦顯微鏡成像物鏡標本針孔（pinhole）焦平面普通熒光顯微鏡成像激光掃描共聚焦顯微鏡

LaserScanningConfocalMicroscope,LSCM--以激光作為激發(fā)光源，采用光源針孔與檢測針孔共軛聚焦技術，對樣本進行斷層掃描，以獲得高分辨率光學切片的熒光顯微鏡系統(tǒng)。光源光學原理成像原理基于的平臺激光針孔的共軛聚焦技術斷層掃描熒光顯微鏡系統(tǒng)熒光顯微鏡VS激光共聚焦顯微鏡

激發(fā)光源熒光顯微鏡光源汞燈鹵素燈其他普通光源特點激發(fā)波長范圍廣激光共聚焦顯微鏡光源激光特點光色純方向性好能量可調熒光顯微鏡VS激光共聚焦顯微鏡

光學原理熒光顯微鏡光源針孔檢測針孔激光共聚焦掃描顯微鏡分光鏡光源檢測器標本物鏡分光鏡不在焦平面的發(fā)射光位于焦平面的發(fā)射光物鏡激發(fā)光線激光器/theory/雙針孔光源針孔、檢測針孔雙針孔共用物鏡的焦點熒光顯微鏡VS激光共聚焦顯微鏡

光學原理共軛聚焦移動激光掃描器，逐點掃描掃描點光源熒光顯微鏡系統(tǒng)樣品熒光顯微鏡VS激光共聚焦顯微鏡

成像原理激光掃描共聚焦系統(tǒng)斷層掃描技術，逐點逐行掃描成像CCD成像技術，一次性成像X光機CT機普通熒光顯微鏡激光共聚焦顯微鏡特點：側面有掃描器接口；裝有微量步進馬達；裝有防振動裝置；裝有光路轉換裝置；配高數值孔徑的物鏡。熒光顯微鏡VS激光共聚焦顯微鏡

基于的平臺--顯微鏡系統(tǒng)特點：側面有掃描器接口；裝有微量步進馬達；裝有防振動裝置；裝有光路轉換裝置；配高數值孔徑的物鏡。激光共聚焦PMT檢測器—偽彩色靈敏度高光信號-電信號-圖像由計算機精確控制圖像的合成和輸出，同時電信號增加放大倍數。多通道熒光采集一般3個熒光通道和一個透射光通道，分別成像熒光顯微鏡VS激光共聚焦顯微鏡

基于的平臺—獲取圖像方式熒光顯微鏡目鏡或CCD—真彩色所見即所得單通道熒光采集熒光顯微鏡VS激光共聚焦顯微鏡

基于的平臺—獲取圖像方式偽彩色--以激光作為激發(fā)光源，采用光源針孔與檢測針孔共軛聚焦技術，對樣本進行斷層掃描，以獲得高分辨率光學切片的熒光顯微鏡系統(tǒng)。激光掃描共聚焦顯微鏡

LaserScanningConfocalMicroscope,LSCM將光學顯微鏡技術、激光掃描技術和計算機圖像處理技術結合在一起的高技術設備。激光/光學顯微鏡結合，高靈敏度探測器，高性能計算機/圖像處理軟件相結合的新型高精度顯微成像。激光掃描共聚焦顯微鏡的優(yōu)缺點優(yōu)勢高垂直分辨率沿Z軸逐層掃描，經過計算機處理成為三維圖像。高水平分辨率人眼分辨率：0.20mm光學顯微鏡分辨率：0.25mm共焦顯微鏡分辨率：0.18mm電子顯微鏡分辨率：0.20nm局限共聚焦顯微鏡的分辨率理論極限大約是0.15mm，軸向分辨率0.5mm。觀測厚度（60X）：50-100mm一次只獲得某一層面的圖像信息共聚焦顯微鏡是逐點成像，成像速度較慢1957年，MarvinMinsky在他的專利中首次闡明了激光掃描共聚焦顯微鏡技術的基本工作原理1967年，Egger和Petran成功地應用共聚焦顯微鏡產生了一個光學橫斷面1970年，Sheppard和Wilson推出第一臺單光束共聚焦激光掃描顯微鏡問世1985年，多個實驗室的多篇報道顯示共聚焦顯微鏡可以消除焦點模糊，得到清晰的圖像，至此LSCM技術基本成熟1987年，BIO-RAD公司推出了第一臺商業(yè)化的共聚焦顯微鏡激光掃描共聚焦顯微鏡的發(fā)展目前常見的激光共聚焦顯微鏡激光共聚焦顯微鏡構成掃描器系統(tǒng)熒光顯微鏡系統(tǒng)計算機圖像存儲與處理系統(tǒng)ZeissLSM-710ConfocalSystem激光光源ZeissLSM-510ConfocalSystem

ZeissLSM-710ConfocalSystem

激光共聚焦顯微鏡的功能第二部分激光共聚焦顯微鏡的功能ZOOM成像薄層光學切片熒光定量分析多維度成像多通道同時掃描……薄層光學切片激光共聚焦顯微鏡的功能使用共扼光路使非焦平面的光線被抑制，減少了成像的干擾。使用光色較純的激光，所以成像分辨率可達普通光學顯微鏡的1.4倍。逐點掃描，形成光學切片牛肺上皮細胞

展現(xiàn)最清晰成像細節(jié)ByGeorgevonDassow,UniversityofOregon展現(xiàn)最清晰成像細節(jié)小鼠神經元細胞

高清晰成像多通道同時掃描普通熒光顯微鏡每次只能觀測一種熒光，要觀測多種熒光標記的樣品需要多次觀測，對樣品損傷大。激光共聚焦顯微鏡可以多激光多通道同時掃描，多通道同時探測。激光共聚焦顯微鏡的功能動脈內皮細胞三標記多重熒光標記海馬DG區(qū)綠色：SYBR14染色，活精子紅色：PI染色，死精子綠色：活菌紅色：死菌牛精子藤黃微球菌擬南芥，ByHeitiPaves,CentreofExcellenceENVIRON,Estonia

斑馬魚神經元系統(tǒng)，byAlbertPan，HarvardUniversity共聚焦絢麗圖像視網膜煙花，byJoshR.Sanes,HarvardUniversityZOOM成像激光共聚焦顯微鏡的功能在不變換鏡頭的情況下，對某幅圖片的局部放大，并進行精細逐點掃描成像，獲得高分辨率圖像。共聚焦的優(yōu)勢ZOOM成像ZOOM和高分辨率掃描的極限盡量使用高數值孔徑油鏡！多維度掃描通過調節(jié)針孔的大小，控制樣品掃描層面的厚度，可逐層獲得高分辨率的光學橫斷面圖像。并可用計算機軟件后期合成去除非交信息的三維立體圖像。XYZ掃描XYT掃描激光共聚焦顯微鏡的功能大鼠卵細胞的細胞骨架胚胎的結構單層面掃描

多層疊加切片分層疊加耳蝸基底膜三維圖像重建三維圖像重建三維圖像重建—動態(tài)觀測熒光定量分析激光共聚焦顯微鏡的功能使用能量穩(wěn)定的激光作為光源，且各種參數可調。熒光探針的特異性標記：即熒光強度與特異性標記蛋白的表達量成正相關。同一個光學條件下，應用相同的熒光探針，通過比對各組樣品之間的熒光強度值，進行定量分析。熒光定量分析隨機圈取細胞，可得到所圈細胞的相對熒光強度值熒光表達量測定利用熒光與透射光同時掃描，觀測相等面積內不同組間熒光標記蛋白表達的差異。細胞中特異性熒光標記的蛋白在不同藥物環(huán)境和不同培養(yǎng)時間條件下的水平差異。激光共聚焦顯微鏡技術應用第三部分如何獲得一幅好的圖片觀察的對象

熒光（Fluorescence）熒光：物質吸收能量后所釋放出的冷發(fā)光現(xiàn)象

通常為吸收短波長的能量后發(fā)散出長波長的光熒光光譜：激發(fā)光譜—通過測量熒光物質的熒光發(fā)射強度隨激發(fā)波長變化而獲得的光譜。發(fā)射光譜—熒光物質的熒光發(fā)射強度隨放射波長變化而獲得的光譜。488nm525nmFITC450nm490nm400450500550600650700750800EXCITATIONandEMISSIONSPECTRA激發(fā)光譜發(fā)射光譜

TexasRed

Cy5INTENSITY[arb.units]WAVELENGTH[nm]FITCRhodamine熒光物質不同其光譜也不同自發(fā)熒光：指組織細胞不經任何熒光染色便能夠激發(fā)熒光。免疫熒光：熒光抗體法產生熒光。觀察的對象

熒光（Fluorescence）外源導入熒光蛋白：利用轉基因技術將熒光蛋白基因導入細胞里，讓其表達融合蛋白而產生的熒光。組織和細胞中熒光的來源熒光染色：很多熒光染料與組織細胞作用，能夠在光的作用發(fā)出特征波長的熒光，借以觀察組織細胞的形態(tài)結構、化學組成和功能。/cn/zh/home/life-science/cell-analysis/cellular-imaging/fluorescence-microscopy-and-immunofluorescence-if/organelle-stains-for-fluorescence-imaging-selection-guide.htmlGolgiinfixedandpermeabilizedNIH3T3mousefibroblastcellswaslabeledwithgreen-fluorescentAlexaFluor?488conjugateofHPAlectin.Filamentousactinwasstainedwithred-orange-fluorescentAlexaFluor?568phalloidin.MitochondriawerelabeledwithaprimaryantibodydirectedagainstOxPhosComplexVInhibitorProteinandvisualizedusingfar-red-fluorescentAlexaFluor?680goatanti-mouseIgG.Nucleiwerestainedwithblue-fluorescentDAPI.熒光抗體或熒光染料標記細胞器或亞細胞結構綠色熒光蛋白

（Green-FluorescentProtein，GFP）活體檢測：由于長波能量低,細胞忍受能力強。長時間檢測：熒光極其穩(wěn)定,在激發(fā)光照射下,GFP抗光漂白能力比熒光素強。容易融合：分子量較小,易與目的基因形成融合蛋白且不影響自身的目的基因產物的空間構象和功能。可指示外源目的基因表達及沉默內源目的基因表達238個氨基酸組成。激發(fā)波長479nm發(fā)射波長508nm1962年，日本下村修（Shimomure）等首先從維多利亞水母中分離出了GFP。2008年，美國科學家錢永健、馬丁·沙爾菲和下村修三人因發(fā)現(xiàn)GFP而獲得諾貝爾化學獎。衍生物和突變體：BFP、CFP、GFP、RFP、YFPThesefusionproteinsemployarangeoffluorescentmoleculesincludingCFP,GFP,mKATE2,RFPandYFP。各類熒光蛋白作為標簽（tag)融合細胞器特異蛋白指示細胞器熒光探針與熒光標記：采用一定的標記物，使樣品中待測物質具有特定的熒光特征，這種標記物被稱為熒光探針。這種給樣品賦予特征熒光的操作稱作熒光標記。熒光探針的選擇熒光探針的種類：①大分子探針②細胞器探針③核酸探針④金屬離子探針⑤細胞電位和細胞內pH值探針⑥分子的特殊集團結合探針……熒光探針的選擇選擇的依據：根據實驗目的確定需要檢定的指標；確定可供選擇的熒光探針的范圍；考察熒光探針的特性是否符合熒光樣品的制備要求；考察熒光探針與所用共聚焦顯微鏡系統(tǒng)的匹配情況。標記的熒光需要在不被其他因素的干擾下能被激光共聚焦顯微鏡系統(tǒng)檢測到熒光探針的選擇—多重熒光標記原則：盡量減小不同熒光物質間激發(fā)/發(fā)射光譜的重疊。標記要求熒光素選擇/組合核復染單標

無特殊限制。

FITC,Cy2最佳；盡量不選擇Cy5,Cy5.5（紅外)與自發(fā)熒光沖突時，采用TexasRed

。PI/DAPI雙標FITC/Cy2+TEXASREDFITC/Cy2+RHODAMINE/Cy3(必須順序掃描)DAPI(必須順序掃描)三標FITC/Cy2+TEXASRED+Cy5.5FITC/Cy2

+RHODAMINE/Cy3+Cy5.5

(必須順序掃描)活細胞追蹤

能被細胞主動攝取、對細胞無毒性作用、能在活細胞內長時間存在、隨細胞分裂進入子細胞

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顯微注射；轉基因技術（GFP；GFP-ACTIN）1.作為亞細胞定位的標記蛋白定位在哪里呢？核復染的作用2.作為整體結構的標記圖中共有多少個細胞？陽性蛋白的表達效率是多少？熒光探針的選擇—多重熒光標記原則：盡量減小不同熒光物質間激發(fā)/發(fā)射光譜的重疊。標記要求熒光素選擇/組合核復染單標

無特殊限制。

FITC,Cy2最佳；盡量不選擇Cy5,Cy5.5（紅外)與自發(fā)熒光沖突時，采用TexasRed

。PI/DAPI雙標FITC/Cy2+TEXASREDFITC/Cy2+RHODAMINE/Cy3(必須順序掃描)DAPI(必須順序掃描)三標FITC/Cy2+TEXASRED+Cy5.5FITC/Cy2

+RHODAMINE/Cy3+Cy5.5

(必須順序掃描)活細胞追蹤

能被細胞主動攝取、對細胞無毒性作用、能在活細胞內長時間存在、隨細胞分裂進入子細胞

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顯微注射；轉基因技術（GFP；GFP-ACTIN）樣品前處理組織切片：切片的厚度

4-50mm

①冰凍切片：優(yōu)點是易操作，熒光背景低；缺點是容易破壞組織結構，不利于形態(tài)觀察。

②石蠟切片：優(yōu)點是樣品易保存，缺點是容易引入干擾熒光。細胞標本：

①細胞種類和純度雜細胞的干擾會導致錯誤實驗結果。

②細胞密度：如果進行形態(tài)觀察、三維重建、定位熒光信號，細胞密度不低于20％；

如果是測定熒光強度，細胞約占視野面積的80％。

③承載細胞的器皿：