中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)-遺傳學(xué)實驗

PAGEPAGE10…………….遺傳學(xué)實驗張文銳黃麗華高永翔中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院實驗教學(xué)中心目錄實驗一有絲分裂（Feulgen）制片技術(shù)3實驗二減數(shù)分裂制片技術(shù)7附：臨時制片與永久制片技術(shù)實驗三果蠅的形態(tài)、生活周期及飼養(yǎng)11實驗四果蠅的伴性遺傳16實驗五果蠅的唾腺染色體制片技術(shù)20實驗一有絲分裂（Feulgen染色）制片技術(shù)一、實驗?zāi)康?基本技術(shù)；2動態(tài)變化；3、掌握Feulgen染色方法。二、基本原理有絲分裂（mitosis）是植物細(xì)胞分裂的主要方式，細(xì)胞分裂過程中，核內(nèi)Feulgen是鑒別細(xì)胞中DNADNA(通常位于核及染色體上)在1NHCl60℃水解時部分地破壞了脫氧核糖與嘌呤堿之間醛基獲得了自由狀態(tài)。而無色的亞硫酸品紅是由偏重亞硫酸鈉偏重亞硫酸鈉與鹽酸能產(chǎn)生亞硫酸根當(dāng)具有醌式結(jié)構(gòu)的堿性品紅分子與亞硫酸根結(jié)合。當(dāng)用這種無色的亞DNA游離的醛基結(jié)合，從而使DNA。這一反應(yīng)是1924FeulgenDNA三、材料和器材1、實驗材料：（Viciafaba,2n=12（或其它植物（Alliumcepa,2n=16）根尖。2、實驗儀器及用具：水浴鍋(60℃水浴)、顯微鏡、培養(yǎng)箱、電子天平、酒精燈、100℃溫度計、具塞試管、吸管、濾紙條等。3、藥品和試劑：卡諾氏固定液（冰醋酸:無水酒精=1:3、秋水仙堿（或8－羥基喹啉、無水乙醇、1NHCl、45醋酸、0.2秋水仙素、堿性品紅、偏重亞硫酸鈉（鉀Schiff試劑的配制Schiff1g堿性品紅200ml550-55℃25℃20ml1NHCl1-3g(KSO225亞硫酸鈉(NaSO)。搖動使溶解，密閉瓶口置黑暗低溫處或冰箱內(nèi) (4℃左223右)18-24h0.5-1g110-5℃5-6偏重亞硫酸鉀(KSO(NaSO1NHClSO、SO225 223 2 2與堿性品紅反應(yīng)生成堿性品紅——亞硫酸溶液，呈無色。漂染液的配制取10%亞硫酸鈉10ml，加200ml蒸餾水，再加10ml1NHCl即可。四、實驗方法和步驟1、材料準(zhǔn)備、蠶豆根尖：選取新鮮無病斑的蠶豆干種子，經(jīng)日曬后，放在燒杯內(nèi)，室20℃左右保濕培養(yǎng)（雙層紗布覆蓋，1－2cm9:00－10:3014:00－16:00、洋蔥根尖：通過休眠的洋蔥鱗莖，經(jīng)日曬后，置于盛有清水的小燒杯上20－25℃2－31－2cm9:00－11:002、預(yù)處理為獲得較多中期分裂相的細(xì)胞，且使染色體縮短和分散，可對根尖進行預(yù)處理，方法如下（取其一即可：1、0.05％－0.2％的秋水仙堿水2－42、0.002M8－3－4(31－4℃243、固定（冰醋酸:無水酒精=1:3（15）30－6090％→80％酒精→70％（各半小時）浸泡進行轉(zhuǎn)換，最后置于70％0－4℃冰箱，約可保存半年。如保存時間太長，需重新固定后再用。4、Feulgen染色法(1)、取經(jīng)預(yù)處理并固定好的洋蔥根尖，用水洗2-3分鐘，放入室溫條件下的1NHcl處理根尖材料2-3分鐘。60HCl600.5℃的條件下8-10HCl，1NHCl1-2，然后2-3。Schiff30、漂染液沖洗三次510-15、取根尖（紫紅色部分）45醋酸，（HCl5、顯微觀察：制備好的細(xì)胞學(xué)片子，置于顯微鏡上，先用低倍鏡相的細(xì)胞，再轉(zhuǎn)換到高倍鏡（10×40）下觀察。6、影響孚爾根（Feulgen）反應(yīng)的主要因素水解時間和溫度主要關(guān)鍵不足淺淡細(xì)胞質(zhì)中可能有其他醛基存在而顯示擴散的紅色過度著色不勻DNA游離核酸分子從染色體擴散到細(xì)胞質(zhì)中普遍著色使水解液中的反應(yīng)增強，而細(xì)胞不能著色。定液產(chǎn)生紅色，酒精-醋酸固定液產(chǎn)生紅色、紫紅色，只用酒精的呈現(xiàn)紫色，用含甲醛的固定液則呈現(xiàn)強烈的紫紅色。當(dāng)需要對染色體中的DNA定量一般只能用不含金屬離子和甲醛酒精-醋酸固定液等。(3)SO2

含量：Schiff試劑中的SO2

含量也影響孚爾根反應(yīng)的顏色表現(xiàn)。SO2含量低時呈紅色，含量高時則偏向藍(lán)色。(4)DNADNADNA有大、中型染色體適于用孚爾根反應(yīng)五、實驗報告1、繪制你所觀察到的圖象，并說明是有絲分裂的哪一個時期。2、直接固定和經(jīng)過預(yù)處理后固定的材料，其分裂相有何不同？3、經(jīng)溫HCl處理和不經(jīng)處理的制片有何區(qū)別，為什么？實驗二減數(shù)分裂制片技術(shù)一、實驗?zāi)康?、了解植物生殖細(xì)胞的形成過程；2、熟悉減數(shù)分裂各時期的特點，加深對減數(shù)分裂的認(rèn)識；3、掌握植物花粉母細(xì)胞的壓片技術(shù)和方法。二、基本原理減數(shù)分裂（meiosis）,又稱成熟分裂（maturationdivision）是在性母細(xì)胞成熟時，配子形成過程中所發(fā)生的一種特殊方式的有絲分裂。性母細(xì)胞（連續(xù)進行兩次核分裂（第一次分裂和第二次分裂，形成四個染色體數(shù)目減半的(n)（n（2n。確保了親代與子代間染色體數(shù)目的恒定性，從而保證了物種相對的遺傳穩(wěn)定性。在適當(dāng)?shù)臅r候采集植物的花蕾制備染色體標(biāo)本就可在顯微鏡下觀察到植物細(xì)胞的減數(shù)分裂。整個減數(shù)分裂可分為下列各個時期：第一次分裂前期Ⅰ減數(shù)分裂的特點之一就是前期Ⅰ特別長，而且又較復(fù)雜。通常根據(jù)細(xì)胞核內(nèi)結(jié)構(gòu)變化特征又將這一期分成五個時期，即雙線期和終變期。（leptotene細(xì)而長的絲狀體已經(jīng)復(fù)制為二個染色單體，但在顯微鏡下還看不出結(jié)構(gòu)上的雙重性。偶線期(zygotene)pairingn偶線期。粗線期pachytene二價體逐漸縮短變粗四合體(tetrad)非姊妹染色單體間出現(xiàn)交換（crossingover）,造成遺傳物質(zhì)的重組。雙線期(diplotene)：配對的同源染色體進一步縮短變粗，由于同源染色體間發(fā)生過互換，開始分離而出現(xiàn)交叉（chiasmata）現(xiàn)象。此時染色體呈現(xiàn)扭花狀。終變期(diakinesis)（terminalizatio顯著收縮均勻地分散XOV膜、核仁才開始消失。此時有利于染色體計數(shù)。前期Ⅰ都具有較明顯的核仁顯著標(biāo)志，進入中期,核膜、核仁才開始消失。體開始分離。此時也是鑒定染色體數(shù)目和形態(tài)的最好時期。后期Ⅰn染色體，每一染色體含有兩個染色單體。實現(xiàn)了染色體數(shù)減半（2n→n。末期Ⅰ新形成，胞質(zhì)分裂，成為兩個子細(xì)胞，稱為二分體（dyad。中間期（interkinesis）在第二次分裂開始之前，兩個子細(xì)胞進入間期。但有的植物和大多數(shù)動物不經(jīng)過間期，直接進入第二次分裂。間期的時間短，無DNA復(fù)制，故DNA含量沒有變化。第二次分裂前期Ⅱ染色體縮短變粗，開始清晰起來。每個染色體含有一個著絲粒和縱向排列的兩條染色單體。前期快結(jié)束，染色體變得短粗、清晰可見，核膜消失。中期Ⅱ染色體排列在赤道面上，兩條染色單體開始分裂。此時細(xì)胞的染色體數(shù)為n，每一染色體有兩條染色單體。后期Ⅱ著絲點分裂為二，兩條染色單體由紡錘絲分別拉向兩極，每極含有n條染色體。末期Ⅱ染色體逐漸解旋，核膜重建，核仁重新形成，同時細(xì)胞質(zhì)又分為兩部分，各成為兩個子細(xì)胞。（tetrad）或四分孢子(tetraspore)。各細(xì)胞的核里的染色體只有最初細(xì)胞染色體的一半，2nn。三、材料和器材1、實驗材料：玉米雄花序（2n=20）2、實驗儀器及用具：顯微鏡、鑷子、解剖針、載玻片、蓋玻片等。3、藥品和試劑：Carnoy固定液（甲醇∶冰醋酸=3∶145%醋酸等。四、實驗方法和步驟1、采集玉米不同花期的雄花序用新配制的Carnoy固定液（甲醇∶冰醋酸=3∶1）18—2480%70%70%2—32、取經(jīng)過固定的雄花序，選取長0.5cm左右的小花，用解剖針或鑷子挑出花藥（3，置于載玻片上。3在花藥上滴一滴醋酸洋紅截成幾段花藥中的花粉母細(xì)胞。4、去除花藥殘渣，適當(dāng)涂勻玻片，蓋上蓋玻片，墊一張濾紙，以大拇指均勻按壓，注意，不要滑動蓋玻片！吸去多余染液即可鏡檢。若高倍鏡觀察顏色太深，可在酒精燈火焰上過幾遍，微燙，使細(xì)胞質(zhì)透明，增大反差，注意不要拷過度！5、顯微鏡下觀察，尋找減數(shù)分裂各期圖象，熟悉各時期特點。五、實驗報告繪制觀察到的典型的減數(shù)分裂各期分裂相。為什么說減數(shù)分裂是經(jīng)典遺傳學(xué)的根本？簡述減數(shù)分裂各個時期染色體的特征。附：臨時制片與永久制片置低溫下一般可保存數(shù)星期。Ⅱ、永久制片：1、將制好的片子有蓋玻片的一面向下浸入95%1：冰醋酸11-2295%2：11-23，移入95%酒精1：正丁醇2的混合液中1-2分鐘。4，1-2（至少兩次。5，加拿大樹膠（或中性樹膠）封存。實驗三果蠅的形態(tài)、生活周期及飼養(yǎng)一、實驗?zāi)康?、了解果蠅生活史中各個不同階段的形態(tài)特點；2、區(qū)別雌雄果蠅以及幾種常見突變類型的主要性狀特征；3、掌握實驗果蠅的飼養(yǎng)、管理及實驗處理方法和技術(shù)。二、基本原理1、果蠅的生活史果蠅屬于昆蟲綱，雙翅目，果蠅屬，與家蠅是不同的種。30℃果蠅培養(yǎng)的最適溫度為20-25℃。10℃10℃15℃20℃25℃卵幼蟲幼蟲成蟲8557186.34.210251512兩天后才能產(chǎn)卵為橢圓形，腹面稍扁平，在背面的前斷伸出一對觸絲，它能使卵附著在食物(或瓶壁)上，不致深陷到食物中去。幼蟲：從卵孵化出來后，經(jīng)過兩次蛻皮，發(fā)育成三齡幼蟲，此時體長可達4-5mm。肉眼可見其前端稍尖部分為頭部，上有一黑色斑點即為口器。口器后面，而卵巢則較小，可以此作為鑒別。幼蟲活動生長良好。7-8漸形成一梭形的蛹.在蛹前部有兩個呼吸孔，后部有尾芽，起初蛹?xì)ゎ伾S而柔軟，以后逐漸硬化，變?yōu)樯詈稚砻骷磳⒂鸹?。粗圓形，雙翅展開。體色加深。如野生型初為淺灰色，然后呈灰褐色。2、形態(tài)構(gòu)造頭部有一對復(fù)眼，三個單眼和一對觸角；胸部有三對足，一對翅和一對平衡棒；腹部背面有黑色環(huán)紋，腹面有腹片，外生殖器在腹部末端，全身有許多體毛和剛毛。雄果蠅 雌果蠅3、成蟲雌雄的鑒別性狀雌果蠅雄果蠅體型較大較小第一對足跗節(jié)無性梳有性梳腹末端鈍而圓稍尖腹片6個4個腹背面條紋5條3條外生殖器簡單復(fù)雜突變形狀名稱基因符號形狀特征突變形狀名稱基因符號形狀特征所在染色體白眼w復(fù)眼白色X棒眼B復(fù)眼橫條形X檀黑體e體呈烏木色，黑亮IIIR黑體b體呈深色IIL黃身y體呈淺橙黃色X殘翅vg翅退化，部分殘留不能飛IIR焦剛毛sn剛毛卷曲如燒焦?fàn)頧小翅m翅較短X5、果蠅的性別決定染色體組成2n＝8。核內(nèi)有絲分裂：不涉及細(xì)胞分裂和核分裂的染色體分裂方式。體聯(lián)會：一些特殊的體細(xì)胞中（果蠅唾腺細(xì)胞）染色體經(jīng)多次復(fù)制卻不分開，常染色體上有決定雄性果蠅的性別決定XY育性有關(guān)。YY比值（性指數(shù)）有關(guān)。X/A=1則為雌性；X/A=0.5則為雄性。X/A＞1，為超雌；X/A＜0.5，則為超雄；0.5＜X/A＜1則為中間性。X平衡。果蠅的連鎖群一對染色體。三、材料和器材1、實驗材料：黑腹果蠅。2、實驗儀器及用具：雙目解剖鏡、放大鏡、小鑷子、麻醉瓶、白瓷板、新毛筆等。3、藥品和試劑：果蠅培養(yǎng)基、乙醚等。四、實驗方法和步驟1、培養(yǎng)基的配制果蠅培養(yǎng)基的配置(1000ml用量)玉米面玉米面紅糖瓊脂干酵母丙酸85g（或蔗糖）65g 8.5g7g5ml水溶瓊脂→加紅糖（或蔗糖）→加攪好的玉米面→煮沸→加水到冷卻→50℃左右加入酵母粉丙酸（防腐劑。配制好的培養(yǎng)基進行高壓滅菌，121℃，20min，待用。2、果蠅培養(yǎng)3-5視其生長周期。3、果蠅的性狀觀察對果蠅進行檢查時，可用乙醚麻醉，使它保持靜止?fàn)顟B(tài)。因為果蠅對乙醚很敏感，易麻醉，麻醉的深度看實驗的要求而定（45。條，蓋上瓶塞，稍等片刻果蠅便麻醉。4、記錄觀察結(jié)果觀察完畢，將全部果蠅倒入煤油或酒精瓶中（死蠅盛留器，統(tǒng)一處理。五、實驗報告將觀察到的果蠅常見突變形狀特征填在下表中。++eywBwyvg勺翅缺刻三隱性體色眼色形翅形剛毛實驗四果蠅的伴性遺傳一、實驗?zāi)康?、正確認(rèn)識伴性遺傳的正、反交的差別，進一步認(rèn)識伴性遺傳的特點。2、記錄雜交結(jié)果，掌握統(tǒng)計處理方法。二、基本原理遺傳方式稱為伴性遺傳（sex-linkedinheritance。XYXX，XY，性別。伴性基因主要位于XYX—連鎖遺傳。果蠅的紅眼與白眼是一對相對性狀，由單基因控制，位于X染色體上，基因之間的關(guān)系為紅眼對白眼完全顯性。當(dāng)紅眼果蠅（♀）和白眼果蠅（♂）雜交，F(xiàn)代中的果蠅均為紅眼，F(xiàn)1

代中紅眼果蠅∶白眼果蠅=3∶1，但在雌果蠅中全為紅眼，在雄果蠅中紅眼果蠅∶白眼果蠅=1∶1。當(dāng)反交時，F(xiàn)1

代中的雌果蠅為紅眼，雄果蠅卻為白眼。F2

代中紅眼果蠅∶白眼果蠅=1∶1，在雌果蠅或雄果蠅中紅眼果蠅與白眼果蠅的比例均為1∶1。ABAA：紅眼雌[♀]×白眼雄[♂] B：白眼雌[♀]×紅眼雄P： X+X+×XwY P： XwXw×X+Y↓ ↓F1： X+Xw×X+Y F1： X+Xw×XwY↓ ↓F2：

X+Xw

X+Y XwY F2：

XwXw

X+Y XwY表型:♀[+]♀[+]♂[+]♂[w] 表型:♀[+]♀[w]♂[+]♂[w]注意：12XBF1千個體中有一個。不分離現(xiàn)象如下圖所示：三、材料和器材1、實驗材料：黑腹果蠅（Drosophilamelanogaster ）品系野生型（紅眼X+X+X+Y突變型（白眼2、實驗儀器及用具：大試管、麻醉瓶、瓷板、毛筆等。3、藥品和試劑：乙醚、果蠅培養(yǎng)基等。四、實驗方法和步驟1、收集處女蠅：由于雌蠅生殖器官中有貯精囊，一次交配可保留大量精子，供多次排卵受精用，因此做雜交實驗前必須收集未交配過的處女蠅。由于孵化出的12（8不交尾♀、♂蠅分開培養(yǎng)，所得的♀蠅即為處女蠅。2、準(zhǔn)備好培養(yǎng)基，按正、反交組合，把已麻醉的紅眼♀、白眼♂和紅眼♂、白3—5雜交日期、操作者姓名。3、6—7F1

幼蟲出現(xiàn)，即除去親本果蠅（。43—4F1

成蠅的性狀（正、反交有什么不同？眼色與性別的關(guān)系如何？。5、將所出現(xiàn)的F1

3—5（此處無需處女蠅。兩組合后代不能混合，應(yīng)分別培養(yǎng)。6、6—7F1

代親本果蠅。73—4，F(xiàn)2

代成蠅出現(xiàn)，麻醉后倒出觀察眼色和性別，進行統(tǒng)計。合計比例8合計比例F1代正交反交類型紅眼♀×白眼♂白眼♀×紅眼♂觀察日期紅眼♀ 紅眼♂紅眼♀ 白眼♂型紅眼白眼紅眼白眼紅眼白眼紅眼白眼觀察♂♂♀♀♂♂♀♀日期F代類2正交組合FF代類2正交組合F2反交組合F2合計比例χ2=∑（觀察值–理論值）2/理論值根據(jù)χ2測定，查χ2表，n=4-1=3，P

=7.815;n=2-1,P

=3.841。若所得的0.05 0.05χ2﹤P ，可以認(rèn)為觀察值是符合假設(shè)的。具體對這個實驗來說，所得到的實驗0.05結(jié)果應(yīng)該是符合伴性遺傳的假設(shè)，也就是說眼色的這對性狀是由位于性染色體X上的一對等位基因控制的。若所得的χ2﹥P遺傳的結(jié)果。

則說明所得到的結(jié)果不符合伴性0.05，五、實驗報告1、完成上面的統(tǒng)計表格，并做χ2測驗，解釋實驗結(jié)果。2、在雜交過程中，當(dāng)見到有F1

幼蟲出現(xiàn)時為什么一定要將親本果蠅去除干凈？3、在挑取F1

代果蠅進行繼續(xù)雜交時為什么不需要處女蠅？實驗五果蠅唾腺染色體制片技術(shù)一、實驗?zāi)康?、練習(xí)分離果蠅幼蟲唾腺的技術(shù)，學(xué)習(xí)唾腺染色體的制片方法;2、觀察果蠅唾腺的形態(tài)學(xué)及遺傳學(xué)特征；3、了解體細(xì)胞染色體配對現(xiàn)象；二、基本原理本世紀(jì)初，D.KostoffD.melanogaster細(xì)胞核中發(fā)現(xiàn)了特別巨大的染色體—唾液腺染色體（salivaryglandchromosom。事實上，雙翅目昆蟲（如搖蚊、果蠅等）的幼蟲期都具有很大的染色體結(jié)構(gòu)、化學(xué)組成、基因差別表達等提供了獨特的研究材料。仍不斷地進行自我復(fù)制而不分開1000—40005μm，400μm中期相染色體大得多（約100—150倍（polytenechromosom）和巨大染色體（giantchromosom。“體細(xì)胞聯(lián)會只呈現(xiàn)單倍數(shù)2n=2×4，其中第Ⅱ、第Ⅲ染色體為中部著絲粒，第Ⅳ和第Ⅰ（X染色體