WB實戰(zhàn)指南+正確使用QuantityOne定量

WB實戰(zhàn)指南+正確使用品制備：變性條件——SDSLB直接裂解：用常溫或者高溫預(yù)熱過（預(yù)熱更有利于阻止蛋白水解或者磷酸酶去磷酸化，但輕易遺忘，LB久煮一些性質(zhì)會改變）1*SDSLB（或者略高1.5*）直接加到細(xì)胞或者組織上并煮樣。通常6孔板細(xì)胞80%以上密度，需200ul，其余按平板面積比類推。通常條件下，SDSLB都是過量（所以不一定要嚴(yán)格參考SDSLB稀釋比）；假如SDSLB不夠，樣品核酸、蛋白濃度過高時，煮樣后會發(fā)覺tip吸不上來，非常粘、一砣一砣，很輕易堵住tip。這時候常規(guī)做法有兩種，1.再煮5min。常規(guī)煮樣時間3-5min，樣品過濃時就煮10min；2.假如10min煮樣后，依然吸不起來，才適當(dāng)增加SDSLB，繼續(xù)煮；也能夠?qū)悠愤M(jìn)行超聲。煮樣時間若過長，蛋白會凝固，此時以失去繼續(xù)WB意義，請丟棄（判斷標(biāo)準(zhǔn)：出現(xiàn)顯著蛋白沉淀和水分層）此方法缺點，SDSLB煮過樣品假如用來做IP，需要特殊方法，所以，這種制備方法制備樣品有使用局限。非變性裂解法（不討論諸如核抽提、亞細(xì)胞器分離等等了，其實類似）裂解細(xì)胞請盡可能冰上操作，減緩酶解作用。俺前bossnature文章上裂解液配方是：20mMTris/HCl,pH7.6,100mMNaCl,20mMKCl,1.5mMMgCl2,0.5%NP-40andproteaseinhibitors(20μg/mlleupeptin,10μg/mlpepstatinAand10μg/mlaprotinin)（此裂解液可用于抽提核蛋白），其中蛋白酶抑制劑很復(fù)雜也很貴，其實用0.5mMPMSF代替這三種就好了；假如還要做磷酸化蛋白，加1mMNa3VO4（現(xiàn)加現(xiàn)用），10mMNaF,1mMNa3VO4,50mMbeta-GP。此方法優(yōu)點：NaCl濃度略低于生理狀態(tài)，確保裂解細(xì)胞方式較為溫和，便于隨即IP等試驗。其余Na鹽濃度細(xì)胞裂解液也很常見，諸如0.15M（生理鹽濃度）、0.3M、0.6M（高鹽系列，裂解細(xì)胞時染色體會析出，細(xì)胞碎片和沉淀非常粘稠）及0.8-1.2M；0.3M及以下適合IP試驗，0.6M及以上適合純化蛋白，尤其相互作用較強(qiáng)復(fù)合體，要得到純化一些復(fù)合體組成蛋白通常采取極端高鹽裂解細(xì)胞。用于核蛋白裂解原因是0.5%NP-40，用于破壞核膜結(jié)構(gòu)；可用到1%，但此時染色體會析出，沉淀粘稠。組織塊裂解：組織塊較大用勻漿方法最適宜，現(xiàn)在有不少轉(zhuǎn)頭很小勻漿器。當(dāng)組織超微量時候，比如50mg新鮮癌組織，我采取方法是1.低溫（剪）攪碎，成肉糜狀。2.錫箔紙包裹好，放入少許液氮，快速敲擊（控制力量，盡可能防止弄破錫箔紙），深入破碎；重復(fù)數(shù)次。3.用上述細(xì)胞裂解液回收。分泌型蛋白富集：用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，搜集上清液用于WB檢測；假如含量過低，需要用TCA沉淀富集。理論上，從普通培養(yǎng)基中搜集分泌蛋白，此時對細(xì)胞生長條件影響最小，是最好試驗條件；不過這存在隱憂。因為含血清培養(yǎng)基中含有非常豐富BSA（牛血清白蛋白）之類蛋白質(zhì)，除非你深入分離純化，不然直接用這種樣品去WB會有非常大麻煩，尤其當(dāng)你蛋白在60-46kDa之間時候；用“任何”抗體去檢測這一區(qū)間蛋白，會有一片非常強(qiáng)信號。因為此區(qū)間蛋白（主要是BSA）濃度過于富集，會非特異性粘附“任意”抗體，從而最終被識別。同理，采取SDSLB裂解細(xì)胞制備樣品前，通常要用PBS洗滌，其目標(biāo)之一是去除培養(yǎng)基中BSA。采取無血清培養(yǎng)基搜集細(xì)胞上去除了改變細(xì)胞生理狀態(tài)外（可能激活未知信號路徑，諸如AKT等），還會出現(xiàn)問題是：1.即使采取了無血清搜集上清，依然有大量雜蛋白，但相對好很多。2.選取了上清，因為蛋白濃度太稀，通常要采取TCA沉淀富集，再重新溶解。a.TCA沉淀對半定量操作要求非常高，因為很輕易沉淀不充分或者離心操作丟失，尤其在離心過程，離心管擺放非?？季浚?80度翻轉(zhuǎn)離心兩次。b。重新溶解時，因為蛋白需要在一定鹽離子條件下才能重新溶解，你要探索充分溶解條件，相對麻煩。實際上，假如你不是非常強(qiáng)調(diào)蛋白分泌有什么生理功效，通常不提議檢測上清，尤其半定量WB試驗檢測不一樣品間差異。這里面有試驗操作細(xì)節(jié)麻煩——經(jīng)驗之談，我曾經(jīng)參加cancercell文章所研究蛋白就是分泌型蛋白，但90%數(shù)據(jù)是celllysis；偶然用到上清，也只是作為富集純化該蛋白原料，為深入分析做準(zhǔn)備。樣品制備完，應(yīng)立刻低溫保留（-20度短期（幾天）；-80度長久；例外，IP用樣品應(yīng)直接進(jìn)行IP，防止凍融破壞蛋白質(zhì)間弱相互作用）。SDSLB煮沸過樣品凍融會存在另一個問題，SDS沉淀；SDS4度就會沉淀，何況-80度。上樣前應(yīng)加熱充分溶解，不然從加樣口向下拖帶（SDSLB不夠，樣品未充分溶解也會出現(xiàn)類似拖尾；上樣過大也會）。在樣品制備過程中，另一個需要注意問題是，從樣品制備起始階段就要注意定量問題；WB本身系統(tǒng)誤差有20%，太細(xì)微差異經(jīng)常忽略不計。細(xì)胞樣品能夠先計數(shù)再接種，短時間內(nèi)即使細(xì)胞生長有差異也不會對WB結(jié)果影響太多。組織樣品，從腫瘤組織大小（稱重）開始，裂解液體積都是精準(zhǔn)定量，操作過程也盡可能防止蛋白損失。有些人會說能夠電泳前蛋白定量，我將下一節(jié)討論蛋白定量不科學(xué)性，以及裂解液成份對定量干擾?！狙a充1】：細(xì)胞有凋亡或生長速率差異時，有一個最直接方法針對這個問題，實際上將細(xì)胞搜集下來以后，經(jīng)過離心，去除PBS，這時候你能夠拿出事先準(zhǔn)備好標(biāo)準(zhǔn)體積去比對，誤差小于50ul（因為標(biāo)準(zhǔn)品差值能夠設(shè)定為50ul),所以基本上肉眼偏差至多只有10ul（細(xì)胞體積），這種小差異在WB結(jié)果中能夠忽略不計。其實標(biāo)準(zhǔn)品有多個好處，平時能夠用于離心時平衡；能夠廢物利用一些用過effendorf管。最好不要用純水做標(biāo)準(zhǔn)品，我喜歡稀釋一些SDSLB做標(biāo)準(zhǔn)品，因為有藍(lán)黑色對比下，能夠更精準(zhǔn)估量體積。這相對比測標(biāo)準(zhǔn)曲線，再一一讀值還是快很多；蛋白電泳：電泳膠制備、配方、緩沖液配方，請參考分子克隆。經(jīng)驗之談，8%膠最底邊約36KDa，10%最底邊約25KDa，12%最底部約12KDa。8%膠能夠跑300KDa-36KDa之間任意蛋白，轉(zhuǎn)膜效率對WB結(jié)果影響都問題不大。12%，180KDa左右，轉(zhuǎn)膜效率對WB結(jié)果影響都問題不大（300KDa蛋白怎樣，沒有嘗試過）。電泳通常采取恒流，45mA-55mA（應(yīng)依照電泳儀器適當(dāng)調(diào)整，要注意儀器最高限壓；此條件適合gibcomodelV16型，膠寬20cm）。采取恒流優(yōu)點，確保最快速度完成電泳（電壓會逐步增大），省時且降低擴(kuò)散；不過因為電泳速度過快時會發(fā)燒而溶膠，所以你必須想方法散熱。散熱不好，條帶出現(xiàn)波浪狀。注意事項：1．聚丙烯酰胺30%母液會降解，要4度避光保留。2．APS會失效，10%APS通常保質(zhì)期才一個月左右。-20度分裝長久保留。3．注意TrisbuffPH值，以及平時所用水PH值。PH值改變會使帶型非常怪異，全部蛋白和溴酚藍(lán)壓成一條細(xì)線（即便在分離膠中），假如溴酚藍(lán)前有紅色染料，那么此染料彗星式拖尾從溴酚藍(lán)一直延伸到膠底部（溴酚藍(lán)此時涌動極遲緩，位于膠中上部）4．上下層式電泳裝置若漏液，哪邊漏液，電泳條帶往哪邊傾斜。內(nèi)外式電泳裝置漏液，則裝置處于短路狀態(tài)，液體會過熱。SDS膠可能局部自溶，條帶扭曲、變形。5．配膠用玻璃板和邊條應(yīng)及時洗凈。玻板未洗凈壞處很多。盡管玻璃看似平滑，不過一些細(xì)微凹陷處會凝結(jié)肉眼無法分辨膠顆粒（摸上去疙疙瘩瘩），其壞處是，在該部位極易造成不均勻膠塊，樣品經(jīng)過該處或電泳散熱不好，條帶變形。假如是RNA超薄膠，膠板顆粒會造成局部巨大氣泡，非常難于去除；蛋白膠也會造成一些小氣泡產(chǎn)生。玻板沒洗凈另一個壞處是，由中學(xué)物理知識可知，玻璃表面越光滑粘附越牢，未洗凈玻板會減弱和膠體間粘附力，拔梳子或邊條時會產(chǎn)生微小錯動，膠體下部出現(xiàn)大量氣泡（夾在玻板和膠之間，這個關(guān)系不大）；嚴(yán)重錯動會使上樣時，樣品從膠和玻璃之間間隙漏光，或者甚至膠和玻板分開。為防止拔梳子時錯動，可在電泳緩沖液中拔梳子（比水愈加好，有SDS潤滑）。判斷玻板是否洗潔凈，用手摸一下有沒有疙疙瘩瘩；最好用洗潔精之類，洗衣粉、肥皂都不好用。6．上樣時，不要把tip深入膠孔過深（或者采取細(xì)尖端拉長專用上樣槍頭），可能會錯開膠和玻板，樣品會泄露。7．未加樣孔應(yīng)添加高濃度SDSLB平衡，不然最外側(cè)條帶會拉寬變形。通常20ul樣品（含5ul4*SDSLB），可用8-8.5ul4*SDSLB平衡。同理，點markerlane也要加入一樣體積LB。LB若在室溫放置太久和新鮮在比重上會有差異，在新舊LB靠近地方，條帶會拉寬或擠壓變形。所以，同一塊膠上，煮樣及填空白所用LB應(yīng)一致。LB應(yīng)-20度保留。8．增加上樣量不一定會提升熒光信號強(qiáng)度。增加上樣量后果通常只能是讓你內(nèi)參粘連，全部蛋白條帶都扭曲變形。因為增加上樣量最多只能提升幾倍，而WB靈敏度是以10幾次冪量級，全部目標(biāo)蛋白信號唯一方案就是IP富集（可特異提升目標(biāo)蛋白濃度數(shù)百數(shù)千倍，并去除其它雜蛋白干擾）。增加上樣量另一個壞處是，原來高表示蛋白，諸如內(nèi)參，在一樣WB條件下，可能出現(xiàn)熒光灼燒式粹滅（一晃而滅）或者條帶中空。仍以6孔板80%以上匯合度為例，細(xì)胞裂解液和SDSLB通常都是投入200ul（最少80ul，這么面積培養(yǎng)板假如裂解液投入太少，回收時損失就太大，上樣就極難做到一致），而這種濃度條件下制備樣品，電泳時上樣量要控制在5-6ul，最少2.5ul，最多10ul，10ul時內(nèi)參基本已經(jīng)開始粘連成一條線，帶型出現(xiàn)波浪紋；當(dāng)然并非不能夠多上樣，再多對WB結(jié)果影響不大（沒有依然沒有），且條帶都很丑。9.不一樣品上樣時，可考慮將樣品體積調(diào)成一致或類似。假如一組IP樣品和一組細(xì)胞裂解液樣品，前者通常洗脫體積為15ul，剛好+5ul4*SDSLB達(dá)成常規(guī)20ul上樣體積；后者第8點提到只上5ul，一樣+5ulSDSLB（比重同，不會相互擠壓），最好補加10ulDDW使總體積一致。通常這么不一樣條件取得樣品，中間最好用“空白”泳道隔開（空白僅指無蛋白，仍應(yīng)加入8-8.5ul4*SDSLB），這么才能確保每條帶都很美觀。10.SDSPAGE膠配好暫時不用時，需用電泳緩沖液灌滿空間（拔去梳子和底邊邊條后間隙），用保鮮膜包裹預(yù)防液體蒸發(fā)，短期室溫或稍長久4度保留。個人習(xí)慣為，灌好分離膠用飽和正丁醇灌滿上層，保鮮膜包裹，次日再灌堆積膠。兩種方案都能夠。所以假如預(yù)計次日工作量較大，能夠提前灌好SDSPAGE。樣品是否一定需要定量再上樣？——不是，這是浪費時間一個操作。我們首先來討論一下蛋白定量科學(xué)性。蛋白定量首先需要一個參考系（標(biāo)準(zhǔn)蛋白），參考蛋白通常選擇BSA，也就是說你所謂定量是對應(yīng)于BSA濃度一個參考值。這里面存在一個問題，即忽略了蛋白折疊和空間構(gòu)象對光吸收、折射影響；不一樣蛋白折疊和構(gòu)象還會影響顏料分子嵌入。所以你其實默認(rèn)將全部蛋白等同于BSA在溶液中折疊狀態(tài)、光吸收情況下，然后做出一個相對判斷，這就存在一個“系統(tǒng)誤差”——還不算上測量誤差等等，就已經(jīng)很不準(zhǔn)確了。其次，裂解組織或細(xì)胞時候，那些裂解液中，一些溶劑本身會使CoomassieG250或者Bradford法（實際也是Coomassie染色）顯色，尤其是去污劑之類；比如NP40，就會使Coomassie顯藍(lán)色，能夠完全覆蓋掉蛋白與Coomassie作用產(chǎn)生藍(lán)色。所以，假如你裂解液里面含有這類物質(zhì)，所謂蛋白定量實際是NP40顏色和蛋白染色疊加，根本不會符合標(biāo)準(zhǔn)蛋白曲線線性規(guī)律，自然定不準(zhǔn)?！拘枰f明：我現(xiàn)在只知道NP40會這么，因為我們從來不去定量，沒有做過更深入研究?！繉嶋H上確保你內(nèi)參一致，是從樣品制備開始，上節(jié)末尾有提到，不贅述。假如你從制備樣品時就注意過定量問題，實際上通常內(nèi)參差異不會太大。假如真有差異，通常我們會先跑少許樣品，目標(biāo)是讓Actin或tubulin更清楚、不會粘連、不會過曝光。從而在第二輪跑正式結(jié)果前，依照第一輪內(nèi)參熒光信號做微調(diào)，大致能做到相當(dāng)；最多可能需要第三輪。以上試驗?zāi)軌蚓珳?zhǔn)到0.1ul差異（我很多體外生化試驗之前調(diào)整酶量就是這么進(jìn)行，此時根本不可能有足夠蛋白讓你去定量）。當(dāng)然憑曝光強(qiáng)弱調(diào)整上樣量前提是，你WB技術(shù)很穩(wěn)定，很可靠，這是需要相當(dāng)多經(jīng)驗積累，假如你一時掌握不了，能夠讓經(jīng)驗更豐富師兄師姐或者導(dǎo)師幫忙。順便提到，有些人問過用QuantityOne等定量軟件對光密度定量后計算差異從而調(diào)整上樣體積是否能夠？——不能夠。因為WB結(jié)果經(jīng)過多重放大，精準(zhǔn)計量只代表相對于對照組相對比值，與實際比值還是有誤差，所以按計算值更改上樣量仍會出現(xiàn)偏差。假如非要做定量話，要注意你裂解液配方，把每種溶劑都先加入到顯色液中嘗試一下，防止那些本身會顯色物質(zhì)出現(xiàn)在你裂解液中；當(dāng)然，一些物質(zhì)去除可能影響對組織蛋白提取。所以這是一個兩難問題。轉(zhuǎn)印——轉(zhuǎn)印效率對WB結(jié)果影響并不如書本和網(wǎng)絡(luò)上宣揚那么大！首先必須澄清是，很多時候新手會把WB結(jié)果無信號歸咎于轉(zhuǎn)膜不夠充分，實際上轉(zhuǎn)膜效率對最終止果影響所占比重并不高，真正取決定性原因是抗體識別能力強(qiáng)弱，以及怎樣正確使用抗體，這個問題下節(jié)討論。有一個簡單例證，Biorad提供3mm厚濾紙首次使用時，通常轉(zhuǎn)膜效果不理想（從預(yù)染marker深淺可知），但對多數(shù)通常豐度蛋白檢測沒有任何影響（提議少用這種新濾紙做那種含量尤其稀少或者轉(zhuǎn)膜非常困難蛋白）。沒有很好策略能夠處理這個新濾紙問題；嘗試過浸泡（會泡爛）、預(yù)電泳（會稍微好點）等等，效果均不理想。通常，最初一兩次使用就是用于轉(zhuǎn)通常蛋白。每次用完后清水稍微沖洗一下表面鹽分（要控制水流；水流太大，紙張會爛掉），晾干再用；只要沒沖爛能夠一直重復(fù)使用。其次，盡管轉(zhuǎn)膜效率不起決定性作用，但因為WB流程相對較長，所以每個步驟疊加作用會被級數(shù)放大，所以在試驗每個步驟我們?nèi)詴幱雍?，所以以下仍會深入探討怎樣提升轉(zhuǎn)膜效率。針對提升轉(zhuǎn)膜效率，個人認(rèn)為最先應(yīng)該考慮到是儀器選取。這里不是歧視“madeinChina”，國內(nèi)廠家極少重視不停提升自己產(chǎn)品品質(zhì)，走低端策略，對于電泳儀這種技術(shù)含量不高儀器倒能夠湊合；但說到轉(zhuǎn)膜儀，能把一個簡單勻場電極做好還真不多（就我道聽途說，國外廠家為了使電極之間場強(qiáng)愈加均勻，那種大塊金屬板表面是鍍過極薄白金層）；所以轉(zhuǎn)膜效率和均勻方面孰優(yōu)孰劣不言而喻?，F(xiàn)在，個人使用過國產(chǎn)電轉(zhuǎn)槽（濕轉(zhuǎn)）唯Tanon仿Biorad還能夠（算替它們無償打個廣告吧，Tanon仿bioradmini3型電泳儀，在一些方面（主要是操作）上還優(yōu)于Biorad原裝；現(xiàn)在我認(rèn)為“中國制造”靈魂就是仿造并超越前者）；半干轉(zhuǎn)儀一律進(jìn)口，用過Biorad、amersham和英國企業(yè)scie－plas。PS：批評一下Biorad。Biorad半干轉(zhuǎn)儀，其硬質(zhì)塑料外殼會莫名其妙碎裂（絕非摔裂、磕碰，因為底面通常放在桌上后除定時需要清洗去除殘留鹽漬，基本不會移動；即便如此它自然就會碎裂），以致于其關(guān)鍵組件未壞情況下，因外殼碎裂不得不報廢該儀器（其外殼里包裹電源線，外殼碎裂，電源則無法接通，造成儀器報廢——我們先后買過3臺都是這么毛病，其間間隔了3年，不能必定最近Biorad有沒有改進(jìn)這個問題；假如沒有，我想市場遲早會被其余企業(yè)所取代）對這三款產(chǎn)品，Biorad外殼有顯著質(zhì)量缺點，輕易過早報廢；amersham獨特蜂窩式設(shè)計確實對轉(zhuǎn)膜效率有所提升，但蜂窩式使得與“三明治”接觸面降低，電轉(zhuǎn)時散熱不太好，做大蛋白（半干轉(zhuǎn)儀也能夠做大蛋白轉(zhuǎn)膜，效率確實不如濕轉(zhuǎn)，但抗體好、蛋白豐度通常時仍可采?。╅L時程（3hrs）轉(zhuǎn)膜需要在4度冰柜或coldroom進(jìn)行；英國產(chǎn)品，價格較高，企業(yè)不太知名國內(nèi)不一定有代理，但質(zhì)量和散熱都非常好。這里談到了半干轉(zhuǎn)和濕轉(zhuǎn)。這兩種轉(zhuǎn)印方法各有優(yōu)劣。濕轉(zhuǎn)適合全部蛋白，轉(zhuǎn)膜效率最好，但靡費試劑、溶液，對普通分子量大小蛋白轉(zhuǎn)染操作時間長于半干轉(zhuǎn)（下文會詳細(xì)給出條件）；半干轉(zhuǎn)適合分子量較小蛋白，省時、省試劑。蛋白分子大小怎樣界定呢？習(xí)慣上認(rèn)為150KDa以上為大蛋白，其余均屬于小蛋白，當(dāng)然這只是一個相對標(biāo)準(zhǔn)。所以，通常對大蛋白轉(zhuǎn)印多數(shù)人會選擇長時程濕轉(zhuǎn)，那么剛才提到amersham半干轉(zhuǎn)儀缺點實際上沒太多實質(zhì)意義，何況還能夠外加條件填補；而且用半干轉(zhuǎn)做大蛋白轉(zhuǎn)印原來就是高手在懸崖上跳舞，此時轉(zhuǎn)膜效率是否更高已經(jīng)沒有任何意義——我說過轉(zhuǎn)印效率對WB結(jié)果不起決定原因。濕轉(zhuǎn)、半干轉(zhuǎn)緩沖液配方請參考分子克隆，有必要指出是，實際上用半干轉(zhuǎn)緩沖液進(jìn)行濕轉(zhuǎn)效果也非常理想，通常這種緩沖液能夠重復(fù)使用數(shù)次（30V，～35V附近時候，保險會自動跳掉、切斷電轉(zhuǎn)儀電源。至于UK，即使整張大板膠室溫電轉(zhuǎn)3hr以后，最大電壓仍為18V（所以足見其散熱性能優(yōu)良）。注明：以上半干轉(zhuǎn)儀時間要求是針對PVDF膜，這里面有一個很有趣問題。盡管廠家一再表明PVDF膜比NC膜對蛋白截留更高（但NC帶負(fù)電性，理論上它吸附量應(yīng)該更高，所以通常一樣使用TBST這種低鹽洗液背景比PVDF膜高），但PVDF膜對小分子截留顯著不如NC膜，所以交聯(lián)在預(yù)染marker上顏料小分子很輕易穿過PVDF膜，造成轉(zhuǎn)膜過分假象（除可考慮提升甲醇濃度至25%外，也能夠考慮增加marker上樣量）；NC膜沒有這種問題，所以通常它轉(zhuǎn)膜時間也是小蛋白1hr、大蛋白3hrs，電流控制在200-300mA（16cm*9cm大膠300mA，假如膠面積小很多能夠考慮降低，實際上相當(dāng)于2.5-3mA/cm2左右）。NC膜唯一不如PVDF膜地方，在我看來是它強(qiáng)度：干燥膜易碎。當(dāng)然現(xiàn)在一些廠家為處理這個問題，將NC成份涂在另一個介質(zhì)表面，這種膜支持強(qiáng)度和PVDF膜類似，但轉(zhuǎn)膜效率稍差于純NC膜，且有顯著正反面；所以制作轉(zhuǎn)印三明治時候要尤其注意正反面。另外，20KDa以下蛋白宜采取0.22uM孔徑轉(zhuǎn)印膜，但也不是一定必須。對于大蛋白轉(zhuǎn)印，很多書本提議采取低濃度膠，如6%SDS。但實際操作發(fā)覺，6%太軟，制作轉(zhuǎn)印三明治操作非常麻煩；且內(nèi)參如Actin、tubulin都在45KDa附近，而6%膠底邊溴酚藍(lán)指示60KDa左右，除非采取壇子上有些人提過灌不一樣濃度膠或者梯度膠，不然需要同時跑兩塊膠，所以也不是很推薦。個人經(jīng)驗認(rèn)為300KDa以下8%膠（底邊36KDa）都能夠勝任，能夠適當(dāng)調(diào)整選擇7-8%膠能夠兼顧內(nèi)參和大蛋白。轉(zhuǎn)膜最好在低溫進(jìn)行（高溫會局部溶膠或降低轉(zhuǎn)膜效率），盡管很多半干轉(zhuǎn)儀沒有詳細(xì)要求，但用預(yù)冷過電轉(zhuǎn)液濕濾紙比未預(yù)冷轉(zhuǎn)印效率更高。所以，有條件提議濕轉(zhuǎn)、半干轉(zhuǎn)均在低溫（4度）進(jìn)行。另外，濕轉(zhuǎn)緩沖液能夠考慮轉(zhuǎn)印前-20度預(yù)冷，時間不能長于2hrs，不然電泳液凍結(jié)；mini3型有內(nèi)置冰槽，冰槽置-80度預(yù)冷。制作轉(zhuǎn)膜三明治過程中，書中強(qiáng)調(diào)過濾紙、膠、膜大小最好一致，不然沒有膠、膜隔開部分濾紙會因為直接接觸而產(chǎn)生局部短路，降低內(nèi)阻增加電（壓）流，造成升溫過快。但進(jìn)口儀器隨廠原包裝附帶濾紙有限，假如每次都切割新濾紙，消耗過快、首次使用膜轉(zhuǎn)膜效率不高，且增加額外操作。所以，實際上濾紙大一些也不太要緊，不過我會選擇已經(jīng)切割好和膠面積最靠近濾紙；通常膜大小會嚴(yán)格控制在與膠面積一致或略小一點點。操作時在確保每一層均無氣泡前提下，疊好后再碾壓幾個往返，力道要均勻、恰好；力量過大，膠會被拉伸，條帶會扭曲、變形。碾壓目標(biāo)不是為了驅(qū)趕氣泡（完全能夠做到疊加時候每一層都無任何氣泡；諸如采取多層薄濾紙時能夠一張張疊加），更主要作用是讓膜和膠貼得更緊密。能夠了解是，對于蛋白分子大小而言，膠和膜之間間距是數(shù)十萬倍計，所以更緊密接觸無疑是轉(zhuǎn)膜成敗關(guān)鍵。膠和膜需不需要泡呢？不少企業(yè)試驗講座時提出泡膠、泡膜，實際操作中沒有發(fā)覺泡和不泡轉(zhuǎn)膜效率有多大差異。實際上，膠只需要在電轉(zhuǎn)液中浸一下即可（能夠降低與濾紙或者膜之間氣泡）；而膜也只要濕掉沾上電轉(zhuǎn)液即可，一樣多沾些緩沖液會有利于降低氣泡（PVDF要先用甲醇濕潤再投入緩沖液；NC直接進(jìn)緩沖液）。怎樣監(jiān)控轉(zhuǎn)膜效率呢？在早期，鄙人亦依據(jù)分子克隆介紹，采取立春紅染膜。只是日后發(fā)覺此操作不但增加額外操作時間，而且不能說明任何問題，于是拋棄之。首先，立春紅（也包含考染膠）靈敏度和HRP-ECL體系靈敏度相差太遠(yuǎn)，即使立春紅染膜無顏色，也無法提醒WB結(jié)果會不會失敗（考染膠無顏色也不能說明轉(zhuǎn)膜充分了，除非你銀染），你依然得繼續(xù)后面操作；相反靶蛋白區(qū)域有顏色，亦無法提醒靶蛋白就轉(zhuǎn)膜完全了，可能只是另外一個分子量大小相近蛋白。所以，不論立春紅染膜失敗或成功，你都必須進(jìn)行后續(xù)操作。而立春紅染膠不但增加額外操作時間，而且增加一輪漂洗操作，對膜和膜上蛋白都不好。那么為何不采取更直觀預(yù)染marker做轉(zhuǎn)膜監(jiān)控依據(jù)呢？理論上，同時轉(zhuǎn)膜、顏色是交聯(lián)到蛋白上，所以顏色有多深表明有多少蛋白轉(zhuǎn)印到膜上，非常直觀、不會增加任何額外操作（固定marker上樣量非常必要）。當(dāng)然上面提到針對PVDF膜，因為對小分子截留局限，顏料分子會在高強(qiáng)度轉(zhuǎn)印過程中從交聯(lián)蛋白上脫落并穿過膜（顏料與蛋白交聯(lián)得過深會使整個lane糊掉；太緊（多）可改變蛋白構(gòu)象使遷移率改變。所以多數(shù)情況下顏料和蛋白之間是一個不穩(wěn)定交聯(lián)，這意味著在一些條件下，顏料會從交聯(lián)蛋白上脫落，又因為膜分子孔徑以及膜對不一樣物質(zhì)吸附能力差異，顏料小分子會輕易穿過膜到濾紙反面，而蛋白則被牢靠截留在膜上），造成轉(zhuǎn)膜過分假象。現(xiàn)在你知道有這種局限，要么更換NC膜；要么采取上面提到非常穩(wěn)定轉(zhuǎn)膜條件、注意必要細(xì)節(jié)，就可從根本上忽略掉其對轉(zhuǎn)膜效率指示，而把預(yù)染marker僅僅作為一個分子量大小指針，當(dāng)然同時可確認(rèn)之前轉(zhuǎn)膜操作無誤（沒有插反電極，放反膜），也可為后續(xù)抗體孵育操作時膜正反面做必要提醒。不一樣企業(yè)預(yù)染marker效果不太相同，通常NEB和invitrogen常規(guī)分子量預(yù)染marker要上8-10ul，MBI只要5ul（膠大小20×30cm），Biorad－mini3型（8.2×7.4cm)MBI最低2.5ul轉(zhuǎn)膜后就足夠清楚。抗體孵育——WB真正難點：抗體使用是一個藝術(shù)，一個抗體一個脾氣。對WB結(jié)果有決定性影響原因是抗體效價和假如正確使用手中抗體。不論你怎樣提升自己轉(zhuǎn)膜技術(shù)，高效和低效之間往往只有數(shù)倍差異，而抗體效價能夠差數(shù)千倍以上；一樣，正確使用抗體能夠確保抗體效價不被過分拮抗，尋求特異性和非特異性背景之間差異最大化。封閉最短能夠縮減到5min：很多人把高背景或者黑板，認(rèn)定為封閉不充分，其實這也是沒有吃透WB（說實話，經(jīng)常看到壇子上很多人這么給人答疑，非常無語）；實際上封閉（極端點）也是個可有可無步驟，真正對降低背景起關(guān)鍵作用是抗體稀釋液中組分。當(dāng)你抗體使用次數(shù)較多時，基本不用封閉也能夠有較低背景；假如抗體很新，其實封閉最短能夠縮減到5min（沒試過更短，不一定不能夠）。那什么造成高背景甚至黑板呢？抗體質(zhì)量不太好（主因），或者抗體稀釋液配方有問題（增大抗體稀釋比略微有所改進(jìn)）。封閉液配方能夠和抗體稀釋液相同，也能夠不一樣；通常封閉液是最簡單（單方）抗體稀釋液，而抗體稀釋液可能是復(fù)方。封閉極少出情況。不過在milk做封閉劑封閉液中，milk顆粒未完全溶解時，微小顆粒會粘附在膜上增加星點狀背景。緊接封閉操作是抗體孵育，之間不要用TBST漂洗?？贵w孵育成敗關(guān)鍵首要在抗體本身質(zhì)量，包含抗體效價和背景強(qiáng)弱，然而一向商品化抗體質(zhì)量參差不齊。各家生產(chǎn)抗體中質(zhì)量問題最嚴(yán)重是scbt抗體，但它們價格卻是最廉價。其實，scbt在美國售后服務(wù)還是相當(dāng)不錯，只要按他們要求操作依然能舉證抗體質(zhì)量問題，能夠更換、交換（你指定他們銷售另外一個抗體），有時候還會附送一些ProAbeads之類，所以不奇怪它普及率；也正因為此，假如你參考文件話很輕易找到這家企業(yè)?？上В趪鴥?nèi)代理商不可能提供對應(yīng)服務(wù)，所以購置他們商品存在不小風(fēng)險。所以，通常我更推薦sigma和Abcom、R&D等。諸如Sigma企業(yè)銷售Actin，cat.A5316，cloneAC-74，Mab更是作為新手練習(xí)專用抗體；它背景很低，效價很高，能夠1：30,000稀釋（是普通一抗效價30倍）。另外，盡管cellsignaling是做磷酸化抗體起家企業(yè)，但它們抗體質(zhì)量總體感覺也不好，所以有其它企業(yè)能夠選擇時，我們會刻意防止購置cellsignaling產(chǎn)品，諸如Akt總抗和Ser473（這兩種抗體R&D產(chǎn)品效價不錯）。（尤其注明：前幾年CSTAKT抗體識別條帶在55KDa左右，而其余企業(yè)均認(rèn)定為60KDa；最近還有戰(zhàn)友提問這個抗體，重新檢索了一下，應(yīng)該是原AKT抗體（包含磷酸化）已經(jīng)被CST自己下架了，從現(xiàn)在幾個抗體示意圖看，大小也已與其余企業(yè)一致；所以，要不要買取決你自己）抗體企業(yè)在出售抗體時候，在廣告上會玩很多花樣。A.不給整張膜標(biāo)識圖示。很多抗體質(zhì)量不好，背景高雜帶多，假如靶蛋白區(qū)域較潔凈時，他們通常只給很窄一條靶蛋白區(qū)域圖例。B.不給內(nèi)源性蛋白標(biāo)識圖示，用IP樣品取代。經(jīng)過IP能夠富集抗原，降低雜蛋白，通常很輕易拿到背景很潔凈，信號很強(qiáng)圖例。C.用制備抗體時高表示多肽做陽性樣品，不給全長蛋白圖例。因為多肽能夠IP富集，且不存在空間折疊問題（通常裸露在外），所以很輕易標(biāo)識。除以上花樣外，不少抗體用途上還有局限，所以挑選抗體時要睜大眼睛。另外，有一點值得注意是，scbt銷售抗體表面上很多（通常1ml，而別企業(yè)通常是200ul或者100ul），然而實際上它濃度也僅為0.2λ，所以實際上他們抗體質(zhì)量也和其余企業(yè)沒區(qū)分都是200ug（常規(guī)）。所以在早期，我一直強(qiáng)調(diào)假如固定即用型一抗?jié)舛龋ㄏ♂屢豢梗?ug/ml時，scbt抗體最好稀釋比為1：200。不過最近發(fā)覺，實際上他們抗體1:2K稀釋效價也不錯，所以可能其余企業(yè)一抗能夠深入提升稀釋比?，F(xiàn)在判斷當(dāng)初scbt抗體之所以采取1:200稀釋，實際上是因為自制ECL不夠靈敏，所以提議用靈敏性愈加好ECL，這么能夠降低抗體消耗量，深入降低試驗成本。一抗通常4度過夜，效率較常溫1-1.5hrs高；二抗通常1:5K稀釋，室溫0.5-1hr（過久并不會顯著提升信號強(qiáng)度甚至?xí)p弱（相當(dāng)于洗膜），同時造成高背景深入影響特異與非特異熒光信號強(qiáng)度間對比。孵育時間過久還會迫使你延長TBST時間，這反抗原識別能力較弱抗體更致命）。洗膜通慣用TBST，也能夠考慮高鹽洗膜液（NaCl0.5M）；洗膜時間通常10min*3或者5min*4?？贵w孵育和洗膜時，搖床速度不能過快也不宜過慢，需要簡單探索一下。聊完以上那些淺顯基本常識，接下來談我認(rèn)為最麻煩：首先，抗原抗體識別原理物理學(xué)解釋，抗體孵育過程實際上就是一個競爭結(jié)合動力學(xué)過程。因為抗原和抗體特異性結(jié)合效率是非特異性結(jié)合數(shù)百萬——數(shù)十億倍，所以當(dāng)特異性抗體與非特異性‘抗體’（不好描述，指添加在抗體稀釋液中封閉蛋白，我們能夠把它們看成非特異性一抗）競爭時，盡管抗體稀釋液中封閉蛋白濃度是一抗?jié)舛?0K：1以上，在碰撞幾率相同條件下，因為時間積累加孵育過程中重復(fù)漂洗（孵育抗體要搖擺，對吧），特異性一抗積累了識別、結(jié)合優(yōu)勢。一樣在TBST等漂洗情況下，因為親和力等原因，使得一抗很牢靠并深入增加對比優(yōu)勢，再經(jīng)過2抗特異性積累和ECL最終放大形成特異性條帶和非特異性背景之間熒光信號巨大差異。由以上碰撞結(jié)合、親和力差異這些基本現(xiàn)象，我們能夠解釋W(xué)B中出現(xiàn)現(xiàn)象。1.在樣品制備章節(jié)中，我強(qiáng)調(diào)PBS漂洗去培養(yǎng)基中BSA作用。當(dāng)初只描述了不漂洗后果，是在BSA位置任何抗體都能夠非特異性結(jié)合從而顯影。用碰撞原理去解釋：當(dāng)雜帶很濃時候，抗體特異性已經(jīng)毫無意義，它只符合物理定律中碰撞幾率原理；因為你雜帶濃，碰撞幾率大，粘附一抗機(jī)會多，所以它就會顯出來，但切記這是雜帶。當(dāng)雜蛋白含量高到一定程度，“任何”一個一抗都能夠在該位置顯出條帶。所以，用條帶深淺去判斷是否是靶蛋白，這是非常不科學(xué)。在默認(rèn)抗體有效情況下，假如抗原靠近區(qū)域沒有雜帶，背景潔凈，依據(jù)分子量大小能夠初步確認(rèn)靶蛋白位置；假如有雜帶，并不一定是特異性條帶就比雜帶亮，可能雜帶蛋白濃度大，非特異性粘附一抗更多?，F(xiàn)在判斷雜帶和靶蛋白唯一標(biāo)準(zhǔn)是分子量；而當(dāng)分子量大小類似時，只有經(jīng)過增加過表示或IP純化樣品做陽性對照，或者KD該蛋白樣品做陰性對照一起電泳轉(zhuǎn)膜，才能準(zhǔn)確區(qū)分靶蛋白和雜質(zhì)。（用IP或KD樣品也是驗證商品化抗體是否有效可靠方案）2.WB結(jié)果白板（無信號）和黑板（高背景）。從抗體孵育角度解釋白板和黑板問題（當(dāng)然也可能與ECL顯影關(guān)于，此點下一節(jié)有闡述），白板主要是可能是抗體本身效價不高，或者抗體稀釋液中封閉蛋白過多，競爭結(jié)合時封閉蛋白完全擠掉了特異性一抗，特異性條帶和非特異性背景一樣結(jié)合強(qiáng)度——無信號。黑板，也主要是因為抗體效價不高，而抗體稀釋液中封閉蛋白拮抗作用又沒有完全發(fā)揮，此時無法有效識別抗原一抗會等效粘附轉(zhuǎn)印膜任何位置，顯影后整張膜全黑。有時候膜靠近全黑，但能夠若有如無觀察到靶蛋白，出現(xiàn)問題原因即使仍是抗體效價不高，封閉蛋白不能完全起到作用，不過此時能夠經(jīng)過改變抗體稀釋液配方，提升特異性和非特異性結(jié)合信號差異，降低背景?！斑@點非常主要”——當(dāng)你抗體標(biāo)不到抗原時（白板），先弄出條帶（黑板），再處理黑板（高背景）問題。第一步應(yīng)該是經(jīng)過倍比降低一抗稀釋比（從1:1K降到1:500到1:250到。。。；注：二抗稀釋比不要輕易改變，增加二抗?jié)舛葘B結(jié)果不會有太顯著改變），探索到一個能夠標(biāo)出信號條件。此時，因為一抗?jié)舛冗^高，背景可能非常高，但背景問題能夠再調(diào)整，有沒有特異性條帶卻沒方法改變；實在沒有靶蛋白信號，只能更換別企業(yè)生產(chǎn)抗體。那么怎樣經(jīng)過改變抗體稀釋液配方，尋求抗體孵育最好條件呢？首先要認(rèn)清，抗體稀釋液沒有一個絕對通用配方；一個抗體一個脾氣。其次，抗體稀釋液配方要兼顧與特異性抗體競爭抗原強(qiáng)度，以及對其余區(qū)域封閉強(qiáng)度兩方面平衡?，F(xiàn)在，抗體稀釋液中能夠充當(dāng)封閉蛋白主要有milk，BSA和gelatin，似乎極少樣子。。?？墒?，你有沒有考慮過“復(fù)方”？——這下配方無限多了吧。1.采取milk，BSA和gelatin單方。3%milk，5%BSA，<=0.4%gelatin，并依照實際情況改變（若出現(xiàn)白板，請降低封閉劑濃度。；黑板多加）。gelatin大家可能比較陌生，不過假如你翻翻抗體企業(yè)賣給你原裝抗體里面液體配方，你會發(fā)覺很多抗體溶液里都有它。2.很多情況下單方濃度很高了，背景問題仍不能處理。那么請嘗試兩兩或者三種不一樣百分比混合。不過有些細(xì)節(jié)還是要自己探索，比如gelatin＋BSA時，gelatin濃度不能無限提升（會完全競爭掉抗原抗體特異性結(jié)合，造成白板），BSA濃度較隨意。3.抗體稀釋液可用低鹽濃度TBST，也可用高鹽濃度緩沖液（NaCl0.5M）以降低背景；不過切記，有抗體對鹽濃度敏感，包含構(gòu)象和溶解度，所以需要嘗試。假如以上策略依然無法處理高背景，可將稀釋好一抗先跟平時試驗剪切下來membrane邊角料（新）放在一起孵育個把小時再用。假如還不行，徹底無解，結(jié)論抗體太差；請更換別企業(yè)或者抗別區(qū)段同種抗體。這三種封閉蛋白差異：milk和gelatin封閉效果不錯且價格廉價，但milk輕易發(fā)霉變質(zhì)，且國產(chǎn)milk脫脂不充分亦增加背景、拮抗抗原抗體結(jié)合（拮抗與抗原結(jié)合尤其突出；更不知道三聚氰胺會不會影響抗原抗體結(jié)合或者ECL?。浚?；BSA封閉效果不佳，且價格較昂貴。個人推薦gelatin，gelatin主要成份是骨膠原，蛋白很大，但能夠經(jīng)過加熱打斷成小蛋白，從而實現(xiàn)封閉各種分子量大小蛋白。通常，我會將gelatin加到TBST中后直接滅菌，滅菌過程中，不溶gelatin會逐步溶解；因為gelatin能夠滅菌（milk不能夠），所以一樣條件下，gelatin存放時間顯著長于milk。實際上，抗體能夠重復(fù)用很久（通常通?？贵w常規(guī)稀釋比，能夠連續(xù)用一個月以上；對于老手用過2、3次舊抗體更prefer，所以背景降到很低而效價正是最高時候），通?？贵w最終失效原因不是因為使用次數(shù)過多，而是染菌；比較舊抗體都會有很多沉淀在底部，更長時間還會有異味。稀釋一抗靠添加NaN3并于4度保留延長使用時間；二抗不能加NaN3，但放在-20度重復(fù)凍融延長使用壽命（抗體并非絕對不能夠凍融；只是高濃度原始管抗體凍融對效價會有較大影響）?？贵w稀釋液（一抗、二抗稀釋液也可同也可不一樣）和封閉液能夠相同，能夠不一樣，因為抗體稀釋液能夠采取復(fù)方，所以即使混合了少許，不會反抗體使用產(chǎn)生較大影響。不過封閉液用milk時，gelatin稀釋一抗混入少許milk會影響其使用壽命。因為以上很多可變原因，實在無法總結(jié)出一個萬金油式抗體稀釋液（只能是多數(shù)通用），所以對待詳細(xì)問題時，請詳細(xì)對待（多花點心思探索吧）。原裝抗體保留：1.分裝。每次一管，不過可能太多占地方，而且還會有粘壁損失，不是很推薦。2.1：1加甘油，凍于-20度，可長久保留，此方法實際上也被很多國內(nèi)試劑企業(yè)廣泛采取，諸如博士得，中杉，它們小包裝進(jìn)口抗體通常都是1：1添加甘油保留于-20（不信去查查）。值得注意是：不是全部抗體都能夠1：1添加甘油，要以抗體說明書為準(zhǔn)，假如說明書中本身存在甘油，或特殊注明外，通常能夠采取。顯影——淬滅禍因當(dāng)抗體孵育、TBST漂洗結(jié)束后，進(jìn)入ECL顯影步驟。當(dāng)然，現(xiàn)在國內(nèi)一些試驗室已經(jīng)換用儀器掃描熒光信號，而我們更是二抗直接連熒光蛋白連ECL和常規(guī)底片顯影都省略了，所以以下所討論一些細(xì)節(jié)問題可能不再出現(xiàn)。首先壇子上還有少數(shù)試驗室處于DAB顯色時代，規(guī)勸一句，都走到最終一步了就不要節(jié)約了；DAB顯色靈敏性是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠?，F(xiàn)在較為流行仍是化學(xué)發(fā)光法，下面簡述一下其原理：交聯(lián)在二抗上HRP酶能夠特異水解過氧化物產(chǎn)生化學(xué)能；ECL中主要包含兩種成份，催化劑和中間遞質(zhì)（白色瓶子主要是過氧化物如雙氧水）。催化劑作用不用廢話了，其中間遞質(zhì)主要是吸收化學(xué)能并將其傳遞到luminol之類化合物上產(chǎn)生電子躍遷從而激發(fā)熒光。所以催化劑效率和中間遞質(zhì)傳遞效率直接影響熒光強(qiáng)弱。本人曾自制過ECL并嘗試改良，其間發(fā)覺很多化合物、金屬離子如Fe、Cu等能催化并高效傳遞能量，且不依賴于HRP濃度，熒光信號能瞬間曝強(qiáng)；這其實與下文提到一些粹滅原因有聯(lián)絡(luò)。當(dāng)初我自制ECL最大毛病在于穩(wěn)定性不好，同理，商品化ECL一樣也有保質(zhì)期問題，往往最先失效組分就是過氧化物，盡管他們必定添加過抗還原劑。其實，檢驗ECL是否失效方法很簡單，取稀釋即用型二抗1-2ul加至ECL混和液中觀察熒光強(qiáng)度，即可知道ECL是否失效。商品化ECL價格并不廉價，所以ECL孵育最好方案是：將ECL滴加在保鮮膜上或潔凈支持物上，如廢棄舊底片、塑料盒，有機(jī)玻璃盒等等（注意，國產(chǎn)保鮮膜很多質(zhì)量不過關(guān)，有兩種潛在問題，下面詳述），然后倒扣膜于保鮮膜上，夾住一個角往返拖動數(shù)次至ECL均勻（有產(chǎn)品說明書要求孵育1min）。另外平鋪一張潔凈保鮮膜，將膜揭下控干ECL、倒扣包好，然后顯影。mini3型膠整張膜孵育，ECL總體積0.7-1ml足矣。哪些原因會影響熒光信號強(qiáng)弱呢？（這部分實際上與造成熒光淬滅原因部分重合）1.保鮮膜質(zhì)量。a.國產(chǎn)保鮮膜，很多廠家偷工減料打價格戰(zhàn)，造成保鮮膜很薄亦破損。ECL滴加到保鮮膜上輕易從肉眼不易分辯小孔泄露，首先ECL反應(yīng)不充分，另首先ECL所含液體會溶解試驗臺上殘留未知化學(xué)藥品顆粒（可能你或其余人曾經(jīng)不小心打翻過某種化合物）、灰塵等等，造成熒光淬滅。在簡述原理時，我曾經(jīng)提到過很多化合物、金屬離子能直接催化過氧化物水解，在極短時間內(nèi)消耗掉全部HRP酶，熒光轉(zhuǎn)瞬即逝。b.保鮮膜化工原料或拉制過程中，殘留未知化學(xué)試劑，引發(fā)熒光淬滅；廉價保鮮膜問題尤多?，F(xiàn)在，國產(chǎn)就“妙潔”比較過關(guān)，保鮮膜厚度和化學(xué)物殘留都不影響ECL顯影。假如買不到合格保鮮膜，也能夠用其余物品代替；但要尤其注意這些支持物表面潔凈，最好不要有任何化學(xué)試劑殘留，包含風(fēng)干TBST鹽結(jié)晶顆粒。2.ECL孵育結(jié)束后膜需要控干。中學(xué)物理學(xué)過水會吸收光譜，所以任何液體包含ECL溶液本身都會干擾熒光強(qiáng)度，所以ECL孵育結(jié)束時需要控干。通常夾起膜，讓膜一角或一邊接觸吸水紙；不過請注意不能讓膜完全干掉。一些信號較弱ECL，膜徹底干掉后熒光會消失；很好試劑盒，熒光相對穩(wěn)定，但完全吸干以后，背景熒光也會升高，而且會嚴(yán)重影響重新標(biāo)識新抗體時背景。所以，按照我方法，讓自由流下多出ECL被吸走就好。3.控干膜要仔細(xì)用保鮮膜包被，預(yù)防接觸外界異物造成熒光淬滅；同時，包裹保鮮膜時要細(xì)心，盡可能不讓正面保鮮膜和膜之間出現(xiàn)皺褶。皺褶地方會堆積多出ECL，要么形成一條熒光亮線；要么因為液體吸收熒光或者局部區(qū)域HRP過分消耗，呈線條狀淬滅。4.在膜放入壓片夾之前，最好肉眼觀察一下熒光信號強(qiáng)弱，這有利于判斷試驗可能出現(xiàn)問題。很多人提問看見很強(qiáng)熒光了，但怎么壓片都沒有信號，那么就是快速淬滅（閃滅，再怎么快速操作也拿不到這種情況下熒光信號）造成；有這個觀察最少能夠判斷ECL孵育之前試驗操作應(yīng)該問題不大，而問題主要是淬滅。假如你省略這個步驟，那問題就非常復(fù)雜了，因為之前任何操作都可能造成白板，根本無法判斷。除上述問題以外，還有哪些原因會造成熒光淬滅呢？1.抗原濃度太高，熒光信號過強(qiáng)，快速淬滅。在電泳章節(jié)就曾提過，假如上樣量太大，不但條帶會粘連、彎曲，更可能造成淬滅。因為局部區(qū)域過多HRP酶會快速消耗底物呈富氧態(tài)，條帶出現(xiàn)燒灼樣（取出膜會發(fā)覺一條顯著暗黃色帶），熒光信號會閃滅或者條帶空心（條帶灰黑不實，則可能是顯影液靠近失效）。2.抗原濃度太低，熒光信號太弱，相對慢一點淬滅。可能第一次壓片能夠取得很弱條帶，隨即都不可見。3.ECL試劑質(zhì)量。除過氧化物因接觸空氣被逐步還原外，ECL成份通常都不穩(wěn)定。如呈遞電子躍遷能中間遞質(zhì)其化學(xué)性質(zhì)就不太穩(wěn)定，因為它轉(zhuǎn)換能量特征決定其必是一個有中間態(tài)化合物，長久接觸空氣會被逐步氧化失效；luminol也有保質(zhì)期。4.操作時間過長，膜逐步徹底干掉。商品化ECL會出現(xiàn)波形漸變，開始信號逐步增強(qiáng)，背景一起升高；隨即熒光完全衰減淬滅。5.不良試驗習(xí)慣。壇子上曾經(jīng)有些人問及淬滅問題，提到顯影夾子很臟。臟顯影夾主要有兩種污染，鐵銹和不慎沾染顯影液、定影液，前者造成閃滅（催化作用），后者可能直接造成無熒光；只要有任何失誤，諸如不小心刮破保鮮膜，保鮮膜包裹不嚴(yán)實（其實通常還真不嚴(yán)實，因為你不可能包裹好幾層）。于是，我問他用一個很臟東西不以為很別扭嘛，為何不先抄起抹布擦潔凈再用呢。6.淬滅假象。少許沾在膜表面二抗也會激發(fā)熒光，但ECL孵育時稍微晃動就消失了，可能產(chǎn)生淬滅錯覺。Stirpping：完整WB流程結(jié)束后，可能需要重新標(biāo)識一些膜，這時候就“可能”需要對膜stripping。這里用了“可能”二字，即不一定必須，那么首先討論一下stripping必要性。Stripping排除其余不講，整個流程會花費不少時間，從節(jié)約時間角度來講能不做最好；而且stripping條件過于激烈或多輪洗脫時，還會剝離已轉(zhuǎn)印到膜表面抗原使WB最終信號減弱；另外，strippingbuffer未去除潔凈時，其中一些組分一定會干擾第二種抗體結(jié)合。那么在什么條件下不需要stripping呢？1．當(dāng)A蛋白和B蛋白分子量差異5KDa以上（10KDa左右更保險），可將膜分割開（分別標(biāo)識不一樣抗體），這么就不需要stripping膜重新標(biāo)識，且一次就能得到想要結(jié)果。有些人會將兩種抗體混在一起標(biāo)識整張膜，這么操作前提是非常熟悉這兩種抗體雜帶位置，且各自雜帶都不會干擾目標(biāo)蛋白才能夠如此操作；而且這么抗體下次使用有了不足，所以不太推薦。2．兩種抗體種屬起源不一樣時，如鼠抗、兔抗等等，即使蛋白位置非?？拷鼰o法切膜，這時候也不一定需要stripping。輪番標(biāo)識這兩種不一樣抗體時，只需要用TBST涮掉表面ECL，時間可長（一時騰不出手來就扔在那邊一直漂，中間能夠換換液）可短（換液涮兩三次），然后直接用第二種抗體標(biāo)識同一張膜。不過，假如其中一個蛋白顯影太強(qiáng)，隔天顯第二種蛋白時可能會出現(xiàn)干擾（可能強(qiáng)可能弱）；但只要兩個蛋白不是一樣大小或者連在一起了，能夠在最終作圖時用PS切出來。3．當(dāng)兩種抗體種屬起源相同時，有一個情況也不需stripping，諸如標(biāo)識某蛋白磷酸化和總蛋白時。因為磷酸化抗體通常識別能力較弱（相對于總蛋白而言），信號通常都不太強(qiáng)，此時也僅需簡單漂洗；但標(biāo)識次序一定是先標(biāo)磷酸化后標(biāo)總蛋白。以上防止stripping主要從節(jié)約時間原因考慮，實際上當(dāng)上述2、3點存在時，個人還是會用strippingbuffer簡單漂一下，然后用TBST換液漂洗3次再上第二種抗體；但假如時間較緊，就會真省略。Stripping膜最少有三種方法：A．用TBST一直洗膜，洗8hrs以上就能夠去除多數(shù)蛋白信號，信號過強(qiáng)蛋白如內(nèi)參除外。所以，當(dāng)你抗體非常弱時候，孵育過夜實際上相當(dāng)于stripping，新信號不會出現(xiàn)，原來信號也會被漂洗潔凈，出現(xiàn)白板。B．請參考milliporePVDF膜附送說明書配方（沒有，請谷歌），上面提到假如信號很強(qiáng)，能夠在50度反應(yīng)。需要提醒是，因為巰基乙醇亦揮發(fā)，能夠考慮暫時添加。C．假如做過IP，你就知道能夠用低pHGlycine-HCl洗脫beads上特異性吸附蛋白。同理，0.1MGlycine（pH2.5,30min）也能夠用于stripping膜，這是已知最廉價高效洗膜方案。而且經(jīng)過TBST（10min*3）漂洗后，膜上pH早就恢復(fù)到正常值，此時不存在上述strippingbuffer殘留成份干擾第二種抗體標(biāo)識情況。假如第一個蛋白信號過強(qiáng)，一樣能夠在50度stripping提升洗膜強(qiáng)度。另外，膜風(fēng)干后，表面結(jié)合二抗也會脫落，不過不是很推薦。看完stripping這個部分，再多想一層，你一定會找到同一張膜數(shù)次標(biāo)識不一樣抗體竅門。假如有A、B、C三種蛋白，因分子量過于靠近無法切膜：a.假如A、B抗體同是兔抗，C抗體為鼠抗，則最合理標(biāo)識次序為A-C-B或者B-C-A。b.A、B、C抗體同種起源，A、B幾乎在一起，條帶粘連；C靠下。假如A、B主要性差不多、B信號稍弱，則B-C-A；假如A結(jié)果是最關(guān)鍵，盡管B信號弱，通常還是A-C-B。因為，經(jīng)過兩次strippingbuffer洗脫，且兩輪WB流程時長都超出8hrs（一抗習(xí)慣4度過夜孵育），實際上在標(biāo)識第三種抗體時，相對于經(jīng)歷了3次不一樣強(qiáng)度stripping；不要擔(dān)心第一個抗體還會有很強(qiáng)干擾。怎樣正確使用QuantiyOne定量：（以下文字系摘錄+改寫整合）WB做完，有時候我們需要對結(jié)果進(jìn)行定量?，F(xiàn)在最備受推崇應(yīng)該非Biorad企業(yè)QuantiyOne軟件莫屬，然而其$6K左右售價令很多人望而卻步；不過，這款軟件之所以敢如此漫天要價，其最大優(yōu)點莫過于自動識別條帶代替人工分析以降低主觀誤差，同時它很多功效滲透了艱深數(shù)理理論以及概率統(tǒng)計原理，這在其它各類無償隨機(jī)附送蛋白定量軟件上是乏善可陳。不過，令人扼腕是，又有多少人真只是把它當(dāng)做一款普通“無償”軟件在使用著——暴殄天物?，F(xiàn)在多數(shù)無償軟件主要采取是等高線定量法（VolumnContour），QuantiyOne也包含這部分內(nèi)容且在網(wǎng)絡(luò)教程里面流傳最廣，以至于很多人只會這種并不準(zhǔn)確蛋白定量方法。等高線定量法經(jīng)過半自動描繪電泳條帶等高線邊緣來得到等高線區(qū)域內(nèi)部面積，再將該面積乘以區(qū)域內(nèi)平均光密度值得到條帶內(nèi)部總信號量。這種分析方法有顯著弊?。喝藶槿Χū尘爸登壹俣ú灰粯佑镜辣尘傲炼纫恢?；等高線繪制處于“半自動”狀態(tài)，即需要人為判斷作為等高線標(biāo)準(zhǔn)電泳條帶邊緣；最致命是在幾個電泳條帶距離十分靠近時候幾乎無法繪制單一條帶輪廓（常出現(xiàn)連續(xù)幾個條帶等高線相連而無法分離出單獨條帶輪廓）。實際上，最科學(xué)、嚴(yán)謹(jǐn)?shù)鞍锥糠椒☉?yīng)該是泳道/條帶軌跡定量法（TraceTracking）。這種方法使用起來步驟較為繁瑣，必須經(jīng)過泳道識別電泳條帶識別這兩個連續(xù)步驟才能進(jìn)行定量。但它最大優(yōu)點在于能夠完全拋棄人為主觀原因進(jìn)行全自動定量。他定量方式為：首先依照不一樣電泳條帶光密度值繪制光密度曲線，然后計算光密度曲線下面積作為電泳條帶定量依照。其次，它能夠最大程度排除不一樣泳道之間背景差異，讓各個泳道上不一樣電泳條帶在一條幾乎相同起跑線上進(jìn)行對比；這個背景排除功效是等高線法無法做到。最終，采取泳道/條帶軌跡定量法分析條帶光密度后，再結(jié)合GaussModelBands對電泳條帶進(jìn)行數(shù)理統(tǒng)計。執(zhí)行步驟：因為QuantiyOne只能識別黑白TIF文件，而實際上發(fā)表論文時，很多雜志也要求提供TIF等格式圖片而非JEPG格式；所以，考慮到這兩層原因，我提議大家從一開始掃描就統(tǒng)一存貯為TIF格式圖片。1.創(chuàng)建泳道：a.打開我們要分析電泳圖片（以蛋白質(zhì)電泳為例）。b.選擇“Lane-AutoFramelanes”。這時假如您電泳圖片比較標(biāo)準(zhǔn)話，QuantityOne就會自動識別出每條電泳泳道位置，而且將各個泳道路徑用一條紅線標(biāo)畫出來；假如您對軟件自動標(biāo)識泳道不甚滿意，您能夠經(jīng)過“Lane-EditFrame”下級各個子菜單提供功效對泳道框架位置、大小等進(jìn)行調(diào)整；調(diào)整方法就是經(jīng)過鼠標(biāo)拖放來實現(xiàn)。假如您只需要分析其中幾個泳道數(shù)據(jù)而不想其余泳道標(biāo)識干擾您視線，您能夠經(jīng)過“Lane-SingleLane-RemoveLane”刪除您不需要泳道標(biāo)識。注意：不是全部電泳圖片泳道都能夠被QuantityOne自動識別。在不能自動識別情況下，QuantityOne就會彈出對話框告訴您它不能識別泳道。這時大家就需要手工繪制電泳泳道。方法和上面一樣，同過“Lane-SingleLane-CreatLane”來實現(xiàn)。只要用鼠標(biāo)在您電泳圖片上順著待標(biāo)識泳道中軸線拖放就能夠繪制出該泳道標(biāo)識紅線。2.不一樣泳道背景排除：我們要將我們電泳圖片進(jìn)行前面談到泳道識別，不論是自動方式還是手工識別。然后選擇“Lane-LaneBackgroud...”命令。選擇該命令后，鼠標(biāo)即變成一個綠色“+”，將鼠標(biāo)移到您打算進(jìn)行背景排除泳道，點擊左鍵一下，立刻就會彈出以下列圖所表示對話框。其中“OpticalDensity”顯示得是該泳道光密度值分布情況。大家會注意到這個分布曲線并不是緊貼著縱軸，而是位于縱軸上方分布。造成這個“懸空現(xiàn)象”原因就是該泳道本身存在著一定光密度“背景”。這個背景存在造成該泳道上各個電泳條帶之間不能處于同一水平進(jìn)行對比；假如考慮到相鄰其余泳道更是因為不一樣背景存在而無法對比不一樣泳道上不一樣電泳條帶。怎樣去除這個背景呢？我們繼續(xù)看右邊“LaneBackgroudSubstruction”對話框。這個對話框上方“AllLanes”表示能夠?qū)θ坑镜肋M(jìn)行一次性處理；下方“SelectedLane”表示僅針對此次選中這個泳道進(jìn)行處理。我們用鼠標(biāo)選擇“SelectedLane”“LaneOn”選項。然后在下面“RollingDiskSize”里填上“5”，再按“回車”鍵。大家再來看看現(xiàn)在“OpticalDensity”中出現(xiàn)了一條緊緊沿著光密度曲線分布醬色曲線。這條曲線將泳道背景與電泳條帶光密度分布十分精準(zhǔn)劃分開來。注意：“RollingDiskSize”是什么意思呢？實際上就是數(shù)理里面微分等差迫近。我們能夠?qū)uantityOne提供去除背景功效想象成是一個滾動小球。假如這個小球半徑越小，那么它沿著光密度曲線滾動時滾過路徑就越發(fā)精細(xì)，詳細(xì)反應(yīng)在醬色曲線軌跡越發(fā)靠近黑色光密度分布曲線基線。所以從理論上來說“RollingDiskSize”取值越小，它去除背景效果越好。大家能夠試著選擇一個較大值比如80，再來看看此時醬色曲線軌跡。當(dāng)然也不能取太小值。因為假如取值太小，大家能夠想象這個十分微小球就會滾入光密度曲線內(nèi)部，造成有效陽性信號損失。個人感覺5~20是一個比很好取值范圍。我們能夠?qū)γ織l泳道依葫蘆畫瓢進(jìn)行以上類似背景排除工作。不過有時候假如大家以為能夠使用一樣標(biāo)準(zhǔn)，即相同“RollingDiskSize”進(jìn)行排除，那么我們能夠在“LaneBackgroudSubstruction”對話框中選擇上方“AllLanesOn(samelevel)”選項。然后在“RollingDiskSize”中填上一個適宜值，點擊“Done”按鈕確認(rèn)就能夠了。此時該電泳圖片上全部泳道都以相同標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了背景去除。3.創(chuàng)建條帶：前面我們已經(jīng)識別和分析了電泳圖片泳道，下面我們開始研究電泳條帶問題。首先在這里明確兩個名詞翻譯：“Lane”指電泳泳道；“Band”指電泳條帶（在下文中一律使用這兩個英文名詞來表示這兩個意思）。a.電泳條帶識別：和前面研究Lane一樣，首先我們要對Lane上Band進(jìn)行識別。識別方式一樣分為自動識別和人工識別。自動識別時候選擇“Band-DetectBands...”命令。這時QuantityOne會自動彈出一個“DetectBands”對話框。注意：第一次用QuantityOne時，您Bands識別以后僅僅是畫出了一條紅色粗線，而在上面演示圖片中卻是上下括號形式。其實大家能夠在“Band-BandAttributes”選項中設(shè)置Bands顯示形式。在下方“Style”選項卡中選擇“Brackets”就會將原來粗線改為括號形式了。b.假如要自動識別全部Lanes上Bands就鉤選Lands后面“All”選項；假如僅僅想自動識別某一條Lane上Bands就鉤選“One”，然后在后面輸入框中填上您想識別泳道號碼；假如僅僅想識別泳道上部分光密度值最強(qiáng)Bands，能夠在“Bands”后面選項中選擇“Limit”，然后填上對應(yīng)數(shù)目（比如10）。QuantityOne就會僅識別該泳道上光密度最大10條Bands；假如您發(fā)覺自動識別Bands寬度太窄，圈定Band紅色括號內(nèi)范圍小于黑色光密度影。此時能夠使用“LaneWidth”命令來調(diào)整Bands識別寬度。用鼠標(biāo)點擊“LaneWidth”后面向上箭頭就會發(fā)覺紅色括號逐步變寬，最終要求其范圍略為寬過其包繞Band影跡；假如您發(fā)覺自動識別功效沒有識別您想要Band或者誤識別了您不想要Band，您還能夠使用上面工具欄進(jìn)行“添加”或“刪除”。將您鼠標(biāo)指向每個圖標(biāo)，QuantityOne就會知道彈出一個黃色提醒信息告訴您這個按鈕功效。4.高斯建模與結(jié)果分析：a.高斯建模，即用數(shù)學(xué)方法（微積分）對正態(tài)分布曲線進(jìn)行統(tǒng)計分析。理論上每道band光密度都呈正態(tài)分布平滑曲線（每個band中間位置蛋白壓縮最緊濃度最高，向上向下因擴(kuò)散而減弱）；然而實際操作過程中，假如熒光過強(qiáng)，往往出現(xiàn)類似方波曲線（曲線無peak峰，上方為平滑直線，超識別最高閾值）；熒光較弱宜出現(xiàn)波浪樣（多）波峰，或難與背景區(qū)分。首先電腦會統(tǒng)計band中每個點光密度值，并對這些值按正態(tài)分布進(jìn)行歸類，當(dāng)讀值不符合正態(tài)分布原理時，電腦會自動做出選擇以對偏離正態(tài)分布數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)取舍（置信區(qū)間），從而最終優(yōu)化光密度曲線呈正態(tài)分布。怎樣進(jìn)行高斯建模呢？很簡單，只要執(zhí)行“Band-GaussModelBands...”命令就能夠了，執(zhí)行后QuantityOne回彈出一個對話框問您要對那條泳道進(jìn)行高斯建模。請鉤選“One”，然后再輸入需要建模泳道代碼就能夠了；假如選擇了“All”則對全部泳道進(jìn)行高斯建模，當(dāng)然建模這么多泳道會費一點時間了。b.觀察結(jié)果：執(zhí)行完高斯建模以后使用“Band-BandInformation”命令來觀察結(jié)果。方法是將變成藍(lán)色驚嘆號鼠標(biāo)移到剛才已經(jīng)識別Band部位，一個詳細(xì)“BandInformation”信息框就會立刻彈出來。在這幅圖中我們必須注意是“Trace”和/或“GaussModelTrace”，因為我們剛才辛勞了半天就是為了得到這個數(shù)據(jù)。這個數(shù)據(jù)表示就是Band光密度分布曲線下面積，也就是QuantityOne用來表示Band內(nèi)分子總量方式。最終，我們計算、統(tǒng)計值，應(yīng)該是“GaussModelTrace”這一欄讀值。Stirpping：完整WB流程結(jié)束后，可能需要重新標(biāo)識一些膜，這時候就“可能”需要對膜stripping。這里用了“可能”二字，即不一定必須，那么首先討論一下stripping必要性。Stripping排除其余不講，整個流程會花費不少時間，從節(jié)約時間角度來講能不做最好；而且stripping條件過于激烈或多輪洗脫時，還會剝離已轉(zhuǎn)印到膜表面抗原使WB最終信號減弱；另外，strippingbuffer未去除潔凈時，其中一些組分一定會干擾第二種抗體結(jié)合。那么在什么條件下不需要stripping呢？1．

當(dāng)A蛋白和B蛋白分子量差異5KDa以上（10KDa左右更保險），可將膜分割開（分別標(biāo)識不一樣抗體），這么就不需要stripping膜重新標(biāo)識，且一次就能得到想要結(jié)果。有些人會將兩種抗體混在一起標(biāo)識整張膜，這么操作前提是非常熟悉這兩種抗體雜帶位置，且各自雜帶都不會干擾目標(biāo)蛋白才能夠如此操作；而且這么抗體下次使用有了不足，所以不太推薦。2．

兩種抗體種屬起源不一樣時，如鼠抗、兔抗等等，即使蛋白位置非?？拷鼰o法切膜，這時候也不一定需要stripping。輪番標(biāo)識這兩種不一樣抗體時，只需要用TBST涮掉表面ECL，時間可長（一時騰不出手來就扔在那邊一直漂，中間能夠換換液）可短（換液涮兩三次），然后直接用第二種抗體標(biāo)識同一張膜。不過，假如其中一個蛋白顯影太強(qiáng)，隔天顯第二種蛋白時可能會出現(xiàn)干擾（可能強(qiáng)可能弱）；但只要兩個蛋白不是一樣大小或者連在一起了，能夠在最終作圖時用PS切出來。3．

當(dāng)兩種抗體種屬起源相同時，有一個情況也不需stripping，諸如標(biāo)識某蛋白磷酸化和總蛋白時。因為磷酸化抗體通常識別能力較弱（相對于總蛋白而言），信號通常都不太強(qiáng)，此時也僅需簡單漂洗；但標(biāo)識次序一定是先標(biāo)磷酸化后標(biāo)總蛋白。以上防止stripping主要從節(jié)約時間原因考慮，實際上當(dāng)上述2、3點存在時，個人還是會用strippingbuffer簡單漂一下，然后用TBST換液漂洗3次再上第二種抗體；但假如時間較緊，就會真省略。Stripping膜最少有三種方法：A．用TBST一直洗膜，洗8hrs以上就能夠去除多數(shù)蛋白信號，信號過強(qiáng)蛋白如內(nèi)參除外。所以，當(dāng)你抗體非常弱時候，孵育過夜實際上相當(dāng)于stripping，新信號不會出現(xiàn)，原來信號也會被漂洗潔凈，出現(xiàn)白板。B．請參考milliporePVDF膜附送說明書配方（沒有，請谷歌），上面提到假如信號很強(qiáng)，能夠在50度反應(yīng)。需要提醒是，因為巰基乙醇亦揮發(fā)，能夠考慮暫時添加。C．假如做過IP，你就知道能夠用低pHGlycine-HCl洗脫beads上特異性吸附蛋白。同理，0.1MGlycine（pH2.5）也能夠用于stripping膜，這是已知最廉價高效洗膜方案。而且經(jīng)過TBST（10min*3）漂洗后，膜上pH早就恢復(fù)到正常值，此時不存在上述strippingbuffer殘留成份干擾第二種抗體標(biāo)識情況。假如第一個蛋白信號過強(qiáng)，一樣能夠在50度stripping提升洗脫強(qiáng)度。另外，膜風(fēng)干后，表面結(jié)合二