熊果酸和齊墩果酸對(duì)胰脂肪酶活性及構(gòu)象的影響

熊果酸和齊墩果酸對(duì)胰脂肪酶活性及構(gòu)象的影響【摘要】目的研究熊果酸和齊墩果酸對(duì)胰脂肪酶活性和構(gòu)象的影響。方法采用紫外光譜法、熒光光譜法以及圓二色譜法分析UA和OA作用后LPS相應(yīng)譜的特征。結(jié)果UA和OA作用后LPS的活性明顯降低，紫外吸收光譜發(fā)生改變。熒光淬滅結(jié)果顯示UA作用后，LPS的熒光發(fā)生淬滅，且淬滅的機(jī)制為靜態(tài)淬滅和動(dòng)態(tài)淬滅組合的淬滅機(jī)制，而OA對(duì)LPS熒光淬滅主要為靜態(tài)淬滅；UA和OA作用后LPS的圓而色譜圖譜發(fā)生改變。結(jié)論UA和OA都可以抑制LPS的活性、影響LPS的構(gòu)象，且UA對(duì)LPS的構(gòu)象影響及抑制作用更加顯著。

【關(guān)鍵詞】熊果酸齊墩果酸胰脂肪酶紫外光譜熒光光譜圓二色譜

脂肪酶(lipase，簡(jiǎn)稱LPS)是一種特殊的酯鍵水解酶，廣泛存在于動(dòng)物、植物種子和微生物體中，它能催化天然底物油脂水解，產(chǎn)生脂肪酸和甘油［1］。

熊果酸(ursolicacid,UA)和齊墩果酸(oleanolicacid,OA)為同分異構(gòu)體,均屬于五環(huán)三萜類化合物,廣泛存在于中草藥中,且具有多種生物活性［2］。OA和UA都具有一定的降脂作用，能夠有效地降低高脂血癥小鼠的血脂［3，4］，有望開(kāi)發(fā)成新型降脂藥。但OA和UA降脂作用的強(qiáng)弱的比較及降脂作用機(jī)理尚未見(jiàn)報(bào)道。本文采用紫外光譜、熒光光譜和圓二色譜等方法，研究了UA和OA對(duì)LPS活性及構(gòu)象的影響，比較了UA和OA對(duì)LPS抑制作用的強(qiáng)弱，為探尋OA和UA降脂作用機(jī)理，將其開(kāi)發(fā)為一種雙成分降脂新藥提供理論參考。

1儀器與試劑

F-4500熒光光譜儀(日立)，TU-1800紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，JASCO-J-810圓二色譜儀(日本JASCO公司)。齊墩果酸和熊果酸購(gòu)自陜西森弗生物技術(shù)有限公司，胰脂肪酶購(gòu)自Sigma公司；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

2方法

UA，OA對(duì)LPS活性的影響

UA，OA對(duì)LPS的抑制作用酶活性測(cè)定采用銅皂法［5］。

UA，OA對(duì)LPS的抑制動(dòng)力學(xué)研究

在酶的反應(yīng)體系中分別加入不同濃度的UA和OA，改變底物橄欖油的濃度，測(cè)定酶促反應(yīng)的初速度。以Lineweaver-Burk雙倒數(shù)法作圖，并計(jì)算抑制速度常數(shù)。

UA，OA對(duì)LPS構(gòu)象的影響

不同濃度UA、OA對(duì)LPS的紫外吸收光譜和熒光光譜測(cè)定

取2ml濃度為1×10-5mol/L的LPS溶液，分別加入不同微量體積的UA和OA溶液，使三萜類小分子與LPS的終摩爾比分別為0／1，／1，／1，／1，／1，1／1，3／1，5／1?；旌暇鶆蚝螅覝胤胖?0min，以相同濃度的小分子溶液作空白，記錄200～300nm的紫外吸收光譜。

以295nm為激發(fā)波長(zhǎng)，室溫下測(cè)定300～400nm的熒光光譜，溶液濃度及反應(yīng)條件同上述。

圓二色(CD)譜測(cè)定

樣品池光程為cm,在室溫下測(cè)定波長(zhǎng)范圍190～250nm的CD譜。CD譜用平均殘基摩爾橢圓度表示，單位為deg·cm2·mol-1，數(shù)據(jù)經(jīng)3次掃描取平均值。得出CD譜后,用該儀器附帶的楊氏方法計(jì)算脂肪酶的二級(jí)結(jié)構(gòu)含量。LPS濃度為1×10-5mol/L，實(shí)驗(yàn)時(shí)三萜類小分子與LPS的終摩爾比為0／1，／1，3／1。

3結(jié)果與討論

UA，OA對(duì)LPS活性的影響

不同濃度的UA，OA對(duì)LPS活力的影響結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可以看出，UA，OA對(duì)LPS都有一定的抑制作用，抑制作用隨UA，OA濃度的升高而增強(qiáng)。在相同濃度下，UA的抑制作用大于OA。

UA，OA對(duì)LPS的抑制

動(dòng)力學(xué)UA，OA對(duì)LPS的抑制作用如圖2。由圖可知隨著UA，OA濃度的升高，酶的Km值保持不變，而Vmax則隨UA，OA濃度的升高而不斷降低。因此UA、OA對(duì)LPS均屬于非競(jìng)爭(zhēng)性抑制。

采用Dixon作圖法，以1/V對(duì)不同濃度的UA，OA作圖，可得到UA，OA的抑制常數(shù)Ki。UA，OA的Ki分別為mmol/L，mmol/L，可見(jiàn)抑制作用UA大于OA。

不同濃度UA，OA對(duì)LPS的紫外吸收差譜

大多數(shù)蛋白質(zhì)分子在280nm附近有一個(gè)吸收峰，是由于色氨酸(Trp)和酪氨酸(Tyr)等芳雜環(huán)對(duì)光的吸收；同時(shí)在220nm左右有一個(gè)由肽鍵的C=O的π-π躍遷引起的強(qiáng)吸收峰，與蛋白質(zhì)的α-螺旋含量有關(guān)［7］。

用不同濃度的UA，OA作用于LPS的紫外吸收差譜如圖3。可知LPS在270nm和220nm附近出現(xiàn)最大吸收峰，且隨UA、OA濃度的增加LPS在220nm和270nm附近的吸收不斷增大，圖3A中最大吸收都有少許紅移。在低濃度時(shí)，酶在220nm和270nm附近的吸收隨濃度的增加而急劇增加，當(dāng)UA與酶的比例達(dá)到1/1后，紫外吸收增幅減慢。因此可以認(rèn)為UA與LPS的摩爾比例為1/1時(shí)，具有最大紫外吸收。圖3B中OA作用后的LPS最大吸收峰發(fā)生紅移，當(dāng)OA與酶的比例達(dá)到3/1后，紫外吸收增幅明顯減慢。因此可以認(rèn)為OA與LPS的摩爾比例為3/1時(shí)，具有最大紫外吸收。

從由不同濃度的UA、OA作用后LPS的紫外吸收差譜可見(jiàn)，LPS270nm和280nm附近的吸收主要是由于肽鍵C=O基的π-π＊躍遷所引起，與蛋白質(zhì)的α-螺旋含量有關(guān)［6］。當(dāng)UA、OA濃度較低時(shí)，這些小分子與LPS的結(jié)合有利于酶分子間和分子內(nèi)的團(tuán)聚作用，使包圍在LPS分子內(nèi)部的色氨酸和酪氨酸殘基的芳雜環(huán)疏水基團(tuán)裸露出來(lái),改變了芳香族氨基酸殘基在空間結(jié)構(gòu)中所處的微使蛋白質(zhì)分子的構(gòu)象發(fā)生改變，α螺旋含量減少；當(dāng)小分子濃度進(jìn)一步升高時(shí)，UA處理后的LPS分子發(fā)生蛋白質(zhì)肽鏈伸展現(xiàn)象，使酶分子中疏水作用略有增強(qiáng)，吸收峰略增加且略有紅移［7］，因此在紫外差譜中酶的最大吸收增加明顯減緩，并產(chǎn)生紅移。而OA沒(méi)有紅移現(xiàn)象，表明UA與酶的結(jié)合對(duì)酶構(gòu)象的影響較OA大。

不同濃度UA，OA對(duì)LPS的熒光光譜的影響

蛋白質(zhì)中芳香氨基酸的熒光特性可用來(lái)推測(cè)蛋白質(zhì)的溶液構(gòu)象，提供有關(guān)蛋白質(zhì)生色基團(tuán)的結(jié)構(gòu)及所處微觀的信息。蛋白質(zhì)分子中色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)和苯丙氨酸(Phe)具有熒光性質(zhì)，此蛋白質(zhì)內(nèi)源熒光可作為探針檢測(cè)蛋白質(zhì)構(gòu)象變化。295nm波長(zhǎng)光激發(fā)時(shí)，蛋白質(zhì)分子中的Trp殘基受到激發(fā)，所產(chǎn)生熒光的強(qiáng)度和位置與這些殘基所處的微環(huán)境密切相關(guān)［8］。

由4可知，295nm激發(fā)時(shí)熒光光譜的最大發(fā)射波長(zhǎng)是340nm，隨著UA、OA濃度的不斷增加，熒光強(qiáng)度明顯減弱,出現(xiàn)典型的熒光猝滅現(xiàn)象，表明其與酶結(jié)合后引起蛋白質(zhì)的構(gòu)象變得疏松，局部構(gòu)象發(fā)生變化，變化后的結(jié)構(gòu)不利于酶的催化，故酶活力逐漸降低［9］。而在圖4A中，隨著UA濃度的增加，發(fā)射峰位紅移，說(shuō)明LPS中發(fā)生熒光淬滅的Trp和Tyr殘基周圍的疏水性有所增加。同時(shí)出現(xiàn)了裂峰，原來(lái)341nm處的單峰逐漸裂分為二重峰，其中一峰峰值藍(lán)移至325nm，另一峰峰值紅移至360nm。藍(lán)移峰最可能是LPS中Tyr殘基受UA誘導(dǎo)而終止與Trp殘基間的共振能量轉(zhuǎn)移，分裂出自身的熒光發(fā)射峰；紅移峰應(yīng)歸屬于Trp殘基［10，11］,表明原來(lái)疏水環(huán)境的Trp殘基逐漸暴露在極性環(huán)境中，使蛋白質(zhì)的構(gòu)象變得疏松，酶催化活力降低［10］。

UA，OA對(duì)LPS熒光淬滅的機(jī)理

若將UA，OA對(duì)LPS熒光的淬滅歸因于分子碰撞引起的動(dòng)態(tài)淬滅,按照Stern-Volmer方程［12］：

F0/F＝1＋Kqτ0［Q］＝1＋Ksv［Q］

式中：F0為無(wú)淬滅劑時(shí)LPS的熒光強(qiáng)度，F(xiàn)為有淬滅劑時(shí)LPS的熒光強(qiáng)度，Kq為分子淬滅速率常數(shù)，τ0為淬滅劑不存在時(shí)物質(zhì)的熒光壽命，Ksv為動(dòng)態(tài)淬滅常數(shù)，［Q］為淬滅劑濃度。當(dāng)溫度為20℃時(shí)，求出Ksv=×104(mol·L)-1Ksv=×104(mol·L)-1。生物大分子的熒光平均壽命約為10-8s，因而可以求得Kq=×1012(mol·L)-1s-1。Kq=×1012(mol·L)-1s-137℃時(shí)，求出Kq=×1012(mol·L)-1s-1Kq=×1012(mol·L)-1s-1。遠(yuǎn)大于各類淬滅劑對(duì)生物大分子的最大擴(kuò)散常數(shù)×1010(mol·L)-1s-1，表明UA、OA對(duì)LPS的熒光淬滅并不是由于分子擴(kuò)散和動(dòng)態(tài)碰撞引起的動(dòng)態(tài)淬滅，而可能是靜態(tài)淬滅。但從圖5可以看出當(dāng)［Q］＞×10-5mol·L-1時(shí)，UA的Stern-Volmer曲線開(kāi)始偏向Y軸，說(shuō)明存在一定的動(dòng)態(tài)淬滅效應(yīng)。因此當(dāng)淬滅劑UA濃度較低時(shí)以靜態(tài)淬滅為主,隨著淬滅劑濃度增大,動(dòng)態(tài)淬滅逐漸體現(xiàn)。因此，靜態(tài)淬滅和動(dòng)態(tài)淬滅是導(dǎo)致UA對(duì)LPS熒光淬滅的兩大原因，而OA對(duì)LPS熒光淬滅主要?dú)w因于靜態(tài)淬滅。

結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)的計(jì)算

設(shè)UA、OA與LPS之間形成n個(gè)結(jié)合位點(diǎn)的復(fù)合物,則結(jié)合常數(shù)Ka和n值可從式(2)計(jì)算得到［13］

lg［(F0-F)/F］=lgKA+nlg［Q］(2)

不同溫度下求得的KA值和n值列于表1，從表1可以看出，UA、OA與LPS之間都只有一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，具有強(qiáng)的相互作用。隨著溫度升高,產(chǎn)物的穩(wěn)定性降低,靜態(tài)淬滅常數(shù)KA減小，進(jìn)一步推斷淬滅過(guò)程為形成化合物所引起的靜態(tài)淬滅。表1不同溫度下藥物與LPS結(jié)合常數(shù)KA和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)

不同濃度UA、OA作用后LPS的圓二色譜

蛋白質(zhì)的CD光譜178～250nm為遠(yuǎn)紫外區(qū)CD光譜,可以反映肽鍵的圓二色性。在蛋白質(zhì)或多肽的規(guī)則二級(jí)結(jié)構(gòu)中,肽鍵是高度有規(guī)律排列的,排列的方向性決定了肽鍵能級(jí)躍遷的分裂情況。因此具有不同二級(jí)結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)或多肽所產(chǎn)生CD譜帶的位置、吸收的強(qiáng)弱都不相同［14］。

圖6為不同三萜類藥物濃度下LPS溶液的CD光譜。其中1曲線(LPS空白)顯示了典型LPS的結(jié)構(gòu),分別在206nm和220nm處出現(xiàn)負(fù)峰,在191nm處出現(xiàn)正峰,隨著藥物的加入,LPS的CD光譜的負(fù)峰強(qiáng)度逐漸降低,且計(jì)算得到在UA，OA最大濃度作用下α螺旋含量分別減少了%和%，說(shuō)明藥物分子與LPS結(jié)合后引起其微構(gòu)像的變化,使LPS肽鏈伸展,改變了LPS的二級(jí)結(jié)構(gòu),導(dǎo)致α螺旋結(jié)構(gòu)的減少［14，15］。從圖6和α螺旋含量變化可以得出相同濃度下UA比OA對(duì)酶二級(jí)結(jié)構(gòu)影響更加顯著，在紫外光譜和熒光光譜基礎(chǔ)上證實(shí)了UA對(duì)LPS構(gòu)象的影響比OA顯著。

以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，UA和OA都可通過(guò)非競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用抑制了LPS的活性；UA和OA作用后LPS的活性明顯降低，紫外吸收光譜發(fā)生改變，熒光光譜發(fā)生淬滅；UA，OA都改變了LPS的二級(jí)結(jié)構(gòu)和Trp、Tyr殘基所處的微環(huán)境，抑制了LPS的活性，從而抑制了外源脂肪的吸收［16，17］，其中，與OA相比，UA對(duì)LPS的構(gòu)象影響及抑制作用更加顯著。

UA，OA均表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制LPS的活性，因此這兩種物質(zhì)有望開(kāi)發(fā)為新型的雙成分的降脂新藥，同時(shí)省卻了同分異構(gòu)體復(fù)雜的分離純化工序，可以大大地降低原料成本。

【參考文獻(xiàn)】

［1］鄭毅,葉海梅,吳朝娟，等.脂肪酶活力測(cè)定研究進(jìn)展［J］.工業(yè)微生物,2005,35(9):36.

［2］相延英,楊光.中藥中齊墩果酸和熊果酸的分離測(cè)定方法［J］.醫(yī)藥導(dǎo)報(bào),2003,22(S1):98.

［3］李貴海,孫敬勇,張希林.山楂降血脂有效成分的實(shí)驗(yàn)研究［J］.中草藥,2002,33(1)：50.

［4］田麗婷,馬龍,堵年生，等.齊墩果酸的藥理作用研究概況［J］.中國(guó)中藥雜志,2002,27(12)：884.

［5］慧芳,王雅琴,劉春國(guó).三種脂肪酶活力測(cè)定方法的比較及改進(jìn)［J］.化學(xué)與生物工程,2007,24(8):85.

［6］BrunoStellmach.BestimmungsmethodenEnzyme［M］.Bjing:ChinaLightIndustryPress,1988：37.

［7］盛良全,閆向陽(yáng),徐華杰,等.煙堿與牛血清白蛋白相互作用的光譜研究［J］.光譜學(xué)與光譜分析,2007,27:306.

［8］常?？?黃艷,賀群.銥離子與人血丙球蛋白的作用研究［J］.化學(xué)學(xué)報(bào),2005,63:223.

［9］劉惠君,劉維屏,陳愛(ài)平,等.光譜法研究異丙甲草胺及其S-對(duì)映體與脲酶的相互作用機(jī)制［J］.光譜學(xué)與光譜分析,2004,2:166.

［10］王彥卿,張紅梅,張根成.熒光光譜法研究黃藤素與牛血清白蛋白的相互作用［J］.分析測(cè)試學(xué)報(bào),2006,25:48.

［11］劉雪鋒,夏詠梅,方云,等.中藥黃連有效成分鹽酸小檗堿與牛血清白蛋白的相互作用［J］.高等學(xué)校化學(xué)學(xué)報(bào),2004,11:2099.

［12］,,Dualgradiention-exehangechromatograpyimprovedrefoldingyieldoflysozyme［J］.A,2002,959:113.

［13］DaojinLi,Jin