植株生理生長指標(biāo)測定

根活的定TTC法植株根系是活躍的吸收器官和合成器官的生長情況和活力水平直接影響地上部分的生長營養(yǎng)狀況及產(chǎn)量水平。一、原理氯化三苯基四氮唑（）標(biāo)準(zhǔn)氧化電位為80mV的氧化還原色素，溶于水中成為無色溶液，但還原后即生成紅色而不溶于水的三苯甲腙的三苯甲腙比較穩(wěn)定被氣中的氧自動氧，所以被泛地用作酶實驗氫受體，植物根系中脫氫酶所引起的TTC還，可因加入琥珀酸，延胡索酸，蘋果酸得到增強，而被丙二酸、碘乙酸所抑制。所以TTC還量能表示脫氫酶活性并作為根系活力的指標(biāo)。二、材料、設(shè)備儀器及試劑（一）材料水培或砂培小麥、玉M植物根系。（二）儀器設(shè)備分光度計分天平（感量電頂載天平（感量4.溫；研缽；三瓶50ml；7.漏8.量100ml吸量管10.刻試管10ml；試架12.容量瓶；13.藥；14.石英砂適量15.燒10ml、。（三）試劑、乙酸乙酯（分析純、次硫酸鈉NaS析，粉末。22、1％溶液：準(zhǔn)確稱取，溶于少量水中。定容到。、0.4％溶：準(zhǔn)確稱取TTC，溶于少量水中。定容到。、磷酸緩沖液（1/15mol/L、1mol/L硫：用量筒取比重的硫酸，邊攪拌邊加入盛有蒸水的燒杯中，冷卻后稀釋至。、0.4mol/L琥酸稱取琥珀酸4.72g溶于水中，定容至即。三、實驗步驟、定性測定18

（1配制反應(yīng)液：把溶液、0.4mol/L的珀酸和磷酸緩沖液按比混合。（2把根仔細(xì)洗凈，把地上部分從莖基切除。將根放入三角瓶中，倒入反應(yīng)液，以浸沒根為度，置℃左右暗處放1~3h，以觀察著色情況，新根尖端幾毫M及細(xì)側(cè)根都明顯地變成紅色，表明該處有脫氫酶存在。、定量測定（1TTC標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作取0.4TTC溶液0.2ml放10ml量瓶中，加少許NaO粉勻后立即產(chǎn)生紅色的甲腙。再用224乙酸乙酯定容至刻度，搖勻。然后分別取此液00.50ml1.00ml1.50ml2.00ml置容瓶中，用乙酸乙酯定容至刻度，即得到含甲腙25g、50μg、μg、μ、200g的準(zhǔn)比色系列，以空白作參比，在485nm波長下測定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。（2稱取根尖樣品，放入燒中，加入％TTC溶和磷酸緩沖液的等量混合液，把根充分浸沒在溶液內(nèi)，在37℃下暗保溫～，此后加入1mol/L硫2ml，以停止反應(yīng)（與同時一白驗先硫，加樣，他作上（3把根取出，吸干水分后與乙酸乙酯～和量石英砂一起在研缽內(nèi)磨碎，以提出月替。紅色提取液移入試管，并用少量乙酸乙酯把殘渣洗滌二、三次，皆移入試管，最后加乙酸乙酯使量為10ml，用分光光度計在波長485nm下色，以空白實驗作參比測出吸光度，查標(biāo)準(zhǔn)曲線，即可求出四氮唑還原量。四、結(jié)果計算單位質(zhì)量鮮根的四氮唑還原強度C—標(biāo)準(zhǔn)曲線查出的四氮唑還原量（mgW樣品質(zhì)量t—應(yīng)時間h植體硝還酶力測硝酸還原酶植物氮素同化的關(guān)鍵酶，它催化植物內(nèi)的硝酸鹽還原為亞硝酸鹽NO+NADH+HNOO生亞硝酸鹽與對–氨基苯磺酸（或?qū)ΘC氨基32苯磺酰胺）及α-萘胺（或萘基乙烯二胺）酸性條件下定量生成紅色偶氮化合物。生成的紅色偶氮化合物在540nm最大吸收峰，可用分光光度法測定。硝酸還原酶活性可由產(chǎn)28

生的亞硝態(tài)氮的量表示。一般單位鮮重μ氮/（g）單位。的定可分為活體法和離體法?；铙w法步驟簡單，適合快速、多組測定；離體法復(fù)雜，但重復(fù)性較好。Ⅰ離體一、實驗材料、試劑與儀器設(shè)備（一）實驗材料水稻、小麥或其他植物葉片、幼穗等。（二）試劑、亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液確稱取分析純NaNO0.9857g溶無離子水后定容至然后再取25mL定至1000mL，即為含亞硝態(tài)氮的μg/mL的準(zhǔn)液。、0.1mol/L的酸緩沖液：HPO·12H與NaHPO·2H加無離子水24溶解后定容至1000mL1磺胺溶液1.0g磺胺溶于100mL度為3mol/L的（濃鹽酸加水定容至即為3mol/LHCl、％萘基乙烯胺溶液：0.0200g萘乙烯胺溶于mL無子水中，貯于棕色瓶中。、0.1mol/LKNO溶：KNO溶250mL0.1mol/LpH7.5磷酸緩沖液。330.025mol/L的磷酸緩沖液HPO12H，KHPO3HO溶1000mL242無離子水中。、提取緩沖液：半氨酸0.0372gEDTA于mol/LpH8.7的酸緩沖液中。、溶：2mg于mol/LpH7.5磷緩液中（臨用前配制（三）儀器設(shè)備冷凍離心機，分光光度計，天平（感量箱恒溫水浴，研缽剪刀，離心管，具塞試管，移液管，洗耳球。二、實驗步驟（一）標(biāo)準(zhǔn)曲線制作取潔凈烘干的刻試管按表順加入試劑配～μ的列標(biāo)準(zhǔn)亞硝態(tài)氮溶液。搖勻后在25下保溫，后在540nm比色測定。以亞硝態(tài)氮μg為橫坐標(biāo)X光度值為縱坐標(biāo)Y）立回歸方程。38

表1

配制標(biāo)準(zhǔn)溶時各物質(zhì)入量管號試劑/mL亞硝酸鈉標(biāo)液蒸餾水磺胺0.02%萘基烯胺每管含亞硝氮μg

10440

244

344

444

544

644

744（二）樣品中硝酸還原酶活力測定、酶的提取稱取0.5g樣，剪碎于研缽中置于低溫冰箱冰凍，出置冰浴中加少石英砂及4mL提取緩沖液，研磨勻漿，轉(zhuǎn)移于離心管中在4℃、4000r/min下心，上清液即為粗酶提取液。、酶的反應(yīng)取粗酶液0.4mL10mL試中，加入1.2mL0.1mol/LKNO磷緩沖液和0.4mLNADH溶，3混勻25水浴中保溫照不加NADH溶0.4mL0.1mol/L酸緩沖液代替。、終止反應(yīng)和比色測定保溫結(jié)束后立即加入1mL磺溶液終止酶反應(yīng)，再加萘基乙烯胺溶液，顯色后4000r/min下心取清液在540nm下色測定吸光度根回歸方程計算出反應(yīng)液中所產(chǎn)生的亞硝態(tài)氮總量μ三、結(jié)果計算樣品中硝酸還原酶活性x—反應(yīng)液酶催化產(chǎn)生的亞硝態(tài)總量μV—提取酶時加入的緩沖液體積，mLTV—酶反應(yīng)時加入的粗酶液體積mL；W樣品鮮重；t—應(yīng)時間。48

Ⅱ活體一、材料、儀器設(shè)備及試劑（一）實驗材料水稻、小麥或其他植物葉片、幼穗等。（二）試劑、亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液確稱取分析純NaNO0.9857g溶無離子水后定容至然后再取25mL定至1000mL，即為含亞硝態(tài)氮的μg/mL的準(zhǔn)液。1磺胺溶液1.0g磺胺溶于100mL度為3mol/L的（濃鹽酸加水定容至即為3mol/LHCl、％萘基乙烯胺溶液：0.0200g萘乙烯胺溶于mL無子水中，貯于棕色瓶中。、0.1mol/LKNO溶：KNO溶250mL0.1mol/LpH7.5磷酸緩沖液。33、30%氯乙酸溶液：30g三乙酸，水溶后定容至100mL（三）儀器設(shè)備真空泵、真空干燥器、小燒杯、玻璃瓶塞、其他用具同離體法。二、實驗步驟（一）標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：同離體法（二）酶反應(yīng)及活性測定、取樣：稱取作物葉片4份剪成左的小段，放于小杯中，用直徑略小于燒杯直徑的玻璃瓶塞將材料全部壓于杯底，其中1份對照，另外3份做酶活性測定用。、反應(yīng)：先向?qū)φ展苤屑尤?mL三氯乙酸，然后各管中都加入0.1mol/LKNO溶液，混勻3后立即放入干燥器中，抽氣通入空氣，再抽真空，反復(fù)幾次，以排除組織間隙的氣體，至葉片完全軟化沉入杯底，以便底物溶液進(jìn)入組織。最后通入氮氣密封后，℃黑暗中反，再分別向測定管（對照管除外）加入1mL三氯乙酸終止酶反應(yīng)。、比色測定：將各管搖勻靜置，各取反液，加入1mL磺和萘基乙烯胺，搖勻顯色15min后于下離心，取上清液于540nm處其光度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出反應(yīng)液中生成的亞硝態(tài)氮總量μ三、結(jié)果計算同離體法。58

葉素量測一、原理根據(jù)葉綠體色素提取液對可見光譜的吸收用分光光度計在某一特定波長測定其吸光度可用公式計算出提取液中各色素的含量。根據(jù)朗伯-比爾定律，某有色溶液的吸光度與中溶質(zhì)濃度和層厚度L正比，即：式中α為比例常數(shù)當(dāng)液濃度以百分濃度為單位層厚度為1cmα為該物質(zhì)的吸光系數(shù)種色物質(zhì)溶液在不同波下的吸光系數(shù)可通過測定已知濃度的純物質(zhì)在不同波長下的吸光度而求得。如果溶液中有數(shù)種吸光物質(zhì)此合液在某一波長下的總吸光度等于各組分在相應(yīng)波長下吸光度的總和。這就是吸光度的加和性。今欲測定葉綠素混合提取液中葉綠素，葉綠素類胡蘿卜素的含量，只需測定該提取液在個定波長下的吸光度A，并根據(jù)綠素，葉綠素類胡蘿卜素在該波長下的吸光系數(shù)即可求出其濃度。在測定葉綠素a，葉綠素為了排除類胡蘿卜素的干擾，所用單色光的波長應(yīng)選擇葉綠素在紅光區(qū)的最大吸收峰。已知葉綠素a葉綠素的丙酮提取液在紅光區(qū)的最大吸收峰分別為和645nm已知在波長，葉綠素a，葉綠素在該溶液中的吸光系數(shù)分別為和9.27，在長下分別為16.75和，根據(jù)加和性原則列出以下關(guān)系式：（1（2式的A和為綠素溶液在波長663nm和時吸光度Ca分為663645葉綠素、葉綠素的濃度，以mg/L為單。解方程組（1：（3（4將與相即得葉綠素總量Cab

T（5另外，由于葉綠素a葉綠素在的收峰相交，兩者有相同的吸光系數(shù)（均為也可以在此波長下測定一次吸光度A）而求出葉綠素、葉綠素量：65268

xx（6在有葉綠素存在的條件下，用分光光度法可同時測定出溶液中類胡蘿卜素的含量Lichtenthaler等對Arnon法進(jìn)行了修正，提出了80%丙酮提取液中色素含量的計算公式：（7（8（）式中：與分別為葉綠素、葉綠素的濃度；abC為類胡蘿卜素的總濃度；A、A和A分別為葉綠素色提取液在波長663nm和470nm下的吸光度。663470由于葉綠體色素在不同溶劑中的吸收光譜有差異此在使用其他溶劑提取色素時計公式也有所不同。葉綠素a葉綠素在乙醇中最大吸收峰的波長分別為和，胡蘿卜素為，據(jù)此列出以下關(guān)系式（10（11（12二、材料、儀器設(shè)備及試劑（一）材料新鮮（或烘干）的植物葉片。（二）儀器設(shè)備分光光度計、電子天平、研缽、棕色容量瓶、小漏斗、定量濾紙、吸水紙、擦鏡紙、滴管。（三）試劑、95%醇（或80%酮、石英砂；、碳酸鈣粉。三、實驗步驟（1取鮮葉（其他綠色組織或材擦凈組織表面污物打孔器剪取葉片組或剪（去78

掉中脈勻（2稱取混勻后的新鮮樣品0.2g共三份，分別放入研缽中，加少量石英砂和碳酸鈣粉以及95%乙醇（或丙酮，以下同磨勻漿，再加95%乙醇10mL，繼續(xù)研磨至組織變白。靜置。（3取濾紙一張，置漏斗中，用乙醇濕潤，沿玻璃棒把提取液倒入漏斗中，過濾到5mL棕容量瓶中，用少量95%醇沖洗研缽，研棒及殘渣數(shù)次，最后連殘渣一起倒入漏斗中。（4用滴管吸取乙醇，將濾紙上的葉綠體色素全部洗入容量瓶中。直到濾紙和殘渣中無綠色為止。最后用乙醇定容至，勻。（5把葉綠體色素提取液倒入光徑的色杯內(nèi)。以乙醇為空白，在波長