SNP分型技術(shù)課件

SNP分型技術(shù)簡介SNP分型技術(shù)SNP概念單核苷酸多態(tài)性(singlenucleotidepolymorphism，SNP),主要是指在基因組水平上由單個核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性。SNP在人類基因組中廣泛存在，平均每500～1000個堿基對中就有1個，估計其總數(shù)可達300萬個甚至更多。

包括單個堿基的轉(zhuǎn)換、顛換、插入和缺失等轉(zhuǎn)換：同型堿基之間A-G腺嘌呤-鳥嘌呤T-C胸腺嘧啶-胞嘧啶顛換：嘌呤與嘧啶之間A-T、A-C、C-G、G-T插入的圖片人體許多表型差異、對藥物或疾病的易感性等等都可能與SNP有關(guān)。心臟病、癌癥、糖尿病、精神病等復(fù)雜性疾病是遺傳和環(huán)境綜合作用的結(jié)果。目前，發(fā)現(xiàn)這些多基因疾病微效基因最有力的方法是對病例組和對照組等位基因頻率進行統(tǒng)計學(xué)比較，SNP是這種分析很好的一種標記。SNP分型技術(shù)4其他檢測方法質(zhì)譜分析SNaPshotLDR2基于熒光定量PCR的檢測方法TaqMan探針法HRM3直接測序法1基于電泳的檢測方法PCR-RFLPPCR-SSCPAS-PCRPCR-RFLP由于堿基的變異可能導(dǎo)致酶切點的消失或新的切點出現(xiàn)，從而引起不同個體在用同一限制酶切時，DNA片段長度出現(xiàn)差異，這種因內(nèi)切酶切點變化所導(dǎo)致的DNA片段長度的差異，稱限制性片段長度多態(tài)性（restrictionfragmentlengthpolymporphism,RFLP）。該技術(shù)應(yīng)用的前提是SNP的位點必須含有該限制內(nèi)切酶的識別位點，它是SNP篩查中最經(jīng)典的方法之一。PCR-RFLP原理：利用限制性內(nèi)切酶的酶切位點的特異性，用限制性內(nèi)切酶作用于同一DNA片斷，如果存在SNP位點，酶切片斷的長度和數(shù)量則會出現(xiàn)差異，根據(jù)電泳的結(jié)果就可以判斷是否SNP位點。PCR擴增目的片段限制性內(nèi)切酶酶切目的片段電泳分離rs1800629PCR-RFLP分析rs1800629RFLP結(jié)果單鏈構(gòu)象多態(tài)性法PCR-SSCP原理：單鏈DNA在中性條件下會形成二級結(jié)構(gòu)，不同的二級結(jié)構(gòu)在電泳中會出現(xiàn)不同的遷移率。這種二級結(jié)構(gòu)依賴于堿基的組成，單個堿基的改變也會影響其構(gòu)象，最終會導(dǎo)致在凝膠上遷移速度的改變。經(jīng)PCR擴增的目的片段在單鏈狀態(tài)下，因其單個堿基差異，所形成的空間構(gòu)象不同，其在非變性聚丙稀酰胺凝膠中泳動速度不一樣，從而顯示出帶型的差異，即多態(tài)型保持在單鏈狀態(tài)非變性凝膠電泳構(gòu)象不同呈現(xiàn)多態(tài)性單鏈構(gòu)象多態(tài)性法PCR-SSCP單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)分析1～4、7～9：野生型基因片段；5、6：兩例Val384Asp攜帶者的樣本，顯示變異的SSCP帶型

等位基因特異PCR(AS-PCR)原理：根據(jù)SNP位點設(shè)計特異性引物。其中特異鏈的3′末端與SNP位點的堿基互補(或相同)，另一條普通鏈按常規(guī)方法進行設(shè)計。因為特異引物在一種基因型中有擴增產(chǎn)物，在另一種基因型中沒有擴增產(chǎn)物，用凝膠電泳就能夠很容易地分辨出擴增產(chǎn)物的有無，從而確定基因型。等位基因特異PCR(AS-PCR)TaqMan技術(shù)原理：TaqMan

熒光探針是一種寡核苷酸探針，報告基團在探針的5’末端，淬滅基團在3’末端。PCR擴增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針。PCR擴增時，探針酶切降解，報告基團和淬滅基團分離，發(fā)出熒光信號。每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。如果探針與目標序列中存在錯配堿基，就會影響其釋放熒光的強度，可以通過檢測反應(yīng)液中的熒光強度確定基因型TaqMan技術(shù)HRMHRM的主要原理是根據(jù)DNA序列的長度、GC含量以及堿基互補性差異，應(yīng)用高分辨率熔解曲線對樣品進行分析，其極高的溫度均一性和溫度分辨率使分辨精度可以達到對單個堿基差異的區(qū)分。1、核酸提取與均一化2、PCR設(shè)計與優(yōu)化（引物、條件）3、qRT-PCR4、SampleMelt(結(jié)果檢查，HRM數(shù)據(jù)收集)5、數(shù)據(jù)分析TheHRMAnalysisWorkflowHRM圖750%-95%AA模板熔解曲線圖

圖65%