代謝物識(shí)別與結(jié)構(gòu)鑒定

代謝物識(shí)別與結(jié)構(gòu)鑒定第一頁，共三十六頁，編輯于2023年，星期五代謝物的結(jié)構(gòu)鑒定在新藥開發(fā)過程的重要地位預(yù)防潛在的毒性測(cè)定是否和原藥具有相同的治療作用測(cè)定對(duì)其他治療有內(nèi)在的活性測(cè)定是否有代謝物和已知藥物相關(guān)第二頁，共三十六頁，編輯于2023年，星期五藥物代謝研究貫穿于創(chuàng)新藥物研發(fā)產(chǎn)業(yè)鏈的始終，并在藥物的發(fā)現(xiàn)及開發(fā)過程中起到越來越重要的作用。建立可靠的分析方法是研究藥物體內(nèi)代謝的前提。在藥物發(fā)現(xiàn)和開發(fā)的許多階段，代謝物鑒定具有關(guān)鍵性作用。極性代謝物的分離和保留怎樣在復(fù)雜的數(shù)據(jù)中準(zhǔn)確快速地找到代謝物怎樣對(duì)代謝物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行確認(rèn)，怎樣確定代謝位點(diǎn)A

CB

第三頁，共三十六頁，編輯于2023年，星期五聯(lián)用技術(shù)放射性示蹤第四頁，共三十六頁，編輯于2023年，星期五一、.聯(lián)用技術(shù)第五頁，共三十六頁，編輯于2023年，星期五聯(lián)用技術(shù)LC-MSLC-MS/MSGC-MSGC-MS/MSLC-NMR第六頁，共三十六頁，編輯于2023年，星期五LC-MS聯(lián)用技術(shù)體內(nèi)代謝物研究過程中，因待測(cè)物濃度太低，提取其純品進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定是不太可能的。應(yīng)用LC-MS聯(lián)用技術(shù)可獲得復(fù)雜混合體中單一成分的質(zhì)譜圖，大大有利與藥物代謝物的分離與鑒定。第七頁，共三十六頁，編輯于2023年，星期五LC-MS聯(lián)用技術(shù)隨著現(xiàn)代色譜聯(lián)用技術(shù)的發(fā)展，體內(nèi)多種微量代謝產(chǎn)物的分離、鑒定已成為一個(gè)連續(xù)過程，尤其是LC-MS樣品前處理簡單，一般不要求水解或衍生化處理，可直接用于藥物及其I，Ⅱ相等極性較大代謝產(chǎn)物的同時(shí)分離、鑒定。運(yùn)用LC-MS技術(shù)不僅可避免復(fù)雜煩瑣的分離、純化代謝產(chǎn)物的工作，而且可分離鑒定難以辨識(shí)的體內(nèi)痕量代謝產(chǎn)物。第八頁，共三十六頁，編輯于2023年，星期五LC-MS聯(lián)用技術(shù)

四極質(zhì)譜儀（QMS）三重四極質(zhì)譜儀（TQMS）四極-線性離子阱質(zhì)譜儀（QTrap）四極-飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（Q-TOFMS）離子阱-飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（IT-TOFMS）代謝物鑒定中，常用的與LC聯(lián)用的質(zhì)譜儀器第九頁，共三十六頁，編輯于2023年，星期五LC-MS特點(diǎn)樣品前處理簡單，無需衍生化，適用范圍廣將色譜的高分離能力與質(zhì)譜的高檢測(cè)靈敏度、定性專屬性集于一身隨著接口裝置和離子化技術(shù)的發(fā)展成熟，該技術(shù)在體內(nèi)藥物分析中逐漸發(fā)展成為一種常規(guī)的分離檢測(cè)方法第十頁，共三十六頁，編輯于2023年，星期五實(shí)例大鼠尿中人參皂苷Rd及其代謝物的LC-MS研究第十一頁，共三十六頁，編輯于2023年，星期五LC-MS實(shí)例目的：探討人參皂苷Rd在大鼠體內(nèi)的代謝產(chǎn)物及轉(zhuǎn)化途徑。方法：選擇SD大鼠6只,單劑量口服和靜脈給予人參皂苷Rd,分段收集給藥前和給藥后0～24h尿樣,將尿樣分時(shí)段合并后采用旋轉(zhuǎn)薄膜蒸發(fā)濃縮,以固相萃取小柱純化處理,采用高效液相色譜-串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果：通過比較給藥前后的TOF總離子流圖,對(duì)尿中推測(cè)的代謝物和標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的出峰時(shí)間及相關(guān)化合物選擇離子掃描二級(jí)質(zhì)譜圖進(jìn)行了比較分析,結(jié)果在尿中發(fā)現(xiàn)了

7種代謝產(chǎn)物

,系統(tǒng)分析了這些代謝產(chǎn)物的代謝轉(zhuǎn)化規(guī)律及可能結(jié)構(gòu)。結(jié)論：大鼠尿中人參皂苷Rd的主要轉(zhuǎn)化途徑為氧化、水解、結(jié)合及異構(gòu)化代謝反應(yīng)。第十二頁，共三十六頁，編輯于2023年，星期五離子源(ESI)電壓:-4kV,去簇電勢(shì)(DP):-15V,聚焦電勢(shì)(FP):-80V,去簇電勢(shì)2(DP2):-15V,霧化氣(NEB):0135L·min-1簾氣(CUR):0120L·min-1負(fù)離子方式檢測(cè)采用TOF掃描一級(jí)質(zhì)譜掃描質(zhì)量范圍:400～1200選擇離子掃描二級(jí)質(zhì)譜進(jìn)行測(cè)定色譜柱流動(dòng)相其他質(zhì)譜條件色譜與質(zhì)譜條件為甲醇(A)-10mol·L-1乙酸銨(B)40min內(nèi)由體積比50∶50線性梯度升至90∶10,40～55min維持A∶B=90∶10,等度洗脫15min流速:018mL·min-1分流比為1∶60柱溫為25℃,進(jìn)樣量為20μLAgilentZorbaxSBC18(150mm×416mm,5μm)AgilentZorbaxSBC18(1215mm×211mm)預(yù)柱LC-MS實(shí)例第十三頁，共三十六頁，編輯于2023年，星期五LC-MS實(shí)例MetabolizationpathwayofG-Rd第十四頁，共三十六頁，編輯于2023年，星期五LC-MS實(shí)例FragmentpathwayofG-Rd第十五頁，共三十六頁，編輯于2023年，星期五LC-MS/MS聯(lián)用技術(shù)由于多數(shù)藥物的代謝物保留了原藥分子的骨架結(jié)構(gòu)，或一些亞結(jié)構(gòu)，因此，代謝物可能進(jìn)行與原藥相似的裂解，丟失一些相同的中性碎片或形成一些相同的特征離子，用MS/MS分別進(jìn)行中性丟失掃描、母離子掃描以及子離子掃描，即可迅速找到可能的代謝物，并鑒定出結(jié)構(gòu)。第十六頁，共三十六頁，編輯于2023年，星期五實(shí)例LC-MS/MS法快速高效檢測(cè)尿液中尼古丁及其9種代謝物第十七頁，共三十六頁，編輯于2023年，星期五LC-MS/MS實(shí)例

以氘代尼古丁、氘代可的寧、3-OH-氘代可的寧、氘代尼古丁葡萄糖醛酸復(fù)合物、氘代可的寧葡萄糖醛酸復(fù)合物、3-OH-氘代可的寧葡萄糖醛酸復(fù)合物作內(nèi)標(biāo),在LC-MS/MS的大氣壓化學(xué)電離(APCI)離子化模式下,建立了快速檢測(cè)吸煙者尿液中尼古丁及其9種代謝物的方法,并對(duì)19個(gè)實(shí)際樣品進(jìn)行了測(cè)試和判別分析(DA).實(shí)驗(yàn)前處理簡單,色譜運(yùn)行時(shí)間僅為3.8min.結(jié)果表明,尼古丁及其代謝物的精密度在0.5%～5.5%之間,回收率在94%～109%之間,線性相關(guān)系數(shù)均大于0.995.DA分析充分區(qū)別開了不同量的吸煙者,進(jìn)一步的相關(guān)性分析表明吸煙者24h尿液中的尼古丁及其9種代謝物含量與卷煙抽吸量的分析因子之間均有較強(qiáng)正相關(guān)性.第十八頁，共三十六頁，編輯于2023年，星期五質(zhì)譜檢測(cè)采用APCI源正離子化模式氣簾氣壓力設(shè)置為0.17MPa霧化氣0.55MPa碰撞氣0.04MPa離子源溫度為550℃離子化電流設(shè)為3μA各代謝物的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)參數(shù)見表色譜柱流動(dòng)相其他質(zhì)譜條件色譜與質(zhì)譜條件流動(dòng)相A為10mmol/L醋酸銨水溶液(pH6.8)流動(dòng)相B為10mmol/L醋酸銨的甲醇溶液流速0.5mL/min梯度洗脫條件:起始A為85%,到0.02min為5%保持至0.3min,0.32min變?yōu)?5%保持至2min結(jié)束柱溫為35℃為ShisheidoMGII柱(2.0mm×50mm,3μm)LC-MS/MS實(shí)例第十九頁，共三十六頁，編輯于2023年，星期五LC-MS/MS實(shí)例第二十頁，共三十六頁，編輯于2023年，星期五GC-MS聯(lián)用技術(shù)氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)是分析儀器中較早實(shí)現(xiàn)聯(lián)用技術(shù)的儀器。氣相色譜分離效率高、定量準(zhǔn)確，然而不足的是定性較為困難，及時(shí)未知樣品純度較高，鑒定結(jié)構(gòu)也不容易。質(zhì)譜具有靈敏度高、鑒別能力強(qiáng)、響應(yīng)速度快的優(yōu)點(diǎn)，但欠缺的是對(duì)復(fù)雜得多組分樣品的分離能力。雖然商品化的GC-MS聯(lián)用儀器出現(xiàn)較早，在藥物代謝研究中的應(yīng)用也較早，但GC法對(duì)樣品的極性和熱穩(wěn)定性有一定要求。因此，在GC-MS聯(lián)用技術(shù)分析前，樣品的預(yù)處理極為重要。其代謝物的熱穩(wěn)定性、揮發(fā)性、極性可能差異較大，需要根據(jù)具體情況對(duì)樣品先進(jìn)行水解處理或衍生化處理。第二十一頁，共三十六頁，編輯于2023年，星期五實(shí)例GC-MS/MS法測(cè)定人頭發(fā)中的大麻酚類及其代謝物第二十二頁，共三十六頁，編輯于2023年，星期五GC-MS/MS實(shí)例目的：建立同時(shí)檢測(cè)頭發(fā)中Δ9-四氫大麻酚（THC）、大麻酚（CBN）、大麻二酚（CBD）和Δ9-四氫大麻酸（THC-COOH）的分析方法。方法：頭發(fā)樣品加入氘代內(nèi)標(biāo)Δ9-四氫大麻酸（THC-COOH-d3），經(jīng)堿水解后，以混合溶劑[V（正己烷）∶V（乙酸乙酯＝9∶1]進(jìn)行提取，吹干，殘留物經(jīng)雙（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺（BSTFA）衍生化，用GC-MS/MS方法進(jìn)行分析。結(jié)果：頭發(fā)中THC-COOH、THC、CBN和CBD的最低檢出限分別為4、4、10和20pg·mg-1，各化合物在0.04～5ng·mg-1呈良好的線性關(guān)系（r＞0.999），方法精密度、準(zhǔn)確度均符合要求。結(jié)論：本方法選擇性強(qiáng)、靈敏度高，適用于頭發(fā)中CBD、CBN、THC及其代謝物THC-COOH的分析，并成功應(yīng)用于實(shí)際案例中。第二十三頁，共三十六頁，編輯于2023年，星期五質(zhì)譜檢測(cè)采用MRM模式，以一級(jí)質(zhì)譜分析結(jié)果為基礎(chǔ)，選擇各目標(biāo)物的分子離子，優(yōu)化碰撞能量CE），得到各目標(biāo)物和內(nèi)標(biāo)的二級(jí)質(zhì)譜圖。CBD、CBN、THC、THC-COOH

和THC-COOH-d3的MS/MS見表色譜柱柱溫其他質(zhì)譜條件色譜與質(zhì)譜條件程序升溫：100℃保持1.5min，以升溫速率25℃/min升溫至280℃保持5min分流比2∶1；載氣：氦氣進(jìn)樣口溫度：250℃檢測(cè)器溫度：250℃進(jìn)樣量：1μL。HP-1MS石英毛細(xì)管柱（30m×0.25mm×0.1μm）GC-MS/MS實(shí)例第二十四頁，共三十六頁，編輯于2023年，星期五GC-MS/MS實(shí)例第二十五頁，共三十六頁，編輯于2023年，星期五LC-NMR聯(lián)用技術(shù)近年來，LC-MS雖然得到普及推廣，但MS本身不能提供足夠的分子結(jié)構(gòu)信息，因此在實(shí)際使用LC-MS鑒定藥物代謝物結(jié)構(gòu)時(shí)，往往需要借助核磁共振（NMR）的數(shù)據(jù)，才能順利完成工作。目前，在儀器分析領(lǐng)域中NMR能夠提供最大量的分子結(jié)構(gòu)信息，但該法要求樣品為純品，即在做NMR分析前必須做大量的分離、純化工作，這不利于樣品的快速分析。如果在核磁共振儀器前配置一套色譜分離設(shè)備，使樣品被LC分離后，直接進(jìn)入NMR中進(jìn)行掃描測(cè)定，就可以大大簡化分析程序，提高樣品分析速度。因此，將高分離能力的色譜與能提供最豐富結(jié)構(gòu)信息的NMR在線聯(lián)用是非常有意義的。第二十六頁，共三十六頁，編輯于2023年，星期五LC-NMR聯(lián)用技術(shù)但HPLC和NMR的聯(lián)用并不是兩種技術(shù)的簡單組合：NMR的檢測(cè)靈敏度明顯低于常規(guī)的HPLC的檢測(cè)器，且作為HPLC流動(dòng)相的混合溶劑往往產(chǎn)生多重強(qiáng)溶劑峰而影響溶質(zhì)峰的正確而檢測(cè)。由于技術(shù)上的原因，如NMR靈敏度低、液相色譜使用的氘代溶劑十分昂貴，溶劑信號(hào)對(duì)樣品的干擾等等使該聯(lián)用技術(shù)受到限制。近年來LC/NMR聯(lián)用技術(shù)在研究藥物代謝產(chǎn)物,特別是Ⅱ相代謝產(chǎn)物方面表現(xiàn)出了非常誘人的前景,有關(guān)研究報(bào)告相繼發(fā)表。第二十七頁，共三十六頁，編輯于2023年，星期五LC-NMR實(shí)例布洛芬在人體內(nèi)代謝物的研究便是一個(gè)很好的例子,健康男性注射400mg布洛芬后,收集0～4小時(shí)的尿液,經(jīng)HPLC/NMR聯(lián)用技術(shù)分析,圖譜中清晰地顯示出5個(gè)代謝產(chǎn)物:2-羥基布洛芬葡萄糖醛酸、2-羧基布洛芬葡萄糖醛酸、2-羥基布洛芬、2-羧基布洛芬和布洛芬葡萄糖醛酸。采用停止流動(dòng)模式技術(shù)可以得到純的2-羥基布洛芬的1H-NMR圖譜。第二十八頁，共三十六頁，編輯于2023年，星期五二、放射性示蹤第二十九頁，共三十六頁，編輯于2023年，星期五放射性同位素示蹤技術(shù)是利用放射性核素及其標(biāo)記物作為示蹤劑來研究生物體內(nèi)各種物質(zhì)吸收、分布、代謝、排泄(ADME)規(guī)律的一門科學(xué)。第三十頁，共三十六頁，編輯于2023年，星期五放射性示蹤原理把用放射性核素標(biāo)記的物質(zhì)A引入動(dòng)物體，經(jīng)過一段時(shí)間，從排出物或組織中分離出另一化合物B，含有相當(dāng)數(shù)量的上述標(biāo)記核素，即可確定A在動(dòng)物體內(nèi)可以轉(zhuǎn)變?yōu)锽.第三十一頁，共三十六頁，編輯于2023年，星期五與被示蹤的物質(zhì)有同一性，即放射性核素與其同種元素的非放射性核素在化學(xué)和生物學(xué)行為上具有高度一致性，不致擾亂和破壞體內(nèi)外生理過程的平衡狀態(tài)放射性示蹤一與被示蹤的物質(zhì)有可區(qū)別性，放射性核素的原子核不斷衰減，發(fā)出能被放射性探測(cè)儀所探測(cè)的射線，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)標(biāo)記物的定量及定位。二放射性同位素得以廣泛應(yīng)用于活性物質(zhì)示蹤主要依賴于其最重要的兩個(gè)特點(diǎn)第三十二頁，共三十六頁，編輯于2023年，星期五放射性示蹤靈敏度高專屬性強(qiáng)適用性廣檢測(cè)方法簡便在藥物ADME研究中得到了廣泛的應(yīng)用。放射性同位素示蹤技術(shù)在藥物ADME研究中發(fā)揮著十分重要的作用，美國FDA已將放射性同位素標(biāo)記藥物給藥后的藥動(dòng)學(xué)數(shù)據(jù)作為新藥安全性評(píng)價(jià)的重要依據(jù)，并制定了相關(guān)指南第三十三頁，共三十六頁，編輯于2023年，星期五放射性同位素示蹤劑的選擇在藥物A