第四章核酸序列分析

SchoolofLaboratoryMedicine,WenzhouMedicalCollege1第四章

DNA序列測定

SchoolofLaboratoryMedicine,WenzhouMedicalCollege2核酸序列分析是分子生物學(xué)基本技術(shù)之一。測定并分析核酸的序列，是研究其結(jié)構(gòu)、功能及其相互關(guān)系的前提，是分子生物學(xué)最基本的課題，并為臨床疾病的分子診斷提供最為精確的判定依據(jù)。SchoolofLaboratoryMedicine,WenzhouMedicalCollege3本章內(nèi)容1、第一代DNA測序技術(shù)2、第二代測序技術(shù)3、第三代測序技術(shù)的發(fā)展趨勢第一節(jié)第一代DNA測序技術(shù)SchoolofLaboratoryMedicine,WenzhouMedicalCollege4SchoolofLaboratoryMedicine,WenzhouMedicalCollege5一、雙脫氧鏈終止法測序原理1、進(jìn)行測序反應(yīng)SchoolofLaboratoryMedicine,WenzhouMedicalCollege6測序原理圖1DNA合成原理圖SchoolofLaboratoryMedicine,WenzhouMedicalCollege7DNA聚合酶催化的DNA鏈延伸是在3’-OH末端上進(jìn)行的。由于2’，3’-雙脫氧三磷酸核苷酸（ddNTP）的3’-位脫氧而失去游離-OH，當(dāng)它摻入到DNA鏈后，3’-OH末端消失，使DNA鏈的延伸終止。HHSchoolofLaboratoryMedicine,WenzhouMedicalCollege8利用DNA聚合酶，以單鏈DNA為模板，以4種dNTP為底物，在四組互相獨(dú)立的反應(yīng)體系中分別加入不同的雙脫氧核苷三磷酸（ddNTP）作為鏈反應(yīng)終止劑，根據(jù)堿基配對原則，在測序引物引導(dǎo)下，合成四組有序列梯度的互補(bǔ)DNA鏈，然后通過高分辨率的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，放射自顯影檢測后直接識讀待測DNA的序列。SchoolofLaboratoryMedicine,WenzhouMedicalCollege9圖2雙脫氧鏈末端終止法測序原理1分子診斷學(xué)（第2版）SchoolofLaboratoryMedicine,WenzhouMedicalCollege10圖3雙脫氧鏈末端終止法測序原理2分子診斷學(xué)（第2版）SchoolofLaboratoryMedicine,WenzhouMedicalCollege113、測序反應(yīng)體系待測模板（單鏈DNA或雙鏈DNA）

測序引物DNA聚合酶（Klenow片段、測序酶、TaqDNA聚合酶）dNTP和ddNTP熒光染料（最初放射性核素）標(biāo)記熒光標(biāo)記方案：引物、終止物、內(nèi)部標(biāo)記2、熒光染料SchoolofLaboratoryMedicine,WenzhouMedicalCollege12方法特點(diǎn)該法測定的序列是酶促反應(yīng)生成的產(chǎn)物，其準(zhǔn)確性可能受堿基錯(cuò)誤摻入的影響，并且難以分析有堿基修飾和存在二級結(jié)構(gòu)的DNA樣品。一次反應(yīng)可測500個(gè)以上的堿基序列；具有方法簡便快速，便于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化分析，能夠滿足絕大多數(shù)DNA樣品序列分析的需要等特點(diǎn)，在DNA序列分析中得到最廣泛的應(yīng)用。SchoolofLaboratoryMedicine,WenzhouMedicalCollege13四、自動(dòng)化測序以全自動(dòng)化操作系統(tǒng)代替?zhèn)鹘y(tǒng)的手工操作，以熒光染料標(biāo)記代替?zhèn)鹘y(tǒng)的放射性核素標(biāo)記，以PCR循環(huán)測序反應(yīng)為主導(dǎo)方法代替?zhèn)鹘y(tǒng)的酶反應(yīng)方法，以集束化的毛細(xì)管電泳代替?zhèn)鹘y(tǒng)的凝膠電泳，以高速自動(dòng)化的序列分析系統(tǒng)代替?zhèn)鹘y(tǒng)的人工識讀等。具有簡單、安全、精確、并行和高效等特點(diǎn)。四、自動(dòng)DNA測序儀主要構(gòu)成：測序反應(yīng)系統(tǒng)，電泳系統(tǒng)，熒光檢測系統(tǒng)，電腦分析系統(tǒng)種類：單染料/四泳道，四染料/單泳道工作原理：一個(gè)DNA樣品四組測序反應(yīng)（四種熒光染料）、電泳、收集熒光信號、轉(zhuǎn)換成堿基序列信息、繪制測序圖（藍(lán)綠橙紅四色）SchoolofLaboratoryMedicine,WenzhouMedicalCollege14SchoolofLaboratoryMedicine,WenzhouMedicalCollege15自動(dòng)化測序系統(tǒng)基于單一熒光染料標(biāo)記的自動(dòng)化測序系統(tǒng)基于多種熒光染料標(biāo)記的自動(dòng)化測序系統(tǒng)SchoolofLaboratoryMedicine,WenzhouMedicalCollege16基于單一熒光染料標(biāo)記的自動(dòng)化測序系統(tǒng)SchoolofLaboratoryMedicine,WenzhouMedicalCollege17基于多種熒光染料標(biāo)記的自動(dòng)化測序系統(tǒng)五、測序策略SchoolofLaboratoryMedicine,WenzhouMedicalCollege18第二節(jié)第二代DNA測序技術(shù)SchoolofLaboratoryMedicine,WenzhouMedicalCollege19第一代測序技術(shù)的局限性：對電泳分離技術(shù)的依賴第二代測序:使用接頭進(jìn)行高通量的并行PCR和并行測序反應(yīng)，結(jié)合微流體技術(shù)，利用高性能的計(jì)算機(jī)對大規(guī)模的測序數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接和分析。SchoolofLaboratoryMedicine,WenzhouMedicalCollege20公司名稱技術(shù)原理技術(shù)開發(fā)者商業(yè)模式第二代ApplyBiosystems(ABI)基于磁珠的大規(guī)模并行克隆連接DNA測序法美國Agencourt私人基因組學(xué)公司（APG）上市公司：銷售設(shè)備和試劑獲取利潤Illumina邊合成邊測序法英國Solexa公司首席科學(xué)家DavidBentley上市公司：銷售設(shè)備和試劑獲取利潤Roche大規(guī)模并行焦磷酸合成測序法美國454LifeSciences公司的創(chuàng)始人JonathanRothberg上市公司：銷售設(shè)備和試劑獲取利潤，該產(chǎn)品已經(jīng)于2013年停產(chǎn)。第三代Helicos大規(guī)模并行單分子合成測序法美國斯坦福大學(xué)生物工程學(xué)家StephenQuake上市公司：2007年5月首次公開募股（IPO）（P.S.由于該平臺準(zhǔn)確率太低等原因，該公司已于2012年宣告破產(chǎn)）CompleteGenomicsDNA納米陣列與組合探針錨定連接測序法美國CompleteGenomics公司首席科學(xué)家radojedrmanac私人公司：投資額為4650萬美元，該公司于2013年被華大基因收購。SchoolofLaboratoryMedicine,WenzhouMedicalCollege21序平臺的代表。（見表一）表一：主流測序平臺一覽[2]SchoolofLaboratoryMedicine,WenzhouMedicalCollege22焦磷酸測序技術(shù)測序引物與單鏈DNA模板退火后，通過DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、熒光素酶和三磷酸腺苷雙磷酸酶等四種酶的級聯(lián)反應(yīng)，將每一個(gè)dNTP的摻入與一次熒光信號的釋放偶聯(lián)起來，以熒光信號的形式實(shí)時(shí)記錄DNA模板的核苷酸序列。SchoolofLaboratoryMedicine,WenzhouMedicalCollege23分子診斷學(xué)（第2版）圖5焦磷酸測序技術(shù)原理第三節(jié)第三代測序技術(shù)的發(fā)展趨勢SchoolofLaboratoryMedicine,WenzhouMedicalCollege24SchoolofLaboratoryMedicine,WenzhouMedicalCollege25公司名稱技術(shù)原理技術(shù)開發(fā)者商業(yè)模式第二代ApplyBiosystems(ABI)基于磁珠的大規(guī)模并行克隆連接DNA測序法美國Agencourt私人基因組學(xué)公司（APG）上市公司：銷售設(shè)備和試劑獲取利潤Illumina邊合成邊測序法英國Solexa公司首席科學(xué)家DavidBentley上市公司：銷售設(shè)備和試劑獲取利潤Roche大規(guī)模并行焦磷酸合成測序法美國454LifeSciences公司的創(chuàng)始人JonathanRothberg上市公司：銷售設(shè)備和試劑獲取利潤，該產(chǎn)品已經(jīng)于2013年停產(chǎn)。第三代Helicos大規(guī)模并行單分子合成測序法美國斯坦福大學(xué)生物工程學(xué)家StephenQuake上市公司：2007年5月首次公開募股（IPO）（P.S.由于該平臺準(zhǔn)確率太低等原因，該公司已于2012年宣告破產(chǎn)）CompleteGenomicsDNA納米陣列與組合探針錨定連接測序法美國CompleteGenomics公司首席科學(xué)家radojedrmanac私人公司：投資額為4650萬美元，該公司于2013年被華大基因收購。SchoolofLaboratoryMedicine,WenzhouMedicalCollege26單分子測序技術(shù)將單鏈DNA片段所有堿基均進(jìn)行標(biāo)記，A、T、C、G分別標(biāo)上不同的熒光基團(tuán)，標(biāo)記好的單鏈DNA分子吸附在微球體上并置于液流系統(tǒng)中，然后用