儀器分析第講色譜法引論

儀器分析第講色譜法引論2023/5/24第一頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期五色譜法的基本原理

CommonConceptsandPrinciplesofChromatography第一節(jié)概述色譜法的發(fā)展簡史

Sample:PlantpigmentsChromat(o)+graph(y)Chromatography俄國植物學(xué)家茨維特在1901年使用的裝置：色譜原型裝置，如圖。2023/5/24第二頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期五But,uptill1930sthemethodofTswettfinallyreceivedrecognition,andbecameanimportanttoolinbothorganicchemistryandbiochemistrylaboratories.Anmanualtechniquerequiringconsiderableskill,manipulationandtime.From

JanAkeJonssonEd.,ChromatographicTheoryandBasicprinciples,1987,MarcelDekker,Inc.,NewYorkJamesM.Miller,Chromatography:ConceptandContrasts,1988,Wiley,NewYorkLeslieS.Ettre,1941-1951:TheGoldenDecadeofChromatography,Analyst,1991,116,1231第一節(jié)概述色譜法的發(fā)展簡史

2023/5/24第三頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期五1952,A.J.P.MartinandR.L.M.SyngewereawardedtheNobelPrizeinChemistry第一節(jié)概述色譜法的發(fā)展簡史

在色譜發(fā)展史上占有重要地位的英國科學(xué)家A.J.P.Martin(馬丁)和R.L.M.Synge(辛格)，他們提出色譜塔板理論；發(fā)明液-液分配色譜；預(yù)言了氣體可作為流動(dòng)相（即氣相色譜）。1952年，因?yàn)樗麄儗?duì)分配色譜理論的貢獻(xiàn)獲諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。2023/5/24第四頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期五1956,Ratetheory,theDutchscientist,VanDeemter

動(dòng)力學(xué)理論——范第姆特方程1963,HPLCwasborn

HighPerformanceLiquidChromatography

HighPressureLiquidChromatography---------------Today,……第一節(jié)概述色譜法的發(fā)展簡史

2023/5/24第五頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期五DevelopingofChromatographicTechnique1948,8daysseparationfor16aminoacids2023/5/24第六頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期五DevelopingofChromatographicTechnique1958,22hoursseparationfor19ofaminoacids2023/5/24第七頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期五DevelopingofChromatographicTechnique1982,lessthan30minutesseparationfor18ofaminoacids2023/5/24第八頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期五一、色譜法的基礎(chǔ)、分類和特點(diǎn)

◆色譜法首先是一種分離技術(shù)，同時(shí)也是一種分析技術(shù)。

試樣混合物的分離過程也就是試樣中各組分在色譜分離柱中兩相間不斷進(jìn)行著的分配過程其中的一相固定不動(dòng)，稱為固定相；另一相是攜帶試樣混合物流過此固定相的流體（氣體或液體），稱為流動(dòng)相。1.基礎(chǔ)

分離、分析混合物最有效的方法。2023/5/24第九頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期五

當(dāng)流動(dòng)相中攜帶的混合物流經(jīng)固定相時(shí)，其與固定相發(fā)生相互作用。由于混合物中各組分在性質(zhì)和結(jié)構(gòu)上的差異，與固定相之間產(chǎn)生的作用力的大小、強(qiáng)弱不同，隨著流動(dòng)相的移動(dòng)，混合物在兩相間經(jīng)過反復(fù)多次的分配平衡，使得各組分被固定相保留的時(shí)間不同，從而按一定次序由固定相中流出。再與適當(dāng)?shù)臋z測(cè)方法結(jié)合，實(shí)現(xiàn)混合物中各組分的分離與檢測(cè)。

兩相及兩相的相對(duì)運(yùn)動(dòng)構(gòu)成了色譜法的基礎(chǔ)2023/5/24第十頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期五2.色譜法分類

(1)氣相色譜：流動(dòng)相為氣體（稱為載氣）。按分離柱不同可分為：填充柱色譜和毛細(xì)管柱色譜；按固定相的不同又分為：氣固色譜和氣液色譜2023/5/24第十一頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期五(2)液相色譜：流動(dòng)相為液體（也稱為淋洗液）。按固定相的不同分為：液固色譜和液液色譜。

離子色譜：液相色譜的一種，以特制的離子交換樹脂為固定相，不同pH值的水溶液為流動(dòng)相。2023/5/24第十二頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期五(3)其他色譜方法薄層色譜和紙色譜：比較簡單的色譜方法凝膠色譜法：

測(cè)聚合物分子量分布。超臨界色譜:CO2流動(dòng)相。高效毛細(xì)管電泳:九十年代快速發(fā)展、特別適合生物試樣分析分離的高效分析儀器。2023/5/24第十三頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期五3.色譜法的特點(diǎn)（1）分離效率高

復(fù)雜混合物，有機(jī)同系物、異構(gòu)體。手性異構(gòu)體。（2）靈敏度高

可以檢測(cè)出μg.g-1(10-6)級(jí)甚至ng.g-1(10-9)級(jí)的物質(zhì)量。（3）分析速度快

一般在幾分鐘或幾十分鐘內(nèi)可以完成一個(gè)試樣的分析。（4）應(yīng)用范圍廣

氣相色譜：沸點(diǎn)低于400℃的各種有機(jī)或無機(jī)試樣的分析液相色譜：高沸點(diǎn)、熱不穩(wěn)定、生物試樣的分離分析。

不足之處：

被分離組分的定性較為困難。2023/5/24第十四頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期五氣固色譜的固定相:多孔性的固體吸附劑顆粒。

固體吸附劑對(duì)試樣中各組分的吸附能力的不同。氣液色譜的固定相:由擔(dān)體和固定液所組成。

固定液對(duì)試樣中各組分的溶解能力的不同。氣固色譜的分離機(jī)理:

吸附與脫附的不斷重復(fù)過程；氣液色譜的分離機(jī)理：

氣液兩相間的反復(fù)多次分配過程。二、色譜分離過程

色譜分離過程是在色譜柱內(nèi)完成的。以氣相色譜為例，氣固色譜和氣液色譜，兩者的分離機(jī)理不同。2023/5/24第十五頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期五1.氣相色譜分離過程當(dāng)試樣由載氣攜帶進(jìn)入色譜柱與固定相接觸時(shí)，被固定相溶解或吸附;隨著載氣的不斷通入，被溶解或吸附的組分又從固定相中揮發(fā)或脫附;揮發(fā)或脫附下的組分隨著載氣向前移動(dòng)時(shí)又再次被固定相溶解或吸附;隨著載氣的流動(dòng)，溶解、揮發(fā)，或吸附、脫附的過程反復(fù)地進(jìn)行。2023/5/24第十六頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期五2.分配系數(shù)（partionfactor）K

組分在固定相和流動(dòng)相間發(fā)生的吸附、脫附，或溶解、揮發(fā)的過程叫做分配過程。分配系數(shù)是色譜分離的依據(jù)。在一定溫度下，組分在兩相間分配達(dá)到平衡時(shí)的濃度（單位：g/mL）比，稱為分配系數(shù)，用K表示，即：2023/5/24第十七頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期五分配系數(shù)K的討論

一定溫度下，組分的分配系數(shù)K越大，出峰越慢；試樣一定時(shí)，K主要取決于固定相性質(zhì)；每個(gè)組份在各種固定相上的分配系數(shù)K不同；選擇適宜的固定相可改善分離效果；試樣中的各組分具有不同的K值是分離的基礎(chǔ)；某組分的K=0時(shí)，即不被固定相保留，最先流出。2023/5/24第十八頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期五3.分配比（partionratio）k

在實(shí)際工作中，也常用分配比來表征色譜分配平衡過程。分配比是指，在一定溫度下，組分在兩相間分配達(dá)到平衡時(shí)的質(zhì)量比：

1.分配系數(shù)與分配比都是與組分及固定相的熱力學(xué)性質(zhì)有關(guān)的常數(shù)，隨分離柱溫度、柱壓的改變而變化。2.分配系數(shù)與分配比都是衡量色譜柱對(duì)組分保留能力的參數(shù)，數(shù)值越大，該組分的保留時(shí)間越長。3.分配比可以由實(shí)驗(yàn)測(cè)得。分配比也稱：容量因子(capacityfactor)；容量比(capacityfactor)；2023/5/24第十九頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期五4.分配系數(shù)與分配比的關(guān)系

式中β為相比率，β＝Vm/

VS。

Vm為流動(dòng)相體積，即柱內(nèi)固定相顆粒間的空隙體積；

VS為固定相體積。是反映各種色譜柱柱型特點(diǎn)的又一個(gè)參數(shù)。填充柱β：6～35；毛細(xì)管柱β：50～1500。K=k.2023/5/24第二十頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期五5.分配比k與保留時(shí)間的關(guān)系

分配比k可直接從色譜圖測(cè)得。若組分和流動(dòng)相通過長度為L的分離柱，需要的時(shí)間分別為tr和t0（或tM)，則：2023/5/24第二十一頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期五三、色譜流出曲線與術(shù)語1.基線

無試樣通過檢測(cè)器時(shí)，檢測(cè)到的信號(hào)即為基線。2.保留值

（1）時(shí)間表示的保留值

保留時(shí)間（tr）：組分從進(jìn)樣到柱后出現(xiàn)濃度極大值時(shí)所需的時(shí)間；死時(shí)間（tM或t0）：不與固定相作用的物質(zhì)（如空氣）的保留時(shí)間；

調(diào)整保留時(shí)間（tr

＇）：tr＇=tr－t0

2023/5/24第二十二頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期五（2）用體積表示的保留值

保留體積（VR）：

Vr=tr×F0F0為柱出口處的載氣流速，單位：mL/min。

死體積（V0）：

V0=t0×F0

調(diào)整保留體積(VR＇)：

V

r＇=Vr－V0

2023/5/24第二十三頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期五3.相對(duì)保留值r21（選擇因子）組分2與組分1調(diào)整保留值之比：

r21=t′r2

/t′r1=V′r2/V′r1相對(duì)保留值只與柱溫和固定相性質(zhì)有關(guān)，與其他色譜操作條件無關(guān)，它表示了固定相對(duì)這兩種組分的選擇性，又稱選擇因子α，廣泛用作色譜定性的依據(jù)！2023/5/24第二十四頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期五4.分配系數(shù)K及分配比k與選擇因子α的關(guān)系對(duì)A、B兩組分的選擇因子，用下式表示：α=tr(B)/tr(A)=k(B)/k(A)

=K(B)/K(A)

通過選擇因子α把實(shí)驗(yàn)測(cè)量值k與熱力學(xué)性質(zhì)的分配系數(shù)K直接聯(lián)系起來，α對(duì)固定相的選擇具有實(shí)際意義。如果兩組分的K或k值相等，則α=1，兩個(gè)組分的色譜峰必將重合，說明分不開。兩組分的K或k值相差越大，則分離得越好。

兩組分具有不同的分配系數(shù)是色譜分離的先決條件。2023/5/24第二十五頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期五5.區(qū)域?qū)挾?/p>

用來衡量色譜峰寬度的參數(shù)，有三種表示方法：（1）標(biāo)準(zhǔn)偏差()：即0.607倍峰高處色譜峰寬度的一半。（2）半峰寬(Y1/2或W1/2)：色譜峰高一半處的寬度Y1/2=2.354（3）峰底寬(Y)：即色譜峰兩側(cè)拐點(diǎn)上的切線在基線上的截距，它與標(biāo)準(zhǔn)偏差的關(guān)系是:Y=42023/5/24第二十六頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期五6.色譜流出曲線的數(shù)學(xué)描述

色譜峰為高斯正態(tài)分布時(shí)，色譜流出曲線上的濃度與時(shí)間的關(guān)系為：

式中：C—不同時(shí)間t時(shí)某物質(zhì)的濃度，C0—進(jìn)樣濃度，tR—保留時(shí)間，σ—標(biāo)準(zhǔn)偏差。2023/5/24第二十七頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期五

從色譜流出曲線上，得到信息是：

（l）根據(jù)色譜峰的個(gè)數(shù)，可以判斷樣品中所含組份的最少個(gè)數(shù)．（2）根據(jù)色譜峰的保留值(或位置），可以進(jìn)行定性分析．

(3)根據(jù)色譜峰下的面積或峰高，可以進(jìn)行定量分析．（4）色譜峰的保留值及其區(qū)域?qū)挾?，是評(píng)價(jià)色譜柱分離效能的依據(jù)．（5）色譜峰兩峰間的距離，是評(píng)價(jià)固定相(和流動(dòng)相)選擇是否合適的依據(jù)．2023/5/24第二十八頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期五

色譜分離的基本理論小結(jié)

色譜分析的目的是將樣品中各組分彼此分離，組分要達(dá)到完全分離，兩峰間的距離必須足夠遠(yuǎn)，兩峰間的距離是由組分在兩相間的分配系數(shù)決定的，即與色譜過程的熱力學(xué)性質(zhì)有關(guān)。但是兩峰間雖有一定距離，如果每個(gè)峰都很寬，以致彼此重疊，還是不能分開。這些峰的寬或窄是由組分在色譜柱中傳質(zhì)和擴(kuò)散行為決定的，即與色譜過程的動(dòng)力學(xué)性質(zhì)有關(guān)。因此，要從熱力學(xué)和動(dòng)力學(xué)兩方面來研究色譜行為。2023/5/24第二十九頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期五第二節(jié)色譜理論基礎(chǔ)一、塔板理論platetheory二、速率理論ratetheory三、分離度resolution

Fundamentalofchromatographtheory

2023/5/24第三十頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期五色譜理論

色譜理論需要解決的問題：色譜分離過程的熱力學(xué)和動(dòng)力學(xué)問題。影響分離及柱效的因素與提高柱效的途徑，柱效與分離度的評(píng)價(jià)指標(biāo)及其關(guān)系。組分保留時(shí)間為何不同？色譜峰為何變寬？組分保留時(shí)間：色譜過程的熱力學(xué)因素控制；（組分和固定液的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)）色譜峰變寬：色譜過程的動(dòng)力學(xué)因素控制；（兩相中的運(yùn)動(dòng)阻力，擴(kuò)散）兩種色譜理論：塔板理論和速率理論；2023/5/24第三十一頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期五一、塔板理論-柱分離效能指標(biāo)

1.塔板理論（platetheory）半經(jīng)驗(yàn)理論；將色譜分離過程比擬作精餾過程，將連續(xù)的色譜分離過程分割成多次的平衡過程的重復(fù)（類似于分餾塔塔板上的平衡過程）。2023/5/24第三十二頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期五塔板理論的假設(shè)1.在柱內(nèi)一小段長度H內(nèi)，組分可以在兩相間迅速達(dá)到平衡。這一小段柱長稱為理論塔板高度H。2.以氣相色譜為例，載氣進(jìn)入色譜柱不是連續(xù)進(jìn)行的，而是脈動(dòng)式，每次進(jìn)氣為一個(gè)塔板體積（ΔVm）。3.所有組分開始時(shí)存在于第0號(hào)塔板上，而且試樣沿軸（縱）向擴(kuò)散可忽略。4.分配系數(shù)在所有塔板上是常數(shù)，與組分在某一塔板上的量無關(guān)。2023/5/24第三十三頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期五色譜柱長：L，虛擬的塔板間距離：H色譜柱的理論塔板數(shù)：n則三者的關(guān)系為：

n=L/H由塔板理論導(dǎo)出，理論塔板數(shù)與色譜參數(shù)之間的關(guān)系（重要公式）：2023/5/24第三十四頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期五2.有效塔板數(shù)和有效塔板高度

單位柱長的塔板數(shù)越多，表明柱效越高。用不同物質(zhì)計(jì)算可得到不同的理論塔板數(shù)。組分在t0時(shí)間內(nèi)不參與柱內(nèi)分配。需引入有效塔板數(shù)和有效塔板高度：（重要公式）2023/5/24第三十五頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期五3.塔板理論的特點(diǎn)和不足(1)當(dāng)色譜柱長度一定時(shí)，塔板數(shù)n

越大(塔板高度H越小)，被測(cè)組分在柱內(nèi)被分配的次數(shù)越多，柱效能則越高，所得色譜峰越窄。

(2)不同物質(zhì)在同一色譜柱上的分配系數(shù)不同，用有效塔板數(shù)和有效塔板高度作為衡量柱效能的指標(biāo)時(shí)，應(yīng)指明測(cè)定物質(zhì)。2023/5/24第三十六頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期五3.塔板理論的特點(diǎn)和不足(3)柱效不能表示被分離組分的實(shí)際分離效果，當(dāng)兩組分的分配系數(shù)K相同時(shí)，無論該色譜柱的塔板數(shù)多大，都無法分離。(4)塔板理論無法解釋同一色譜柱在不同的載氣流速下柱效不同的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，也無法指出影響柱效的因素及提高柱效的途徑。2023/5/24第三十七頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期五二、速率理論-影響柱效的因素1.速率方程（也稱范第姆特方程式）

H=A+B/u+C·u

H：理論塔板高度，u：載氣的線速度(cm/s)減小A、B、C三項(xiàng)可提高柱效；存在著最佳流速；

A、B、C三項(xiàng)各與哪些因素有關(guān)？

1956年荷蘭學(xué)者vanDeemter等在研究氣液色譜時(shí)，提出了色譜過程動(dòng)力學(xué)理論——速率理論。2023/5/24第三十八頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期五A─渦流擴(kuò)散項(xiàng)

A=2λdp

dp：固定相的平均顆粒直徑λ：固定相的填充不均勻因子固定相顆粒直徑dp↓，填充的越均勻，則A↓，H↓，柱效n↑。表現(xiàn)在渦流擴(kuò)散所引起的色譜峰變寬現(xiàn)象減輕，色譜峰較窄。為了減少渦流擴(kuò)散，提高柱效，使用細(xì)而均勻的顆粒，并且填充均勻是十分必要的。2023/5/24第三十九頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期五B/u—分子擴(kuò)散項(xiàng)

B=2

γDg

γ：彎曲因子，反映了固定相顆粒的幾何形狀對(duì)自由分子擴(kuò)散的阻礙情況。Dg：試樣組分分子在氣相中的擴(kuò)散系數(shù)（cm2·s-1）

(1)存在著濃度差，產(chǎn)生縱向擴(kuò)散;(2)擴(kuò)散導(dǎo)致色譜峰變寬，H↑(n↓)，分離變差;(3)分子擴(kuò)散項(xiàng)與流速有關(guān)，流速↓，滯留時(shí)間↑，擴(kuò)散↑;(4)擴(kuò)散系數(shù)：Dg

∝(M載氣)-1/2；M載氣↑，B值↓。2023/5/24第四十頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期五

k為容量因子；Dg、DL為擴(kuò)散系數(shù)。

減小擔(dān)體粒度，選擇小分子量的氣體作載氣，可降低傳質(zhì)阻力。C·u—傳質(zhì)阻力項(xiàng)對(duì)GC，傳質(zhì)阻力包括氣相傳質(zhì)阻力Cg和液相傳質(zhì)阻力CL即：

C=（Cg+CL）2023/5/24第四十一頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期五將上面式總結(jié)，即可得范第姆特方程

這一方程對(duì)選擇色譜分離條件具有實(shí)際指導(dǎo)意義，它指出了色譜柱填充的均勻程度，填料顆粒的大小，流動(dòng)相的種類及流速，固定相的液膜厚度等對(duì)柱效的影響。

2023/5/24第四十二頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期五2.載氣流速與柱效——最佳流速載氣流速高時(shí)：

傳質(zhì)阻力項(xiàng)是影響柱效的主要因素，流速，柱效。載氣流速低時(shí)：

分子擴(kuò)散項(xiàng)成為影響柱效的主要因素，流速,柱效。H-u曲線與最佳流速：

由于流速對(duì)這兩項(xiàng)完全相反的作用，流速對(duì)柱效的總影響使得存在著一個(gè)最佳流速值，即速率方程式中塔板高度對(duì)流速的一階導(dǎo)數(shù)有一極小值。以塔板高度H對(duì)應(yīng)載氣流速u作圖，曲線最低點(diǎn)的流速即為最佳流速。2023/5/24第四十三頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期五分離操作條件的選擇2023/5/24第四十四頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期五

(1)組分分子在柱內(nèi)運(yùn)行的多路徑與渦流擴(kuò)散、濃度梯度所造成的分子擴(kuò)散及傳質(zhì)阻力使氣液兩相間的分配平衡不能瞬間達(dá)到等因素是造成色譜峰擴(kuò)展柱效下降的主要原因。

(2)通過選擇適當(dāng)?shù)墓潭ㄏ嗔６取⑤d氣種類、液膜厚度及載氣流速可提高柱效。

(3)速率理論為色譜分離和操作條件選擇提供了理論指導(dǎo)。闡明了流速和柱溫對(duì)柱效及分離的影響。

(4)各種因素相互制約，如載氣流速增大，分子擴(kuò)散項(xiàng)的影響減小，使柱效提高，但同時(shí)傳質(zhì)阻力項(xiàng)的影響增大，又使柱效下降；柱溫升高，有利于傳質(zhì)，但又加劇了分子擴(kuò)散的影響，選擇最佳條件，才能使柱效達(dá)到最高。3.速率理論的要點(diǎn)2023/5/24第四十五頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期五三、分離度R

（分辨率）

塔板理論和速率理論都難以描述難分離物質(zhì)對(duì)的實(shí)際分離程度。即柱效為多大時(shí)，相鄰兩組份能夠被完全分離。難分離物質(zhì)對(duì)的分離度大小受色譜過程中兩種因素的綜合影響：保留值之差──色譜過程的熱力學(xué)因素；

區(qū)域?qū)挾醛ぉどV過程的動(dòng)力學(xué)因素。色譜分離中的四種情況如圖所示：2023/5/24第四十六頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期五討論：色譜分離中的四種情況的討論：①柱效較高，△K(分配系數(shù))較大,完全分離；②△K不是很大，柱效較高，峰較窄，基本上完全分離；③柱效較低，△K較大,但分離的不好；④△K小，柱效低，分離效果更差。2023/5/24第四十七頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期五圖中（a）兩色譜峰距離近