心肌細胞腫脹激活氯離子通道的單通道特性

心肌細胞腫脹激活氯離子通道的單通道特性【摘要】目的：研究急性分離小鼠心肌細胞腫脹激活氯離子通道的單通道特征.方法：采用膜片鉗單通道方法，記錄急性分離的小鼠心肌細胞暴露于低滲溶液時出現(xiàn)的腫脹激活氯通道電流().結果：等滲狀態(tài)下，用細胞貼附式記錄，多數(shù)心肌細胞膜片無通道活動，用低滲溶液灌流細胞，在細胞容積增大的同時，出現(xiàn)單通道電流的激活.該腫脹激活單通道氯電壓在-100mV~+100mV均有激活.在電壓+100mV時，其單通道電導為(±)pS，開放概率為±，電流電壓曲線顯示其反轉電位(-±)mV,接近氯離子平衡電位的理論值(ECl=-mV),且反轉電位隨氯離子濃度的改變而改變.氯通道阻斷劑DIDS可逆性阻斷該單通道電流.結論：小鼠心肌細胞腫脹激活氯通道的單通道電導為(±)pS，電流呈外向整流特征并對DIDS敏感.

【關鍵詞】心肌/細胞學；腫脹激活氯離子通道；膜片鉗術

0引言

調節(jié)性細胞容積減小指的是細胞暴露于低滲透壓環(huán)境時，細胞膨脹、容積增大激活了細胞的容積調節(jié)功能，導致胞內的溶質及水份外流，使已膨脹的細胞容積向正常容積轉化的過程.在心肌細胞，RVD功能的異常是缺血再灌注損傷、心力衰竭、心肌肥厚等多種心臟疾病過程中細胞凋亡與壞死以及心律失常發(fā)生的關鍵.因此，闡明心肌細胞RVD過程的機制，了解參與心肌細胞容積調節(jié)的離子通道特性和分子定位，具有重要的生理學與病理生理學意義.關于小鼠心肌細胞上腫脹激活的氯通道的單通道特性目前尚無報道.我們在急性分離的小鼠心肌細胞上，應用膜片鉗細胞貼附式和內面向外式方法觀察了低滲溶液激活的氯通道的單通道特性.

1材料和方法

材料

5~7周齡的成年雌性C157小鼠.實驗中所用藥品和試劑除EGTA購自日本W(wǎng)ako公司外，Hepes,Nifidipine,TEACl,4,4diisothiocyanostilbene2,2disulfonicacid和tetrodotoxin等均購自Sigma公司.

方法

單個小鼠心肌細胞的分離實驗用小鼠，ip注射肝素抗凝，20min后，10g/L戊巴比妥鈉麻醉.打開胸腔，迅速取出心臟，放在冰分離液中，主動脈插管Langendorff裝置進行灌流.用灌流液沖洗心臟3~5min后，改用含有g/L膠原酶和1g/LBSA的灌流液灌注8~15min，最后用冰灌流液沖洗殘酶約7min.將心臟剪碎,分離單個心肌細胞置于保存液，吹打過濾后，4℃保存待用.灌流過程中，液體溫度保持37℃，所有液體用純氧飽和.灌流液(mmol/L)：NaCl,KCl4,NaH2PO4,MgSO4,Hepes10,葡萄糖11(用NaOH調pH至).

電生理學實驗取分離好的單個心肌細胞置于灌流槽中，灌流無鈣臺氏液.待細胞穩(wěn)定貼壁后，灌流等滲細胞外液，形成巨阻封接，室溫下采用膜片鉗單通道細胞貼附式和內面向外式方法［1］記錄腫脹激活單通道氯電流.電極采用硼硅酸玻璃管經(jīng)電極拉制器(P2000:SutterInstruments,Novato,CA)多步拉制而成.沖灌電極液后電阻為5~6MΩ.電流經(jīng)EPC9放大器(HEKAElectroniks,Lambrecht,德國)放大后，電流信號采樣頻率為10kHz，經(jīng)濾波后，記錄到Pulse和Pulsefit軟件系統(tǒng)中(HEKAElectroniks,Lambrecht,德國).數(shù)據(jù)分析應用PulseMate和Origin(OriginLabInc.,Northampton,MA)軟件.

電生理學實驗所用液體：電極內液:NMDGCl85,NaCl10,4AP2,BaCl2,NaH2PO4,MgCl24,Hepes10,glucose,TEACl5,TTX8μmol/L,nifidipine5μmol/L,,加入甘露醇調節(jié)溶液的滲透壓為305Osmmol/kg.低滲灌流液:NMDGCl113,MgATP5,NaGTP,EGTA5,Hepes5,滲透壓為230Osmmol/kg.在研究氯離子通道選擇性的實驗中，灌流液中等量的Cl-由天冬氨酸代替.為驗證腫脹激活單通道氯電流對氯通道阻斷劑DIDS的敏感性，用含有500mol/LDIDS的低滲灌流液灌流細胞，觀察其對單通道開放概率的抑制作用.等滲灌流液是在低滲溶液中加入甘露醇調節(jié)滲透壓到305Osmmol/kg.實驗過程中灌流液中持續(xù)加入8μmol/LTTX，5μmol/Lnifidipine以阻斷電壓依賴性Na+通道和LtypeCa2+通道.所有溶液的滲透壓應用冰點滲透壓測量儀(OM802,Vogel,德國)測量.阻斷劑DIDS用二甲基亞砜配置50mmol/L的儲存液保存，使用時稀釋到500μmol/L灌流細胞.

統(tǒng)計學處理：采用統(tǒng)計學軟件包完成，所有數(shù)據(jù)以x±s表示.用阻斷劑前后的比較采用配對t檢驗，即認為有統(tǒng)計學差異.

2結果

小鼠心肌細胞腫脹激活單通道氯電流的電壓依賴性在等滲狀態(tài)下，多數(shù)小鼠心肌細胞膜片無通道活動.低滲溶液(230Osmmol/kg)灌流細胞，15～30min后，細胞容積增大，同時，有些在等滲條件下無通道活動的膜片出現(xiàn)單通道電流的激活，通道激活的時間一般是在低滲溶液灌流后的(13±4)min.一旦單通道電流出現(xiàn)，就將該膜片游離形成內面向外式記錄方式.Fig1A所示的即為在等滲時無電流活動，用低滲溶液灌流后出現(xiàn)通道活動的一個膜片記錄結果.可見，在細胞內外氯離子濃度對稱時，在電壓-100mV~+100mV范圍內，均有通道開放，且能穩(wěn)定20min以上，在+100mV和-100mV鉗制電壓時，電流的幅度分別為(±)pA和pA,(n=11)，表現(xiàn)出明顯的外向整流特征.Fig1B為單通道電流的電流/電壓曲線.當?shù)蜐B灌流液中氯離子的濃度由113mmol/L改為25mmol/L時，電流的反轉電位向更負的方向偏移，由0mV偏移到了對電流的開放產(chǎn)生明顯抑制作用，約3min達到最大作用，此時單通道開放時間明顯縮短，而關閉時間延長(Fig3).在+100mV，通道的開放概率由±降低為±.DIDS的阻斷作用是可逆的，沖洗后阻斷作用消失.

3討論

Nilius等［2］首先在內皮細胞記錄到了低滲激活的氯通道電流，發(fā)現(xiàn)該電流可明顯減輕細胞在低滲狀態(tài)下水腫的程度.到目前為止，腫脹激活氯通道已被證實廣泛分布在多種哺乳動物的細胞膜上［3］.在犬和兔的心房肌細胞和竇房結細胞［4-6］、豚鼠心室肌細胞，培養(yǎng)的雞心肌細胞［7,8］和人心房肌細胞［9,10］上均證實了的表達，且的全細胞電流具有共同的電生理學特點:對氯離子的高度選擇性;外向整流特性;在去極化電壓下的時間依賴性失活等.而關于該通道的單通道特性報道較少.尤其在小鼠心肌細胞未見報道.我們應用膜片鉗單通道記錄方法，探討了小鼠心肌細胞腫脹激活氯電流的單通道特性，證實該通道能夠被低滲溶液激活，單通道電導約為38pS，可逆性被DIDS阻斷，這與Duan等［11］報道的兔心房肌細胞容積敏感性氯通道的單通道特性相似.但小鼠心肌細胞腫脹激活氯通道對DIDS敏感性低于兔心房肌細胞，其機制有待進一步探討.

研究心肌細胞的，不僅有助于明確生理狀態(tài)下細胞的容積調節(jié)機制，而且很有可能成為臨床治療的新的切入點.因為它不僅參與細胞的容積調節(jié)，而且與心肌缺血/再灌注損傷的保護作用和細胞凋亡有關.在心肌缺血時，由于局部代謝障礙，心肌細胞腫脹，此時激活，在一定程度上有利于保護心肌細胞，避免細胞由于過度腫脹而導致心肌細胞壞死.

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