版權(quán)說明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內(nèi)容提供方,若內(nèi)容存在侵權(quán),請進(jìn)行舉報或認(rèn)領(lǐng)
文檔簡介
資料內(nèi)容僅供您學(xué)習(xí)參考,如有不當(dāng)或者侵權(quán),請聯(lián)系改正或者刪除。第八章工程菌生產(chǎn)的蛋白包涵體的復(fù)性與純化分子生物學(xué)的發(fā)展使蛋白質(zhì)的表示和生產(chǎn)進(jìn)入到一個新的時代。大腸桿菌由于遺傳背景清晰,容易培養(yǎng),能夠大規(guī)模發(fā)酵,以及大量可供選擇利用的克隆和高效表示載體而成為當(dāng)前人們克隆和表示外源基因的首選菌株。可是,在實際操作中重組蛋白質(zhì)在大腸桿菌中的高水平表示往往導(dǎo)致蛋白質(zhì)聚集形成不溶性的包涵體。包涵體的形成雖有不少優(yōu)點,如可溶性形式存在的外源蛋白在細(xì)胞內(nèi)容易受到蛋白酶的攻擊,而包涵體形式存在的外源蛋白則不易被蛋白酶降解;包涵體的形成降低了細(xì)胞內(nèi)外源蛋白的濃度,有利于表示量的提高;包涵體中雜蛋白含量較低,且只需要簡單的低速離心就能夠與可溶性蛋白分離,有利于分離純化;包涵體對機械攪拌和超聲破碎不敏感,易于破壁,并與細(xì)胞膜碎片分離等??墒?無活性的包涵體蛋白質(zhì)需經(jīng)過復(fù)性使其折疊成為具有天然構(gòu)象和生物活性的蛋白質(zhì),這一般是一件很困難的事情,而且不同的蛋白質(zhì)其復(fù)性方法也各不相同,因此基因重組蛋白質(zhì)的復(fù)性一直是生物工程下游純化技術(shù)的研究熱點之一?,F(xiàn)有的生物技術(shù)研究和產(chǎn)業(yè)化過程表明,重組蛋白包涵體的變性及復(fù)性是重組蛋白類藥物生產(chǎn)中最為關(guān)鍵的技術(shù)之一,是基因工程產(chǎn)品商業(yè)化的瓶頸,也是一個世界性難題。第一節(jié)包涵體形成的原因1.什么是包涵體所謂包涵體是指由于表示部位低電勢及外源蛋白質(zhì)分子的特殊結(jié)構(gòu)(如Cys含量高),如低電荷,無糖基化等,使得重組蛋白質(zhì)與核酸,周圍雜蛋白質(zhì)(如核糖體元件、RNA聚合酶、內(nèi)毒素、外膜蛋白質(zhì)ompC、ompF和ompA等),以及脂體、脂多糖等形成的聚合體(圖8-1)。包涵體一般大小為0.1~3.0μm,具有很高的密度(約1.3mg/ml),無定形,呈非水溶性,只溶于尿素、鹽酸胍等變性劑。包涵體中重組蛋白質(zhì)一般占包涵體總成分的50%以上,它們沒有生物學(xué)活性,因為蛋白質(zhì)分子沒有形成正確的構(gòu)象。有報道表明成熟的分子相比包涵體內(nèi)蛋白質(zhì)含有更多的β結(jié)構(gòu)而較少的結(jié)構(gòu),也有報道表明包涵體中的肽鏈已獲得與天然蛋白質(zhì)分子非常接近的空間構(gòu)象。圖8-1在大腸桿菌中表示的包涵體(來源于Dr.HaukeLiLie)2.形成包涵體的原因包涵體形成的原因是多方面的,歸納起來大致有以下幾方面:(1)基因工程菌的表示產(chǎn)率過高,超過了細(xì)菌正常的代謝水平:研究發(fā)現(xiàn)在蛋白質(zhì)低表示時很少形成包涵體,表示量越高越容易形成包涵體。原因可能是蛋白質(zhì)合成的速度太快,多肽鏈相互纏繞,缺乏使多肽鏈正確折疊的因素,二硫鍵不能正確的配對,疏水基團外露等。一般當(dāng)表示的目的蛋白質(zhì)量超過細(xì)菌總蛋白質(zhì)量的10%時,就很容易形成包涵體。(2)重組蛋白質(zhì)的氨基酸組成:一般而言含硫的氨基酸越多越易形成包涵體,而脯氨酸的含量也明顯與包涵體的形成呈正相關(guān)。(3)宿主菌及其培養(yǎng)條件:較高的發(fā)酵溫度容易導(dǎo)致包涵體的形成,而降低宿主菌的培養(yǎng)溫度被證明對增加重組蛋白的可溶性表示是有效的。主要原因可能是降低溫度能夠增加折疊中間體的穩(wěn)定性或減少折疊中間體之間錯誤的相互作用,特別是疏水作用。豐富的培養(yǎng)基被認(rèn)為有利于活性蛋白質(zhì)的表示,當(dāng)培養(yǎng)條件不佳時,也容易導(dǎo)致包涵體的形成。另外選擇合適的宿主菌,改變培養(yǎng)基的pH等方法有時也能增加重組蛋白質(zhì)的可溶性表示。(4)重組蛋白質(zhì)缺乏翻譯后修飾:由于大腸桿菌表示系統(tǒng)屬于原核表示系統(tǒng),缺少真核細(xì)胞中翻譯后修飾所需酶類和輔助因子,如折疊酶和分子伴侶等,故致使中間體大量積累,容易形成包涵體沉淀。(5)蛋白質(zhì)在合成之后,于中性pH或接近中性pH的環(huán)境下,其本身固有的溶解度對于包涵體的形成比較關(guān)鍵。這其實與蛋白質(zhì)本身的性質(zhì)有關(guān),如果蛋白質(zhì)合成后,其本身的溶解度比較高,就不容易形成包涵體。(6)在細(xì)菌分泌的某個階段,蛋白質(zhì)分子間的離子鍵、疏水鍵或共價鍵等化學(xué)作用導(dǎo)致了包涵體的形成。第二節(jié)包涵體的制備和溶解基因工程發(fā)酵液經(jīng)離心濃縮后,可用機械磨碎法、超聲波處理法或溶菌酶加去污劑的方法使細(xì)菌裂解,裂菌程度可經(jīng)過取樣鏡檢來確定。裂菌完成后離心收集沉淀即為包涵體,離心分離包涵體時的離心力不宜過大,離心時間不宜過長,以電泳檢測上清中基本不含重組蛋白質(zhì)即可,這樣能夠減少沉淀中菌體細(xì)胞膜碎片、核糖體等的含量從而提高粗制包涵體的純度。包涵體分離方法的選擇與所表示蛋白質(zhì)的性質(zhì)沒有明顯關(guān)系。為了去除粗制包涵體上粘附的雜質(zhì),如膜蛋白或核酸,可應(yīng)用洗滌液洗滌包涵體。洗滌液一般選用去污劑TritonX-100、脫氧膽酸鈉、蔗糖、尿素、鹽酸胍等配制。但必須注意過高濃度的尿素或鹽酸胍會使包涵體溶解。經(jīng)洗滌后的包涵體的純度一般可達(dá)到80%左右。洗滌、純化后的包涵體必須用含變性劑的溶液使之溶解。溶解的過程一般應(yīng)包括包涵體蛋白質(zhì)的變性和錯配二硫鍵的還原。包涵體蛋白質(zhì)變性常見的變性劑有4~7mol/L的鹽酸胍,6~8mol/L的尿素,以及一些去污劑如1%~2%的SDS、脫氧膽酸鹽等。有時不用變性劑而采用pH2.0~4.5的酸性溶液也能夠使包涵體溶解。在使用變性劑溶解包涵體時最一般選用的是鹽酸胍,這主要有兩方面原因:一是因為鹽酸胍是一種相對更強的變性劑,它能使尿素不能溶解的包涵體溶解;二是由于尿素分解的異氰酸鹽會導(dǎo)致多肽鏈的自由氨基甲?;?特別是長時間處于堿性環(huán)境下時如此,而使用鹽酸胍則能夠避免這一問題的產(chǎn)生。例如用鹽酸胍溶解人IL-4包涵體能夠提高它的復(fù)性率,而用尿素溶解則得不到有活性的蛋白質(zhì)。如果蛋白質(zhì)含有半胱氨酸,則包涵體中可能含有分子內(nèi)和分子間二硫鍵,這時應(yīng)添加還原劑如二硫蘇糖醇(DTT)、還原性谷胱甘肽(GSH)、二硫赤蘚糖醇、半胱氨酸、胱胺、-巰基乙醇(-MT)等使二硫鍵經(jīng)過硫醇-二硫化物交換而還原。常見的是DTT和-MT。DTT的還原能力比β-MT強,因此DTT的用量一般比-MT少。但Fischer等比較了多種溶解包涵體的實驗方案后認(rèn)為,包涵體的溶解、還原方法與它的天然構(gòu)象中含有的二硫鍵的數(shù)目之間沒有明顯關(guān)系。對于有些沒有二硫鍵的蛋白質(zhì)加不加還原劑都不影響包涵體的溶解;可是對于另一些沒有二硫鍵的蛋白質(zhì),還原劑的使用常常能夠增加其溶解性,這可能是由于含有二硫鍵的雜蛋白影響了包涵體的溶解。實驗方法舉例。材料和儀器:(1)TE1緩沖液:Tris-HCl50mmol/LpH8.0,EDTA1mmol/L,NaCl100mmol/L(2)TE2緩沖液:0.5%TritonX-100(V/V),Tris-HCl20mmol/L,pH7.0,EDTA1mmol/L,NaCl100mmol/L(3)變性液:鹽酸胍6mol/L,Tris-Cl20mmol/LpH7.0,EDTA1mmol/L,NaCl100mmol/l(4)低溫高速離心機,超聲裂菌儀2.操作步驟:(1)稱取30g濕菌置于500ml燒杯中,加入300mlTE1緩沖液,加入攪拌子攪拌20min,使菌體分散均勻。(2)將上述燒杯置于冰浴,用超聲破菌儀超聲破菌20-40次(30s/次,間隔30s),每隔10次取樣涂片作革蘭氏染色,顯微鏡下檢查,當(dāng)每個視野內(nèi)未破菌≤2個時,超聲破菌結(jié)束。(3)將超聲破菌液轉(zhuǎn)移至500ml離心管,在低溫高速離心機上,7000rpm,4℃離心20min,棄上清。(4)在沉淀中加入300mlTE2緩沖液,加入攪拌子攪拌30min。取出攪拌子,將裝有懸濁液的離心管在低溫高速離心機上,7000rpm,4℃離心20min,棄上清。(5)在沉淀中加入150ml變性液,加入攪拌子攪拌溶解2h。取出攪拌子,將裝有懸濁液的離心管在低溫高速離心機上,8000rpm,4℃離心30min,將上清轉(zhuǎn)移至一個500ml燒杯中。所得上清即為變性的蛋白液。不同包涵體的大小和密度并不相同,因而離心分離的時間和轉(zhuǎn)速應(yīng)經(jīng)過實驗確定。以分離的上清經(jīng)蛋白質(zhì)電泳基本不含目的蛋白質(zhì)即可,不宜使用過高的轉(zhuǎn)速和過長的時間,以使一些細(xì)胞膜碎片留在上清中,從而提高包涵體的純度。對包涵體的洗滌方法是可選的,且TritonX-100和鹽酸胍的濃度也應(yīng)經(jīng)過實驗確定。蛋白質(zhì)變性劑的種類和濃度也應(yīng)經(jīng)過實驗確定。第三節(jié)包涵體的復(fù)性一、影響包涵體復(fù)性的因素復(fù)性的過程主要包括肽鏈的折疊和分子內(nèi)二硫鍵的氧化,這是兩個相互影響的過程,適當(dāng)折疊的肽鏈常常有利于二硫鍵的形成,同時,正確的二硫鍵形成有利于折疊產(chǎn)物的穩(wěn)定。變性蛋白質(zhì)在去除或降低變性劑濃度后,就會自發(fā)地由變性時的熱力學(xué)不穩(wěn)定狀態(tài)向熱力學(xué)穩(wěn)定狀態(tài)轉(zhuǎn)變。這一過程是一個復(fù)雜的過程,主要包括變性劑去除或降低后,變性蛋白質(zhì)從伸展態(tài)迅速卷曲形成第一中間態(tài),也稱融球態(tài)(moltenglobues,MG)的形式。在這種狀態(tài)下,蛋白質(zhì)的疏水基團處于蛋白質(zhì)的表面。然后融球態(tài)蛋白質(zhì)的疏水基團向蛋白質(zhì)內(nèi)部折疊成疏水核心,即轉(zhuǎn)變?yōu)榈诙虚g態(tài),并進(jìn)一步折疊為天然態(tài),這一過程相對緩慢。融球態(tài)由于其表面的疏水分子在分子間碰撞中容易發(fā)生分子間可逆的暫時締合,形成二聚體,二聚體進(jìn)一步締合就會形成多聚體,最終形成沉淀。因而這一步是影響一些蛋白質(zhì)復(fù)性回收率的限速步驟。除此之外,影響蛋白質(zhì)復(fù)性的因素還有很多,如蛋白質(zhì)濃度、變性劑濃度、復(fù)性的方法等,下面舉例說明。蛋白質(zhì)濃度復(fù)性過程中正確折疊的蛋白質(zhì)往往得率很低,這一般是由于多肽鏈的聚集作用引起的。蛋白質(zhì)濃度是促使蛋白質(zhì)聚集的主要因素。聚集反應(yīng)是一個分子間反應(yīng),它至少涉及兩條肽鏈。它的速度與蛋白質(zhì)濃度的n(n≥2)次方成正比。折疊中間體在高濃度下產(chǎn)生聚集的主要原因之一是由于暴露在它們表面的疏水基團的相互作用,而折疊過程與蛋白質(zhì)的濃度無關(guān)。因此為了減慢聚集反應(yīng),蛋白質(zhì)的濃度一般應(yīng)控制在10-100mg/L。分子締合與MG向第二中間態(tài)轉(zhuǎn)變不同,后者主要是一級反應(yīng),其速度往往隨蛋白質(zhì)濃度的增加而增加,因而在變性蛋白質(zhì)復(fù)性工作中降低蛋白質(zhì)濃度往往能夠提高復(fù)性的效率,但實際上過低的濃度又會給后續(xù)純化工作帶來困難,而且在工業(yè)生產(chǎn)中經(jīng)過降低蛋白質(zhì)的濃度來減慢聚集反應(yīng)的速度也是不經(jīng)濟的,這需要消耗大量的復(fù)性液,同時增加工作量。因而應(yīng)經(jīng)過實驗來選擇合適的蛋白質(zhì)濃度,當(dāng)前認(rèn)為這一濃度一般為10-200mg/L。氧化還原條件對于含有二硫鍵的重組蛋白,在復(fù)性時需要考慮為之提供合適的氧化還原條件以使之形成正確的二硫鍵。常見的方法有以下幾種。1.空氣氧化法這是直接利用空氣中的氧氣氧化變性蛋白質(zhì)使之形成正確二硫鍵的方法。使用該方法時,合適濃度的金屬離子如二價銅離子,鋅離子等能夠促進(jìn)空氣的氧化作用。可是該方法較難實現(xiàn)對整個過程的精確控制。2.硫化物氧化法這是利用硫化物提供的氧化還原條件而促使變性蛋白質(zhì)中半胱氨酸間形成正確二硫鍵的方法。氧化還原環(huán)境可由氧化型谷胱甘肽-還原型谷胱甘肽提供,也可由胱氨酸-半胱氨酸提供。該方法的優(yōu)點是能夠經(jīng)過控制硫化物的濃度和比例來控制氧化的程度,缺點是比較昂貴。3.DTT氧化法變性蛋白質(zhì)的半胱氨酸與氧化型DTT反應(yīng)形成一個不穩(wěn)定的折疊中間體,該中間體可隨著還原型DTT的釋放和分子內(nèi)二硫鍵的形成而分解,最終實現(xiàn)二硫鍵的正確形成。利用該方法也能夠經(jīng)過控制氧化型DTT的濃度來實現(xiàn)對氧化程度的控制。4.溫度和pH為了防止蛋白質(zhì)的水解,一般認(rèn)為復(fù)性溫度在4℃最好;另外,蛋白質(zhì)樣品肯定是未經(jīng)滅菌的,因此較低的溫度有利于抑制細(xì)菌的生長。同時復(fù)性液的pH值必須在7.0以上,這樣就能夠防止自由硫醇的質(zhì)子化作用影響二硫鍵的正確配對和形成,一般而言復(fù)性的最佳pH值為8.0-9.0。5.無規(guī)凝聚抑制劑或協(xié)同因子的添加聚乙二醇(PEG)、甘油、環(huán)狀糊精,葡萄糖、硫胺、TritonX-100、蔗糖等分子的添加可有效地促進(jìn)變性蛋白質(zhì)的正確折疊,它們可經(jīng)過不同的作用提高復(fù)性的效果。如鹽酸胍能保護沒有折疊或部分折疊分子的疏水基,從而減少了分子間的締合和沉淀的形成。L-Arg則能經(jīng)過增大折疊中間體的的溶解性而提高變性蛋白質(zhì)的復(fù)性率。PEG、蔗糖則能促進(jìn)變性蛋白質(zhì)的溶解,提高具有天然構(gòu)象蛋白質(zhì)的最終得率。6.分子伴侶的添加分子伴侶是由于它們在體外可促進(jìn)其它蛋白質(zhì)的折疊而不參與其最終產(chǎn)物的形成而得名,許多實驗表明它們在體外可促進(jìn)蛋白質(zhì)的復(fù)性。二、復(fù)性的方法(一)稀釋復(fù)性該方法是經(jīng)過用緩沖液或含有低濃度變性劑的溶液稀釋蛋白質(zhì)變性液,使蛋白質(zhì)變性液中變性劑的濃度下降,以促進(jìn)變性蛋白質(zhì)肽鏈的折疊。稀釋的方法有一步稀釋、分步稀釋和連續(xù)稀釋等。稀釋的同時,在稀釋液中加入GSH、Cu2+等巰基氧化劑,以促進(jìn)二硫鍵的形成。一步稀釋是在復(fù)性開始時,變性液用緩沖液或含低濃度變性劑的溶液快速稀釋,使變性劑濃度和蛋白質(zhì)濃度一步降低到較低濃度,其特點是操作簡單,而且復(fù)性開始時蛋白質(zhì)濃度已降低至較低,有利于復(fù)性中間體的形成;但由于變性劑濃度迅速降低,不利于復(fù)性中間體的穩(wěn)定,因而有時反而容易形成沉淀。分步稀釋和連續(xù)稀釋則是將變性液用緩沖液或含低濃度變性劑的溶液逐步稀釋,復(fù)性中間體存在于較高濃度的變性劑溶液中,有利于穩(wěn)定中間體,但由于蛋白質(zhì)濃度也是逐漸降低的,在復(fù)性開始時蛋白質(zhì)的濃度還是比較高的,易于產(chǎn)生中間體的締合。對于不同的蛋白質(zhì),復(fù)性采用何種稀釋方法應(yīng)由實驗確定。(二)透析復(fù)性該方法是先用變性液將已變性蛋白質(zhì)的濃度稀釋降低到較低濃度(如0.01~0.2mg/mL),而變性劑濃度不變,然后將稀釋后的蛋白質(zhì)變性液轉(zhuǎn)入合適的透析袋中,用含低濃度變性劑和巰基氧化劑的復(fù)性液透析,逐步降低變性劑的濃度,并在巰基氧化劑存在的條件下逐步復(fù)性。這種方法避免了一步稀釋復(fù)性時變性劑濃度變化過快及分步稀釋和連續(xù)稀釋時初始蛋白質(zhì)濃度較高的問題,該方法的缺點是規(guī)模放大較為困難。透析時可進(jìn)行一步透析,即直接用不含變性劑的的透析外液進(jìn)行透析;也可采用梯度透析,即使透析外液中變性劑的濃度逐步降低。一步透析常常會在透析袋中出現(xiàn)大量沉淀,類似于快速稀釋時產(chǎn)生的沉淀,而梯度稀釋則效果會好一些。另外,由于透析袋內(nèi)和透析體系中溶氧有限,GSH氧化不足,因此另外加入合適濃度的GSSH并采用較長的復(fù)性時間非常重要。稀釋復(fù)性和透析復(fù)性的原理大同小異,而且它們都比較適合較小規(guī)模的復(fù)性(1L以下),在大規(guī)模復(fù)性過程中(10L以上),由于攪拌困難和透析體積有限,有人利用類似的原理采用了將復(fù)性溶液泵入變性蛋白質(zhì)溶液的方法,效果很好。這種方法可使變性劑濃度隨蛋白質(zhì)濃度的降低而緩慢的降低,并能夠減少沉淀的大量生成,使復(fù)性的條件變得更加溫和,從而使大規(guī)模復(fù)性也能夠達(dá)到甚至略高于小規(guī)模復(fù)性體系的復(fù)性效率。下面介紹透析復(fù)性常見的實驗方法。1.材料和儀器(1)變性的蛋白溶液:鹽酸胍6mol/L,Tris-HCl20mmol/L,pH7.0,EDTA1mmol/L,NaCl100mmol/L,蛋白濃度約5mg/mL(2)稀釋液:鹽酸胍6mol/L,Tris-HCl20mmol/L,pH7.0,EDTA1mmol/L,NaCl100mmol/L(3)透析內(nèi)液:經(jīng)稀釋的變性蛋白液(4)透析外液:含有不同濃度鹽酸胍的TE(Tris-HCl20mmol/L,pH7.0,EDTA1mmol/L,NaCl100mmol/L)(5)透析袋:截留分子量為3000Da(6)低溫高速離心機2.操作步驟(1)將變性的蛋白溶液用稀釋液稀釋后,裝入預(yù)處理過的透析袋中,兩端封閉。(2)將上述透析袋放入裝有透析外液的燒杯中,透析外液的體積為透析內(nèi)液的20倍,透析外液中鹽酸胍的濃度為3mol/L,4℃攪拌透析12h。(3)將透析袋取出,放入另一個裝有透析外液的燒杯中,透析外液的體積為透析內(nèi)液的20倍,透析外液中鹽酸胍的濃度為1.2mol/L,4℃攪拌透析12h。(4)將透析袋取出,放入另一個裝有透析外液的燒杯中,透析外液的體積為透析內(nèi)液的20倍,透析外液中鹽酸胍的濃度為0.6mol/L,4℃攪拌透析12h。(5)將透析袋取出,放入另一個裝有透析外液的燒杯中,透析外液的體積為透析內(nèi)液的20倍,透析外液中鹽酸胍的濃度為0mol/L,4℃攪拌透析12h。(6)將透析好的溶液轉(zhuǎn)入離心管中,在低溫高速離心機上,10000rpm,4℃離心30min,收集上清即為蛋白復(fù)性液。透析前應(yīng)對蛋白的濃度進(jìn)行定量,然后用稀釋液對其進(jìn)行稀釋。因為變性蛋白溶液中蛋白的濃度在復(fù)性中很重要,蛋白濃度越低,復(fù)性回收率越高,可是可能給后續(xù)純化工作帶來難度,因此在實驗中也應(yīng)經(jīng)過預(yù)實驗確定最合適的蛋白濃度。(三)色譜法復(fù)性該方法是直接經(jīng)過層析使蛋白質(zhì)復(fù)性。根據(jù)分離原理的不同,常見于復(fù)性的色譜法有體積排阻色譜法(SEC)、離子交換色譜法(IEC)、親和色譜法(AFC)、疏水色譜法(HIC)。這4種色譜的相同之處是色譜固定相對蛋白質(zhì)復(fù)性做出了貢獻(xiàn)。根據(jù)所采用的固定相不同,色譜復(fù)性法也可分為以剛性基質(zhì)硅膠為固定相的高效液相色譜(HPLC)和以非剛性基質(zhì)為固定相的中壓色譜和常壓色譜。比較蛋白質(zhì)復(fù)性的各類指標(biāo),高效液相色譜是一個較理想、具有發(fā)展前途的方法,它包括反相高效液相色譜(RPLC)、高效疏水色譜法(HPHIC)等。高效疏水色譜法是一種廉價的通用型蛋白分離和純化的工具,它特別適用于用硫酸銨溶液沉淀分離后的母液以及該沉淀用鹽溶液溶解后的溶液,如7mmol/L鹽酸胍或8mmol/L尿素的蛋白溶液,因此特別適用于大腸桿菌表示的重組蛋白的提取液。其固定相是從高濃度鹽溶液中吸附變性蛋白質(zhì),且與變性劑瞬時分離。這不但大大降低蛋白質(zhì)分子間的聚集作用,還因固定相能在分子水平上為變性蛋白質(zhì)提供很高的能量,使水化的變性蛋白質(zhì)瞬時失水并形成局部結(jié)構(gòu)以利于蛋白分子從疏水核開始折疊。另外梯度洗脫使各種蛋白質(zhì)分子能夠”自己選折”對自己有利的條件進(jìn)行折疊,以達(dá)到同固定相和流動相間的協(xié)同作用,更有利于復(fù)性最優(yōu)化條件的選擇。用該方法對變性蛋白進(jìn)行復(fù)性時,復(fù)性效率一般大于90%。與稀釋復(fù)性和透析復(fù)性相比較,色譜復(fù)性法具有以下幾項優(yōu)點:去除變性劑快;可明顯減少變性蛋白質(zhì)在脫離變性劑后由于分子聚集而產(chǎn)生的沉淀,從而提高復(fù)性蛋白的質(zhì)量和活性;使蛋白質(zhì)復(fù)性與雜蛋白的分離同時進(jìn)行;以及便于變性劑回收。凝膠層析為例,將變性蛋白質(zhì)上凝膠柱后,用不含變性劑的平衡液洗滌柱子,在較低的蛋白質(zhì)濃度下,蛋白質(zhì)經(jīng)過凝膠顆粒時在填充料間穿行,使得分子與分子間有一定的距離和自由空間進(jìn)行折疊而不受其它分子的影響,周圍的平衡液提供合適的pH值及離子強度,蛋白質(zhì)分子緩慢從柱子頂端流到底部時,逐步與變性劑分開,即折疊成有活性的物質(zhì),這個過程是相對勻速的而且速率可根據(jù)不同的蛋白質(zhì)進(jìn)行調(diào)整。色譜法復(fù)性中,消耗的變性劑較少,只有稀釋復(fù)性的1%;高純度的變性劑價格高,使用的變性劑量少,可使成本降低。已經(jīng)有報道證明色譜法復(fù)性的效率高于透析復(fù)性和稀釋復(fù)性??墒巧V法在使用流動相置換變性劑時,可能產(chǎn)生變性蛋白質(zhì)分子之間聚集而形成少許的沉淀,這些沉淀在進(jìn)行梯度洗脫時常常也不能溶解在洗脫能力很強的流動相中,有時甚至在濃的變性劑溶液中,這些沉淀也不能完全溶解。這些沉淀積累后就會使柱壓很快升至很高甚至報廢。另外,色譜法復(fù)性在大規(guī)模復(fù)性中的應(yīng)用還有待于進(jìn)一步的改進(jìn)和嘗試。下面以用高效疏水色譜法對-淀粉酶的純化復(fù)性為例簡介色譜法復(fù)性的步驟。1.材料和儀器()-淀粉酶(-Amylase)(2)流動相A液:(NH4)2SO43.0mol/L,KH2PO40.05mol/LpH7.0(3)流動相B液:KH2PO40.05mol/LpH7.0(4)ShimadzuLC-6A高效液相色譜儀,低溫高速離心機(5)色譜柱為100mm×4mm,介質(zhì)為XDF-GMXDF-SGM型疏水填料2.操作步驟(1)取標(biāo)準(zhǔn)-Amy2.0mg溶于7.0mol/L鹽酸胍,使胍變-Amy濃度為2.0g/L(2)將胍變-Amy于20℃恒溫變性24h(3)取變性蛋白液在低溫高速離心機上,10000rpm,4℃離心30min,收集上清上柱(4)從100%的A液到100%的B液線性梯度洗脫25min(5)從100%的B液到100%的A液線性梯度洗脫10min,流速0.8ml/min,檢測波長280nm,0.08AUFS(6)收集各種色譜流分,對-Amy活性進(jìn)行測定。(四)高蛋白質(zhì)濃度下的復(fù)性當(dāng)?shù)鞍诐舛雀哂?00mg/L時,我們將其稱為高濃度的蛋白,在這種情況下,一般采用兩種方法對其進(jìn)行復(fù)性。第一種方法是緩慢地連續(xù)或不連續(xù)地將變性蛋白加入到復(fù)性緩沖液中,使得蛋白質(zhì)在加入過程中或加入階段之間有足夠的時間進(jìn)行折疊復(fù)性;第二種方法是采用溫度跳躍式復(fù)性,即讓蛋白質(zhì)先在低溫下折疊復(fù)性以減少蛋白質(zhì)聚集的形成,當(dāng)形成聚集體的中間體已經(jīng)減少時,迅速提高溫度以促進(jìn)蛋白質(zhì)折疊復(fù)性。如Hevehan等經(jīng)過改變復(fù)性液的組成和復(fù)性條件對1g/L和5g/L高濃度的變性蛋白質(zhì)成功進(jìn)行了復(fù)性。她們表明在復(fù)性液中存在低濃度的鹽酸胍和L-Arg時能有效地提高高濃度變性溶菌酶的復(fù)性率,使其達(dá)到95%。這種方法也非常簡便,因為它不需要在復(fù)性前除去還原劑和變性劑,只需要把變性的蛋白質(zhì)快速地稀釋到含非變性濃度的鹽酸胍復(fù)性液中。(五)其它方法除了上述四種常見的復(fù)性方法以外,人們還嘗試了許多其它的方法來對包涵體蛋白質(zhì)進(jìn)行復(fù)性,如超濾復(fù)性、吸附法、反膠束復(fù)性法、雙水相復(fù)性法等。超濾復(fù)性法較多應(yīng)用于生產(chǎn)中,其優(yōu)點是規(guī)模較大,易于對透析速度進(jìn)行控制,缺點是不適合樣品量較少的情況,且有些蛋白可能在超濾過程中不可逆的變性。反膠束復(fù)性法的原理是蛋白質(zhì)在反膠束內(nèi)水相中能夠保持其構(gòu)象和活性,運用相轉(zhuǎn)移技術(shù)能夠?qū)⒌鞍踪|(zhì)分子包于反膠束內(nèi),由于這樣可使蛋白質(zhì)相互分離,減少了蛋白質(zhì)折疊過程中的聚集作用,經(jīng)過逐漸降低變性劑的濃度和加入氧化-還原對,可使變性蛋白質(zhì)復(fù)性。有人用硫氰化鈉、氯化鈉、溴化鋰與聚乙二醇構(gòu)成的雙水相系統(tǒng)使得包涵體的溶解與蛋白質(zhì)的折疊復(fù)性在一步雙水相技術(shù)操作中完成。由于PEG具有穩(wěn)定蛋白質(zhì)構(gòu)象的作用、高濃度鹽則具有去穩(wěn)定的作用,這樣正確折疊的蛋白質(zhì)會不斷進(jìn)入到另一相中,直到蛋白質(zhì)的折疊與去折疊達(dá)到一個平衡。三、復(fù)性效果的檢測蛋白質(zhì)復(fù)性后,需進(jìn)一步對蛋白質(zhì)的復(fù)性效果進(jìn)行檢測。根據(jù)不同蛋白質(zhì)的具體特性和實驗需要,能夠從以下幾個方面對蛋白質(zhì)的復(fù)性效率進(jìn)行檢測。丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳是用于檢測蛋白質(zhì)的常見方法。一般能夠用非變性的聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測變性和天然狀態(tài)的蛋白質(zhì),或用非還原的聚丙烯酰胺電泳檢測有二硫鍵的蛋白復(fù)性后二硫鍵的配對情況。生物學(xué)活性及比活性測定復(fù)性蛋白的活性一般可經(jīng)過細(xì)胞學(xué)方法或生物化學(xué)的方法進(jìn)行測定,可是值得注意的是,不同的測活方法測得的結(jié)果不一定相同,而且常常不能完全反映體內(nèi)活性。免疫學(xué)方法蛋白的功能一般取決于其結(jié)構(gòu)。一般來說只有具有正確構(gòu)像的蛋白質(zhì)才能行使正確的生物學(xué)功能,因此一些免疫學(xué)方法如ELISA、Western-blot等,往往能夠用于檢測蛋白質(zhì)的折
溫馨提示
- 1. 本站所有資源如無特殊說明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請下載最新的WinRAR軟件解壓。
- 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請聯(lián)系上傳者。文件的所有權(quán)益歸上傳用戶所有。
- 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網(wǎng)頁內(nèi)容里面會有圖紙預(yù)覽,若沒有圖紙預(yù)覽就沒有圖紙。
- 4. 未經(jīng)權(quán)益所有人同意不得將文件中的內(nèi)容挪作商業(yè)或盈利用途。
- 5. 人人文庫網(wǎng)僅提供信息存儲空間,僅對用戶上傳內(nèi)容的表現(xiàn)方式做保護處理,對用戶上傳分享的文檔內(nèi)容本身不做任何修改或編輯,并不能對任何下載內(nèi)容負(fù)責(zé)。
- 6. 下載文件中如有侵權(quán)或不適當(dāng)內(nèi)容,請與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
- 7. 本站不保證下載資源的準(zhǔn)確性、安全性和完整性, 同時也不承擔(dān)用戶因使用這些下載資源對自己和他人造成任何形式的傷害或損失。
最新文檔
- 2025高考數(shù)學(xué)考點剖析精創(chuàng)專題卷七-空間向量與立體幾何【含答案】
- 糖尿病視網(wǎng)膜病變病例討論(共30張課件)
- 江西省贛州市興國縣高興鎮(zhèn)高興小學(xué)-主題班會-網(wǎng)絡(luò)安全教育【課件】
- 二零二五年短視頻平臺場推廣服務(wù)協(xié)議2篇
- 第2課《濟南的冬天》課時提高練2024-2025學(xué)年語文七年級上冊
- 高績效團隊的成功秘密就在會議里!講解材料
- 四年級語文上冊第七單元習(xí)作寫信習(xí)題課件2新人教版
- 二零二五版交通事故醫(yī)療費用賠償協(xié)議3篇
- 2024年濟寧職業(yè)技術(shù)學(xué)院高職單招職業(yè)技能測驗歷年參考題庫(頻考版)含答案解析
- 2024年浙江東方職業(yè)技術(shù)學(xué)院高職單招職業(yè)適應(yīng)性測試歷年參考題庫含答案解析
- 【課件】寒假是用來超越的!課件 2024-2025學(xué)年高中上學(xué)期寒假學(xué)習(xí)和生活指導(dǎo)班會
- 2024-2025學(xué)年北師大版數(shù)學(xué)七年級上冊期末練習(xí)卷
- 2025年山東兗礦集團公司招聘筆試參考題庫含答案解析
- 燃?xì)庥邢薰竟こ滩抗芾碇贫葏R編
- 2024年中國干粉涂料市場調(diào)查研究報告
- (自考)經(jīng)濟學(xué)原理中級(政經(jīng))課件 第二章 商品和貨幣
- ×××老舊小區(qū)改造工程施工組織設(shè)計(全面)
- GB/T 3324-2024木家具通用技術(shù)條件
- 《材料合成與制備技術(shù)》課程教學(xué)大綱(材料化學(xué)專業(yè))
- 小紅書食用農(nóng)產(chǎn)品承諾書示例
- 釘釘OA辦公系統(tǒng)操作流程培訓(xùn)
評論
0/150
提交評論