實(shí)驗(yàn)質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)化

實(shí)驗(yàn)四、質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)化

一

實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

二

實(shí)驗(yàn)原理

三

材料儀器

四

實(shí)驗(yàn)步驟

五

實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖

六

結(jié)果討論

七

思考題一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶W(xué)習(xí)將外源質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)入受體菌細(xì)胞并篩選轉(zhuǎn)化體的方法。

轉(zhuǎn)化（transformation）:把外源DNA分子導(dǎo)入到某一宿主細(xì)菌細(xì)胞的過程稱為轉(zhuǎn)化。當(dāng)細(xì)菌處于容易吸收外源DNA的狀態(tài)即感受態(tài)時(shí)，轉(zhuǎn)化最易發(fā)生。當(dāng)受體菌處于感受態(tài)時(shí)，轉(zhuǎn)化混合物中的DNA形成抗DNase的羧基鈣磷酸復(fù)合物粘附于細(xì)胞表面，經(jīng)42℃短時(shí)間熱沖擊處理，促進(jìn)細(xì)胞吸收外源DNA。在培養(yǎng)基上生長(zhǎng)數(shù)小時(shí)后，球狀細(xì)胞復(fù)原并分裂增殖。被轉(zhuǎn)化的細(xì)菌中，載體中抗抗生素基因得到表達(dá)，在選擇性培養(yǎng)基平板上，可選出所需的轉(zhuǎn)化子（transformant）。二、實(shí)驗(yàn)原理三、材料儀器實(shí)驗(yàn)儀器

超凈工作臺(tái)、恒溫?fù)u床、電熱恒溫培養(yǎng)箱、電熱恒溫水浴鍋、涂布棒，微量取樣器，冰盒等。實(shí)驗(yàn)材料大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞；質(zhì)粒DNA:pCR4ToPoGt5GT7(Kan+Amp抗性)；LB固體培養(yǎng)基；含Kan+Amp的LB固體培養(yǎng)基：將配好的LB固體培養(yǎng)基高壓滅菌后冷卻至60℃左右，加入Amp和Kan儲(chǔ)存液，使終濃度分別為50μg/ml，搖勻后鋪板。1．從冰箱中取出感受態(tài)細(xì)胞，放置冰上；2．每組分別取2管20μl感受態(tài)細(xì)胞懸液；第一管為轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)組：1μl重組質(zhì)粒DNA+20μl感受態(tài)細(xì)胞；第二管為陰性對(duì)照組；加入1μl無菌水+20μl感受態(tài)細(xì)胞懸液；輕輕搖勻，冰上放置30分鐘；3．將管放入42℃恒溫水浴中90秒，迅速將eppendorf管移到冰浴上，冷卻2min；四、實(shí)驗(yàn)步驟+420C熱擊370C復(fù)蘇Kan+Amp篩選感受態(tài)細(xì)胞質(zhì)粒DNA4.向上述eppendorf管中加入200uLLB液體培養(yǎng)基（不含抗生素），混勻后37℃振蕩培養(yǎng)20min，使細(xì)菌恢復(fù)正常生長(zhǎng)狀態(tài)，并表達(dá)質(zhì)粒編碼的抗性基因；5.將上述菌液搖勻后取100μl涂布于含Kan+Amp的篩選平板上，涂布之后，在37℃培養(yǎng)箱中正面向上放置半小時(shí)，待菌液完全被培養(yǎng)基吸收后倒置培養(yǎng)皿，37℃培養(yǎng)12-16小時(shí)；6.涂布細(xì)則如下表：組別培養(yǎng)皿編號(hào)DNA/μl滅菌水/μl平板抗性受體菌/μl11-1-對(duì)照-無—1無1001-1-對(duì)照-Amp+Kan

—1Amp+Kan1001-1-轉(zhuǎn)化-Amp+Kan1—Amp+Kan10021-2-對(duì)照-無—1無1001-2-對(duì)照-Amp+Kan

—1Amp+Kan1001-2-轉(zhuǎn)化-Amp+Kan1—Amp+Kan10031-3-對(duì)照-無—1無1001-3-對(duì)照-Amp+Kan

—1Amp+Kan1001-3-轉(zhuǎn)化-Amp+Kan1—Amp+Kan10041-4-對(duì)照-無—1無1001-4-對(duì)照-Amp+Kan

—1Amp+Kan1001-4-轉(zhuǎn)化-Amp+Kan1—Amp+Kan10051-5-對(duì)照-無—1無1001-5-對(duì)照-Amp+Kan

—1Amp+Kan1001-5-轉(zhuǎn)化-Amp+Kan1—Amp+Kan100組別培養(yǎng)皿編號(hào)DNA/μl滅菌水/μl平板抗性受體菌/μl61-6-對(duì)照-無—1無1001-6-對(duì)照-Amp+Kan

—1Amp+Kan1001-6-轉(zhuǎn)化-Amp+Kan1—Amp+Kan10071-7-對(duì)照-無—1無1001-7-對(duì)照-Amp+Kan—1Amp+Kan1001-7-轉(zhuǎn)化-Amp+Kan1—Amp+Kan10081-8-對(duì)照-無—1無1001-8-對(duì)照-Amp+Kan—1Amp+Kan1001-8-轉(zhuǎn)化-Amp+Kan1—Amp+Kan10091-9-對(duì)照-無—1無1001-9-對(duì)照-Amp+Kan

—1Amp+Kan1001-9-轉(zhuǎn)化-Amp+Kan1—Amp+Kan100涂布棒的使用1、使用前，浸入75%酒精中；2、在酒精燈上引燃涂布棒上的酒精（不要燒到手）；3、等酒精燒完后，讓涂布棒在空氣中冷卻；4、涂布均勻；5、將涂布棒重新除菌以備下一次使用；6、陰性對(duì)照與重組DNA的涂布棒區(qū)別使用，避免DNA污染。

A(對(duì)照-Amp+Kan):100ul菌液涂布于LB+Amp+Kan培養(yǎng)基，菌落生長(zhǎng)情況;B(轉(zhuǎn)化-Amp+Kan):100ul菌液涂布于LB+Amp+Kan培養(yǎng)基，菌落生長(zhǎng)情況;C(對(duì)照-無):100ul菌液涂布于LB培養(yǎng)基，菌落生長(zhǎng)情況;BCA五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖六、結(jié)果討論轉(zhuǎn)化過程中的影響因素1．受體細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)和密度

細(xì)胞生長(zhǎng)密度以每毫升培養(yǎng)液中的細(xì)胞數(shù)在5×107個(gè)左右為佳。即應(yīng)用對(duì)數(shù)期或?qū)?shù)生長(zhǎng)前期的細(xì)菌，可通過測(cè)定培養(yǎng)液的A600控制。2．質(zhì)粒DNA的質(zhì)量和濃度用于轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒DNA應(yīng)主要是超螺旋態(tài)的，轉(zhuǎn)化率與外源DNA的濃度在一定范圍內(nèi)成正比，但外源DNA的量過多時(shí)，則會(huì)使轉(zhuǎn)化率下降。一般來講，DNA溶液的體積不應(yīng)超過感受態(tài)細(xì)胞體積的5%，1ng的超螺旋DNA即可使50μl的感受態(tài)細(xì)胞達(dá)到飽和。對(duì)于以質(zhì)粒為載體的重組分子而言，分子量大的轉(zhuǎn)化效率低。此外，重組DNA分子的構(gòu)型與轉(zhuǎn)化效率也密切相關(guān)，環(huán)狀重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化率較分子量相同的線性重組質(zhì)粒高10-100倍。3．試劑的質(zhì)量化合物及無機(jī)離子的影響：所用的CaCl2等試劑均需是最高純度的，并用最純凈的水配制，分裝保存于4℃。在Ca2+的基礎(chǔ)上聯(lián)合其他二價(jià)金屬離子（如Mn2+或Co2+）、DMSO或還原劑等物質(zhì)處理細(xì)菌，可使轉(zhuǎn)化效率大大提高。4．防止雜菌和雜DNA的污染整個(gè)操作過程均應(yīng)在無菌條件下進(jìn)行，所用器皿，如離心管，移液槍頭等最好是新的，并經(jīng)高壓滅菌處理。所有的試劑都要滅菌，且注意防止被其它試劑、DNA酶或雜DNA所污染，否則均會(huì)影響轉(zhuǎn)化效率或雜DNA的轉(zhuǎn)入。5．整個(gè)操作均需在冰上進(jìn)行，不能離開冰浴，否則細(xì)胞轉(zhuǎn)化率將會(huì)降低。七、璃思津考蘆