演示文稿流加發(fā)酵與高密培養(yǎng)

演示文稿流加發(fā)酵與高密度培養(yǎng)目前一頁\總數(shù)四十九頁\編于三點（優(yōu)選）流加發(fā)酵與高密度培養(yǎng)目前二頁\總數(shù)四十九頁\編于三點流加發(fā)酵所謂流加發(fā)酵，即補料分批發(fā)酵(Fed-batchfermentation)，有時又稱半連續(xù)培養(yǎng)或半連續(xù)發(fā)酵，是指在分批發(fā)酵過程中間歇或連續(xù)地補加新鮮培養(yǎng)基的發(fā)酵方法目前三頁\總數(shù)四十九頁\編于三點分批、連續(xù)、流加操作方式的比較目前四頁\總數(shù)四十九頁\編于三點流加發(fā)酵的研究進展在20世紀70年代以前流加發(fā)酵的理論研究幾乎是個空白，流加過程控制僅僅以經(jīng)驗為主，流加方式也僅僅局限于間歇或恒速流加1973年日本學者Yoshida等人首次提出了“Fed-BatchFermentation”這個術語，并從理論上建立了第一個數(shù)學模型，流加發(fā)酵的研究才開始進入理論研究階段目前五頁\總數(shù)四十九頁\編于三點流加發(fā)酵所取得的三個方面的重大進展

20世紀70年代中后期對流加發(fā)酵過程的動力學解析結合發(fā)酵過程的可測參數(shù)對流加過程進行反饋控制（如DO法、CO2法、RQ(呼吸商)法、pH法、代謝物法、螢光法等）流加發(fā)酵的最優(yōu)化研究目前六頁\總數(shù)四十九頁\編于三點流加發(fā)酵最優(yōu)化研究的核心問題是找出最佳的底物流加方式，以維持發(fā)酵過程始終處于最佳狀態(tài)流加發(fā)酵最優(yōu)化的研究內(nèi)容包括：（1）狀態(tài)方程的建立（2）目標泛函的確定（3）最優(yōu)化底物流加方式的求解目前七頁\總數(shù)四十九頁\編于三點流加發(fā)酵的物料衡算式可以表達為：流加發(fā)酵的最優(yōu)化理論有：格林原理、龐特里金最小值(最大值)原理等目前八頁\總數(shù)四十九頁\編于三點在采用流加發(fā)酵技術之前要考慮的兩個問題一、何時采用流加發(fā)酵方式？二、如何進行底物的流加？目前九頁\總數(shù)四十九頁\編于三點一、何時采用流加發(fā)酵方式？所用底物在高濃度時對菌體生長有抑制作用

高菌體濃度培養(yǎng)即高密度培養(yǎng)系統(tǒng)非生長耦聯(lián)性次級代謝產(chǎn)物(如產(chǎn)物的合成需要某些營養(yǎng)物質或前體)利用營養(yǎng)突變體的系統(tǒng)(過量加入營養(yǎng)物只能使菌體迅速生長，而目的代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量會減少。而當營養(yǎng)物嚴重缺乏時，菌體生長受抑制，代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量也會減小)

營養(yǎng)缺陷型菌株的培養(yǎng)目前十頁\總數(shù)四十九頁\編于三點二、如何進行流加發(fā)酵操作？1.流加發(fā)酵類型2.采用流加發(fā)酵應該解決的關鍵問題？3.流加發(fā)酵過程中某些重要參數(shù)的確定4.合適的流加發(fā)酵類型的確定5.流加方式的應用目前十一頁\總數(shù)四十九頁\編于三點1.流加發(fā)酵類型流加發(fā)酵的分類類別流加方式無反饋控制反饋控制恒流量流加、變流量流加和間歇流加直接控制流加、間接控制流加定值控制流加、程序控制流加、最優(yōu)控制流加

目前十二頁\總數(shù)四十九頁\編于三點2.采用流加發(fā)酵應該解決的關鍵問題(1)流加什么物質？①補充微生物能源和碳源，如在發(fā)酵液中添加葡萄糖、飴糖、液化淀粉。作為消泡劑的天然油脂，有時也能同時起到補充碳源的作用②補充菌體所需要的氮源，有機氮或氨水③加入某些微生物生長或合成需要的微量元素或無機鹽④加入酶合成誘導物或前體物質目前十三頁\總數(shù)四十九頁\編于三點(2)如何流加？

a.底物流加速率

b.流加開始時間及總流加時間

c.需控制的底物濃度目前十四頁\總數(shù)四十九頁\編于三點3.流加發(fā)酵過程中某些重要參數(shù)的確定最佳底物濃度的確定

(包括菌體生長階段和產(chǎn)物合成階段)b.底物的消耗速率c.菌體比生長速率()d.菌體對底物的產(chǎn)率系數(shù)(Yx/s)

及產(chǎn)物對底物的產(chǎn)率系數(shù)(Yp/s)目前十五頁\總數(shù)四十九頁\編于三點4.合適的流加發(fā)酵類型的確定a.恒速流加(包括單一速率和分階段恒速流加)b.指數(shù)速率流加c.底物在線測定后的反饋流加(如葡萄糖反饋流加)d.pH-state.DO-stat目前十六頁\總數(shù)四十九頁\編于三點5.流加方式的應用(1)恒速流加采用恒流速流加培養(yǎng)時，可得到如下的物料平衡方程式：細胞平衡：碳平衡：產(chǎn)物平衡：體積平衡：目前十七頁\總數(shù)四十九頁\編于三點恒流速流加過程中的流量F的確定：預試驗中所得出的流加時刻菌體對所流加基質的消耗速率發(fā)酵液中殘留基質濃度流加后需要控制的發(fā)酵液中的基質濃度目前十八頁\總數(shù)四十九頁\編于三點(2)指數(shù)速率流加在菌體生長階段采用指數(shù)速率流加法的幾點假設如下：(a)發(fā)酵罐內(nèi)為理想混合；(b)葡萄糖為唯一限制性碳源；(c)殘留菌體對葡萄糖的產(chǎn)率系數(shù)(YX/s)為常數(shù)；(d)菌體生長遵循Monod方程。目前十九頁\總數(shù)四十九頁\編于三點對底物葡萄糖進行衡算，則：

F為體積流加速率(L/h)，S0為流加液中基質濃度(g/L)，Yx/s為菌體對底物的產(chǎn)率系數(shù)(g/g)，ms為細胞比維持系數(shù)(g/g/h)，X為菌體濃度(g/L)，V為培養(yǎng)液體積(L)，μ為菌體比生長速率(h-1)。

目前二十頁\總數(shù)四十九頁\編于三點對菌體量的變化進行物料衡算，則：假定為常數(shù)，則上式積分可得：

目前二十一頁\總數(shù)四十九頁\編于三點

由于生長符合Monod方程

μ是S的函數(shù)，要使μ恒定，S必須恒定，則有：

目前二十二頁\總數(shù)四十九頁\編于三點其中tF為開始指數(shù)速率流加的時間，t≥tF，XF和VF分別為tF時刻的菌體濃度和發(fā)酵液體積

指數(shù)速率流加的速率F的表達式為:目前二十三頁\總數(shù)四十九頁\編于三點指數(shù)速率流加方式在實際過程中的注意事項：方程中各參數(shù)要預先求知應用時流加速率F可采用階梯遞增方式進行設定目前二十四頁\總數(shù)四十九頁\編于三點微生物的高細胞密度培養(yǎng)目前二十五頁\總數(shù)四十九頁\編于三點概述發(fā)酵研究和工業(yè)的一個主要目標是使體積生產(chǎn)率（g/L?h）最大化，即在給定體積中和一定時間內(nèi)獲得盡可能多的產(chǎn)品數(shù)量。高細胞密度培養(yǎng)是高生產(chǎn)效率的要求。歷史上，高細胞密度培養(yǎng)首先建立在酵母上，用以生產(chǎn)單細胞蛋白、乙醇和菌體。目前二十六頁\總數(shù)四十九頁\編于三點后來，建立起其它的嗜溫菌的高密度培養(yǎng)，生產(chǎn)各種類型產(chǎn)品。甲基營養(yǎng)生物的高密度培養(yǎng)導致了聚羥基烷酸的高效生產(chǎn)。如今，微生物的高細胞密度培養(yǎng)的范疇已包括細菌、古細菌和真核生物（酵母）。概述目前二十七頁\總數(shù)四十九頁\編于三點微生物DCW（g/l）細菌

Methylobacteriumextorquens233Escherichiacoli190180148145Bacillussubtilis184AlcaligeneseutrophusNCIMB11599184Streptomyceslaurentii157Lactococcuslactis141PseudomonasputidaBM01100古細菌

MarinococcusM52132Sulfolobushibatae114真核

Candidabrassicae268Saccharomycesserevisiae208235Pichiapastoris100HCDC中各種微生物的最大細胞密度概述目前二十八頁\總數(shù)四十九頁\編于三點隨著重組DNA技術的發(fā)展，利用大腸桿菌或其它微生物為宿主表達重組蛋白（如干擾素、白介素等）在分子和策略上已沒有問題。但為了提高過程的經(jīng)濟性必需開發(fā)高效的培養(yǎng)和發(fā)酵技術。對大腸桿菌的分子生物學和生理學知識的熟識，使得它成為高細胞密度培養(yǎng)的先鋒微生物。

概述目前二十九頁\總數(shù)四十九頁\編于三點反應器生理狀態(tài)μ

代謝流向能量狀況產(chǎn)物目的產(chǎn)物副產(chǎn)物尾氣細胞條件DO溫度pH培養(yǎng)基攪拌壓力控制微生物HCDC過程示意圖概述目前三十頁\總數(shù)四十九頁\編于三點Markl等計算出，填塞滿長3μm，直徑1μm細胞的培養(yǎng)液中，只有25％的空間是培養(yǎng)基。考慮到細胞干重是濕重的20～25%，細胞的最大密度應該是160～200g(DCW)L。

高細胞密度帶來的問題：底物對生長的限制或抑制產(chǎn)物或代謝副產(chǎn)物的抑制CO2和熱量粘度增加、混合不充分氧的限制當細胞濃度超過200g(DCW)L-1時，培養(yǎng)液的粘度迅速增加，在220g(DCW)L-1幾乎失去流動性。

概述目前三十一頁\總數(shù)四十九頁\編于三點反應器HCDC的生物反應器類型包括：具有底物流加裝置的通用式攪拌罐反應器帶有各種內(nèi)置或外置細胞維持裝置的攪拌罐反應器膜透析反應器氣升式反應器陶瓷膜搖瓶目前三十二頁\總數(shù)四十九頁\編于三點透析反應器反應器目前三十三頁\總數(shù)四十九頁\編于三點HCDC問題的解決HCDC遇到的主要問題有：產(chǎn)物或代謝副產(chǎn)物的積累對生長的抑制氧的限制HCDC中培養(yǎng)基粘度不斷增加，引起混合不充分CO2和熱量的高釋放率下面以大腸桿菌為例，來探討如何解決HCDC中的問題。目前三十四頁\總數(shù)四十九頁\編于三點大腸桿菌HCDC中乙酸的形成乙酸是大腸桿菌流入中心代謝途徑的碳超過生物合成的需要和產(chǎn)生能量超過細胞的容量時產(chǎn)生的。高濃度的乙酸（如pH7，超過5gL-1）會降低HCDC的生長速率、生物量和可獲得的最大細胞密度。乙酸毒害作用的機理還未被闡明。很有可能是因為抑制DNA、RNA、蛋白質和脂肪的合成。HCDC遇到的問題目前三十五頁\總數(shù)四十九頁\編于三點控制比生長速率在產(chǎn)生乙酸的臨界值以下

一般可通過控制限制性底物濃度控制比生長速率。比生長速率臨界值：在復合和半合成培養(yǎng)基中，約為為0.2h-1和0.35h-1；在合成培養(yǎng)基中，為0.14h-1。

HCDC遇到的問題減少乙酸合成的方法目前三十六頁\總數(shù)四十九頁\編于三點選擇合適的培養(yǎng)基

例如，甘油比葡萄糖吸收進入細胞的速度要慢，可能會減少流入糖酵解途徑的碳，這會極大的減少乙酸的合成。HCDC遇到的問題此外，加入某些氨基酸（如谷氨酸、甲硫氨酸），可減輕乙酸的毒害作用。使用酸和堿調(diào)節(jié)pH而積累下來的鹽會使乙酸的毒害作用加強。目前三十七頁\總數(shù)四十九頁\編于三點大腸桿菌葡萄糖PtaAck乙酸去往其它產(chǎn)物（乙醇、乙醛等）TCA循環(huán)中過剩的碳乙酸代謝過程示意圖磷酸轉移酶體系修飾截斷加強代謝工程的方法減少乙酸合成CoA目前三十八頁\總數(shù)四十九頁\編于三點氧的限制氧經(jīng)常是高細胞密度培養(yǎng)的限制因素。因為氧的溶解度很低。25℃、1大氣壓下，水中飽和溶解氧濃度為7mgL-1。HCDC遇到的問題

提高溶氧的方法有：提高通氣速率和攪拌速度富氧空氣和純氧在加壓環(huán)境下培養(yǎng)目前三十九頁\總數(shù)四十九頁\編于三點混合的限制HCDC的另一個物理限制。發(fā)酵罐體積越大問題越明顯?？拷M料口部分的細胞暴露在高濃度營養(yǎng)物中。而其它位置的細胞則處于饑餓狀態(tài)。HCDC遇到的問題有必要研究發(fā)酵罐中的攪拌模型，找到改善攪拌的方法。目前四十頁\總數(shù)四十九頁\編于三點二氧化碳和放熱的影響HCDC中高細胞密度培養(yǎng)中的二氧化碳會影響細胞的生長。高CO2分壓（>0.3atm）會降低生長速率并刺激乙酸的生成。放熱也是高細胞密度培養(yǎng)的一個問題。這些問題可通過降低細胞比生長速率而部分的解決。熱量的主要來源是攪拌產(chǎn)生的機械熱和細胞代謝產(chǎn)生的熱量。HCDC遇到的問題目前四十一頁\總數(shù)四十九頁\編于三點溫度的影響把培養(yǎng)溫度從37℃降到26－30℃，會降低營養(yǎng)吸收和生長速度，因此會減少有毒副產(chǎn)物和代謝產(chǎn)生的熱量。降低溫度也能減少細胞對氧的需求。降低重組細胞溫度也有可能減少包含體形式的蛋白質的產(chǎn)生。以上這些優(yōu)點說服了許多研究者使用低溫，對大腸桿菌進行高細胞密度培養(yǎng)。HCDC遇到的問題目前四十二頁\總數(shù)四十九頁\編于三點流加控制策略有兩種主要的營養(yǎng)流加控制策略：開環(huán)（無反饋）控制閉環(huán)（反饋）控制補料方式是高細胞密度培養(yǎng)取得成功的關鍵因素。它不僅影響最大可獲得細胞的濃度，而且影響細胞的產(chǎn)率。產(chǎn)物形成會受各種補料策略的影響。高細胞密度培養(yǎng)通常在營養(yǎng)（碳）限制的條件下進行。目前四十三頁\總數(shù)四十九頁\編于三點條件預設參數(shù)開環(huán)（無反饋）控制流加控制策略DO溫度pH培養(yǎng)基攪拌壓力流加控制目前四十四頁\總數(shù)四十九頁\編于三點無反饋控制的流加策略恒速流加——以預先決定的（恒定的）速率流加營養(yǎng)物質，比生長速率逐漸降低。加速流加——以逐漸增加的速率流加營養(yǎng)物質。可補償一些比生長速