基因制藥基因工程制藥

基因制藥基因工程制藥第一頁，共二十八頁，編輯于2023年，星期五第一節(jié)概述第二節(jié)基因藥物生產(chǎn)的基本過程第三節(jié)目的基因的獲得第四節(jié)基因表達(dá)第五節(jié)基因工程菌的穩(wěn)定性第六節(jié)基因工程菌發(fā)酵第七節(jié)基因工程藥物的分離純化第八節(jié)基因工程藥物的質(zhì)量控制第二章基因工程制藥第二頁，共二十八頁，編輯于2023年，星期五第一節(jié)概述生物技術(shù)的核心就是基因工程，基因工程技術(shù)最成功的應(yīng)用就是用于生物治療的新型生物藥物的研制。傳統(tǒng)生物藥物由于來源及制備上的困難、價格等因素的影響，此外在制備過程可能受到的病毒、衣原體、支原體等的感染等問題，促使人們尋求安全、實用、療效可靠的新方法來制備生物藥物。第三頁，共二十八頁，編輯于2023年，星期五基因工程正在逐漸顯示其在生物技術(shù)藥物制備上的優(yōu)勢。應(yīng)用基因工程技術(shù)可十分方便且有效地解決上述提到的問題，從質(zhì)和量上都可以得到改進(jìn)，而且可以創(chuàng)造全新物質(zhì)。如今，癌癥、病毒性疾病、心血管疾病以及內(nèi)分泌等方面的預(yù)防、治療和診斷已可通過基因工程技術(shù)獲得。第四頁，共二十八頁，編輯于2023年，星期五利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)藥品的優(yōu)點：（1）可以大量生產(chǎn)過去難以獲得的生理活性蛋白和多肽（如胰島素、干擾素、細(xì)胞因子等），為臨床使用提供有效的保障；（2）可以提供足夠數(shù)量的生理活性物質(zhì)，以便對其生理、生化和結(jié)構(gòu)進(jìn)行深入的研究，從而擴(kuò)大這些物質(zhì)的應(yīng)用范圍；（3）利用基因工程技術(shù)可以發(fā)現(xiàn)、挖掘更多的內(nèi)源性生理活性物質(zhì)；第五頁，共二十八頁，編輯于2023年，星期五（4）內(nèi)源性生理活性物質(zhì)在作為藥物使用時存在的不足之處，可通過基因工程和蛋白質(zhì)工程進(jìn)行改造和去除。如白細(xì)胞介素-2的第125位半胱氨酸是游離的，有可能引起-S-S-鍵的錯配而導(dǎo)致活性下降，如將此半胱氨酸改為絲氨酸或丙氨酸，白細(xì)胞介素-2的活性以及熱穩(wěn)定性均有提高；（5）利用基因工程技術(shù)可獲得新型化合物，擴(kuò)大藥物篩選來源?；蚬こ碳夹g(shù)可將不同種類和用途的基因，在原核細(xì)胞中表達(dá)的特性使其不僅在醫(yī)藥，而且在很多行業(yè)中都會有重要的應(yīng)用。第六頁，共二十八頁，編輯于2023年，星期五第二節(jié)基因工程藥物生產(chǎn)的基本過程基因工程技術(shù)就是將重組對象的目的基因插入載體，拼接后轉(zhuǎn)入新的宿主細(xì)胞，構(gòu)建工程菌（或細(xì)胞），實現(xiàn)遺傳物質(zhì)的重新組合，并使目的基因在工程菌內(nèi)進(jìn)行復(fù)制和表達(dá)的技術(shù)?；蚬こ趟幬镏圃斓闹饕绦蚴牵耗康幕虻目寺?，構(gòu)建DNA重組體，將DNA重組體轉(zhuǎn)入宿主菌構(gòu)建工程菌，工程菌的發(fā)酵，外源基因表達(dá)產(chǎn)物的分離純化，產(chǎn)品的檢驗等。以上程序中的每個階段都包含若干細(xì)致的步驟，這些程序和步驟將會隨研究和生產(chǎn)條件的不同而改變。第七頁，共二十八頁，編輯于2023年，星期五DNA重組技術(shù)第八頁，共二十八頁，編輯于2023年，星期五基因工程藥物生產(chǎn)的上游和下游上游：主要指的是目的基因分離、工程菌（或細(xì)胞）構(gòu)建。上游階段的工作主要在實驗室內(nèi)完成；（DNA重組技術(shù)）下游：主要指的是從工程菌（或細(xì)胞）的大規(guī)模培養(yǎng)一直到產(chǎn)品的分離純化、質(zhì)量控制等。第九頁，共二十八頁，編輯于2023年，星期五工程菌（或細(xì)胞）構(gòu)建中重要的工具該過程中重要的工具便是酶：限制性內(nèi)切酶和連接酶是將所需目的基因插入適當(dāng)?shù)妮d體質(zhì)?；蚴删w中并轉(zhuǎn)入E.coli

或其它宿主菌（細(xì)胞）大量復(fù)制目的基因過程中的重要工具。同時為保證目的基因的正確性，對目的基因要進(jìn)行限制性內(nèi)切酶和核苷酸序列分析?；虮磉_(dá)系統(tǒng)就是上述的工程菌或細(xì)胞，有原核生物和真核生物兩類表達(dá)系統(tǒng)；選擇基因表達(dá)的系統(tǒng)主要考慮的是保證表達(dá)蛋白質(zhì)的功能，其次要考慮的是表達(dá)量的多少和分離純化的難易。第十頁，共二十八頁，編輯于2023年，星期五Cuttingbyenzymes第十一頁，共二十八頁，編輯于2023年，星期五下游階段在產(chǎn)業(yè)化中是極其重要的下游階段是將實驗室成果產(chǎn)業(yè)化、商品化，主要包括工程菌大規(guī)模發(fā)酵最佳參數(shù)的確立，新型生物反應(yīng)器的研制，高效分離介質(zhì)及裝置的開發(fā)，分離純化的優(yōu)化控制，高純度產(chǎn)品的制備技術(shù)，生物傳感器等一系列儀器儀表的設(shè)計和制造，電子計算機(jī)的優(yōu)化控制等。工程菌的發(fā)酵工藝不同于傳統(tǒng)的抗生素和氨基酸發(fā)酵，需要對影響目的基因表達(dá)的因素進(jìn)行分析，對各種影響因素進(jìn)行優(yōu)化，建立適于目的基因高效表達(dá)的發(fā)酵工藝，同時建立一系列相應(yīng)的分離純化、質(zhì)量控制、產(chǎn)品保存等技術(shù)。第十二頁，共二十八頁，編輯于2023年，星期五第三節(jié)目的基因的獲得對于目的基因的獲得需要根據(jù)目的基因的來源采取適當(dāng)?shù)姆椒?。對于真核?xì)胞來源的目的基因，是不能直接進(jìn)行分離的。真核細(xì)胞中單拷貝基因僅是染色體DNA中的很小一部分，即使多拷貝基因也是極少的，因此從染色體中分離純化目的基因是很困難的。另外，原核表達(dá)系統(tǒng)是有局限性的，主要是由于真核基因的內(nèi)含子及基因的后翻譯過程，所以真核系統(tǒng)得到了相應(yīng)發(fā)展。第十三頁，共二十八頁，編輯于2023年，星期五克隆真核基因常用的方法逆轉(zhuǎn)錄：逆轉(zhuǎn)錄酶催化的反應(yīng)，即以RNA為模板合成DNA的過程稱為逆轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄病毒：需在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下首先將RNA轉(zhuǎn)變?yōu)閏DNA，再在DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯等蛋白酶作用下擴(kuò)增的一類病毒。一、逆轉(zhuǎn)錄法第十四頁，共二十八頁，編輯于2023年，星期五逆轉(zhuǎn)錄酶及其催化特性RNA3’5’依賴于RNA的DNA聚合酶RNA3’5’核糖核酸酶H5’3’5’3’cDNA依賴DNA的DNA聚合酶cDNA雜種分子3’5’5’3’雙鏈DNA新合成的雙鏈DNA整合到寄主染色體DNA中第十五頁，共二十八頁，編輯于2023年，星期五16逆轉(zhuǎn)錄過程第十六頁，共二十八頁，編輯于2023年，星期五一、逆轉(zhuǎn)錄法1、mRNA的純化2、cDNA第一鏈的合成3、cDNA第二鏈的合成4、cDNA克隆5、將重組體導(dǎo)入宿主細(xì)胞6、cDNA文庫的鑒定7、目的cDNA克隆的分離和鑒定第十七頁，共二十八頁，編輯于2023年，星期五18cDNA文庫第十八頁，共二十八頁，編輯于2023年，星期五1、mRNA的純化分離純化目的基因的mRNA極其困難

種類多；總RNA總量少（2%~5%）；相對分子質(zhì)量大小很不一致，由幾百到幾千個核苷酸組成。在真核細(xì)胞中mRNA的3‘末端常常含有一多聚腺苷酸polyA組成的末端，長達(dá)20~250個腺苷酸，可采用OligodT-纖維素，以親和層析法將mRNA從細(xì)胞總RNA中分離出來。洗脫方法是高濃度鹽溶液使mRNA特異結(jié)合于寡聚dT，再以低鹽溶液和蒸餾水將其洗脫，經(jīng)過兩次寡聚dT，可得到較純的mRNA。第十九頁，共二十八頁，編輯于2023年，星期五2、cDNA第一鏈的合成一般mRNA都帶有3’-polyA，所以可用寡聚dT作為引物，在逆轉(zhuǎn)錄酶的催化下，開始cDNA鏈的合成。在合成反應(yīng)體系中加入一種放射性標(biāo)記的dNTP，在反應(yīng)中以及反應(yīng)后可通過測定放射性標(biāo)記的dNTP摻入量，計算出cDNA的合成效率；在凝膠電泳后，進(jìn)行放射自顯影分析產(chǎn)物的分子大小，探索最佳反應(yīng)條件。一次好的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)可使寡聚dT選出的mRNA有5%~30%被拷貝。第二十頁，共二十八頁，編輯于2023年，星期五RT-PCR反轉(zhuǎn)錄PCRmRNA---cDNA-----PCR第二十一頁，共二十八頁，編輯于2023年，星期五3、cDNA第二鏈的合成先用堿解或RNaseH酶解的方法除去cDNA-mRNA雜交鏈中的mRNA鏈，然后以cDNA第一鏈為模板合成第二鏈。由于第一鏈cDNA鏈3‘末端往往形成一個發(fā)夾形結(jié)構(gòu)，所以，可以從這一點開始合成cDNA第二鏈。此反應(yīng)是在DNA聚合酶I催化下完成的。核酸酶S1專一性切除單鏈DNA，因此用它可以切除發(fā)夾結(jié)構(gòu)。發(fā)夾結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)切除后，雙鏈cDNA分子的大小常用變性瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行測定。第二十二頁，共二十八頁，編輯于2023年，星期五4、cDNA克隆用于cDNA克隆的載體有兩類：質(zhì)粒DNA（如pUC、pBR322等）和噬菌體DNA（如gt10、gt11等）。根據(jù)重組后插入的cDNA是否能夠表達(dá)、能否經(jīng)轉(zhuǎn)錄和翻譯合成蛋白質(zhì)，又將載體分為表達(dá)型和非表達(dá)型載體。pUC及gt11為表達(dá)型載體，在cDNA插入位置的上游具有啟動基因順序；而pBR322及gt10為非表達(dá)型載體。在cDNA克隆操作中應(yīng)該根據(jù)不同的需要選擇適當(dāng)?shù)妮d體。cDNA插入片段小于10kb，可選質(zhì)粒載體，如大于10kb則應(yīng)選用噬菌體DNA為載體。選用表達(dá)型載體可以增加目的基因的篩選方法，有利于目的基因的篩選。第二十三頁，共二十八頁，編輯于2023年，星期五cDNA片段與載體的連接方法一：加同聚尾連接，用3’末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶催化，使載體與cDNA的3’末端帶上互補的同型多聚體序列，如載體加上polyC（或A）的尾巴，則cDNA加上polyG（或T）的尾巴，這兩種粘性末端只能使載體與cDNA連接而不能自我環(huán)化，借助同型多聚體的退火作用形成重組分子，最后用T4DNA連接酶封口。第二十四頁，共二十八頁，編輯于2023年，星期五cDNA片段與載體的連接方法二：加人工接頭連接，用T4DNA連接酶在平末端接上人工接頭可以使DNA發(fā)生連接。所謂人工接頭是指人工合成的、連接在目的基因兩端的含有某些限制酶切位點的寡核苷酸片段。cDNA連上人工接頭后，用該限制酶酶切就可得到粘性末端，從而能夠與載體連接；cDNA中也可能帶有同樣的限制酶切點，為了保護(hù)cDNA不受限制酶破壞，可在加接頭前用甲基化酶修飾這些限制酶切位點。第二十五頁，共二十八頁，編輯于2023年，星期五5、將重組體導(dǎo)入宿主細(xì)胞體外包裝的噬菌體，感染感受態(tài)大腸桿菌形成噬菌斑；或轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌使質(zhì)粒進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。6、cDNA文庫的鑒定根據(jù)重組體的表型進(jìn)行篩選，主要有抗性基因失活法和菌落或噬菌斑顏色改變法。然后采用凝膠電泳、分子雜交、DNA序列分析測定等方法進(jìn)行進(jìn)一步篩選和鑒定。第二十六頁，共二十八頁，編輯于2023年，星期五7、目的cDNA克隆的分離和鑒定從cDNA文庫中分離特異的cDNA克隆，主要采用：（1）核酸探針雜交法。用層析和高分辨電泳等技術(shù)純化微克量的目的蛋白質(zhì)，根據(jù)目的蛋白質(zhì)純品的氨基酸序列分析結(jié)果，人工合成相應(yīng)的單鏈寡核苷酸作為探針，從cDNA文庫中分離特異cDNA克隆。（2）免疫反應(yīng)鑒定法。在既無可供選擇的基因表型特征，又無合適探針的情況下，本法是重要途徑。用表達(dá)型載體構(gòu)建