實驗室常用幾種細胞實驗的實驗步驟和細胞熒光染色方法小結(jié)詳解演示文稿

實驗室常用幾種細胞實驗的實驗步驟和細胞熒光染色方法小結(jié)詳解演示文稿當(dāng)前第1頁\共有38頁\編于星期三\22點（優(yōu)選）實驗室常用幾種細胞實驗的實驗步驟和細胞熒光染色方法小結(jié)當(dāng)前第2頁\共有38頁\編于星期三\22點人臍帶縱剖面和直觀圖當(dāng)前第3頁\共有38頁\編于星期三\22點實驗操作步驟將滅菌后的實驗物品按操作順序擺放在超凈工作臺內(nèi)（超凈工作臺內(nèi)事先UV滅菌）

注意：紫外滅菌時應(yīng)關(guān)閉日光燈，送風(fēng)機，人員要離開生化間，20分鐘后返回關(guān)閉紫外燈，打開日光燈，風(fēng)機。5分鐘后進行實驗

當(dāng)前第4頁\共有38頁\編于星期三\22點打開NS.，點燃酒精燈（不建議使用），將酒精棉鋪開在操作臺中央，方便將所有器械和瓶蓋的擺放。當(dāng)前第5頁\共有38頁\編于星期三\22點3將半月盤內(nèi)倒入少許無菌NS.,取出新鮮臍帶輕輕放入半月盤內(nèi)，用滅菌后的脫脂棉球?qū)⒛殠庵艿难E擦干，將臍帶兩端血跡擦干以便暴露靜脈血管。將圓頭不銹鋼針頭輕緩的插入兩端靜脈血管內(nèi)，并順勢用止血鉗夾死固定。注意：本實驗操作時要戴好橡膠手套，操作前進行醫(yī)用酒精擦拭消毒，當(dāng)臍帶過短時，只要一端插入圓頭針，另一端用止血鉗夾死。當(dāng)前第6頁\共有38頁\編于星期三\22點當(dāng)前第7頁\共有38頁\編于星期三\22點用無菌NS.,將臍帶靜脈血管內(nèi)的淤血沖洗干凈，直到?jīng)_出的NS.無色為止，接著將血管內(nèi)的空氣抽空，兩端固定。當(dāng)前第8頁\共有38頁\編于星期三\22點當(dāng)前第9頁\共有38頁\編于星期三\22點5將Ⅱ型膠原酶注入臍帶靜脈血管內(nèi)，此步驟操作時，注意兩端的注射器要來回做活塞運動以便使血管內(nèi)壁與Ⅱ型膠原酶充分接觸，注入的Ⅱ型膠原酶比例為8ml/15cm。注意：一般本步消化時間為10分鐘左右，Ⅱ型膠原酶的溫度保證在37℃左右消化能力最好。特別提醒的是在消化過程中要用手來回揉搓臍帶外壁，有助于內(nèi)皮細胞的脫落，此細節(jié)至關(guān)重要，決定了實驗成敗當(dāng)前第10頁\共有38頁\編于星期三\22點當(dāng)前第11頁\共有38頁\編于星期三\22點此細節(jié)至關(guān)重要當(dāng)前第12頁\共有38頁\編于星期三\22點終止消化，將靜脈內(nèi)含有EC細胞的消化液注入含有小牛血清的離心液里終止消化，兩者比例為1:1，并用離心液沖洗靜脈血管兩次，并將收集的細胞懸液裝入離心管，封口

離心，將離心管放入離心機，設(shè)定離心速度和時間。一般1200r/min,8分鐘。

待離心機完全停穩(wěn)后，打開，取出離心管。小心取放，避免震動幅度過大，倒去上清液，將貼壁細胞用新鮮的培養(yǎng)基全液吹打垂懸，放入細胞培養(yǎng)瓶（一般5ml/瓶）當(dāng)前第13頁\共有38頁\編于星期三\22點937℃,5%，CO2孵箱培養(yǎng)，第二天換液，去除未貼壁細胞，繼續(xù)培養(yǎng)。待細胞幾乎鋪滿瓶底時傳代約為3/4。一傳二當(dāng)前第14頁\共有38頁\編于星期三\22點二SMC的原代培養(yǎng)實驗前準(zhǔn)備器械消化酶FD-12培養(yǎng)基其他大號止血鉗：2把小號止血鉗：2把小號培養(yǎng)皿：2個眼科剪（直）：2把眼科剪（彎）：2把眼科鑷（直）：2把眼科鑷（彎）：2把

胰酶Try(2.5mg/ml)FD-12培養(yǎng)原液85mlFBS15mlL-Glu1ml濃度為200mmol/L細胞培養(yǎng)瓶NS.6孔板當(dāng)前第15頁\共有38頁\編于星期三\22點SMC細胞來源采用方法：組織貼壁法當(dāng)前第16頁\共有38頁\編于星期三\22點實驗操作步驟將滅菌后的實驗物品按操作順序擺放在超凈工作臺內(nèi)（超凈工作臺內(nèi)事先UV滅菌）

注意：紫外滅菌時應(yīng)關(guān)閉日光燈，送風(fēng)機，人員要離開生化間，30分鐘后返回關(guān)閉紫外燈，打開日光燈，風(fēng)機。5分鐘后進行實驗

將實驗過程中需要的用到的器械依次擺放在酒精燈周圍取出臍帶（5CM即可），放入半月盤內(nèi)，用滅菌后脫脂棉擦去臍帶周圍血跡

注意：個體差異性大，選取臍帶時無明顯水腫，淤血，無結(jié)節(jié)現(xiàn)象當(dāng)前第17頁\共有38頁\編于星期三\22點觀察臍帶縱面，找到臍帶內(nèi)兩根動脈，從中間小心剪一豁口。用組織剪牽拉兩部分，直至分離出動脈血管。

將剖離的動脈轉(zhuǎn)移到一干凈的6孔板內(nèi),孔內(nèi)加入少許NS.當(dāng)前第18頁\共有38頁\編于星期三\22點剝離血管外膜，小心用一眼科直鑷夾住血管一端，用另一把彎鑷輕輕向下牽拉血管外壁，直到明顯可見一層狀組織與內(nèi)層組織分離。此時應(yīng)夾緊該層組織，迅速向下剝離。

注意：此步驟最為關(guān)鍵，直接決定細胞組織的增殖活力7將剩下的血管組織再次轉(zhuǎn)移到另一孔內(nèi)，孔內(nèi)加入少許NS.,用彎鑷夾住血管一端輕輕地套在眼科剪前端，漸次將組織依次剪開，用一滅菌脫脂棉輕輕擦拭血管內(nèi)壁，除去血管內(nèi)皮細胞當(dāng)前第19頁\共有38頁\編于星期三\22點8將血管中層再次轉(zhuǎn)移到一孔內(nèi),孔內(nèi)加入少許培養(yǎng)基，用眼科剪（直）將組織盡數(shù)剪成1mm×1mm的小組織塊當(dāng)前第20頁\共有38頁\編于星期三\22點將剪好的組織塊用一彎頭吸管吸出來放進細胞培養(yǎng)瓶內(nèi)，小心將培養(yǎng)基吸出來，將組織塊輕輕地均勻的貼在細胞瓶底。

加入新鮮的培養(yǎng)基，小心不要將瓶底的組織塊沖刷掉。

將細胞培養(yǎng)瓶放入37℃,5%，CO2孵箱培養(yǎng)

注意：此時的細胞培養(yǎng)瓶是倒置的，第二天翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶時才使得組織塊浸入培養(yǎng)基里12培養(yǎng)到第六天時可見組織塊周圍有細胞攀爬出來，此后兩天便可進行初次傳代當(dāng)前第21頁\共有38頁\編于星期三\22點三MSC的原代培養(yǎng)實驗前準(zhǔn)備器械消化酶FD-12培養(yǎng)基其他大號止血鉗：2把小號止血鉗：2把小號培養(yǎng)皿：2個大號組織剪：2把眼科剪（直）：1把眼科鑷（直）：2把

胰酶Try(2.5mg/ml)α-MEM培養(yǎng)原液85mlFBS15mlL-Glu1ml濃度為200mmol/LSD大鼠一只細胞培養(yǎng)瓶NS.5ml注射器當(dāng)前第22頁\共有38頁\編于星期三\22點培養(yǎng)方法全骨髓培養(yǎng)法和密度梯度離心法實驗步驟1將滅菌后的實驗物品按操作順序擺放在超凈工作臺內(nèi)（超凈工作臺內(nèi)事先UV滅菌）

注意：紫外滅菌時應(yīng)關(guān)閉日光燈，送風(fēng)機，人員要離開生化間，30分鐘后返回關(guān)閉紫外燈，打開日光燈，風(fēng)機。5分鐘后進行實驗

將實驗過程中需要的用到的器械依次擺放在酒精燈周圍當(dāng)前第23頁\共有38頁\編于星期三\22點將老鼠引頸處死，放入事先配好的醫(yī)用酒精內(nèi)浸泡15分鐘后，轉(zhuǎn)移到超凈室內(nèi)。用大號止血鉗夾住鼠尾，用無菌NS.將大鼠身上的酒精沖洗干凈后，放入無菌半月盤內(nèi)，轉(zhuǎn)移至超凈臺內(nèi)。剪去鼠尾。用第一套器械，小心剝離老鼠四肢表皮，露出肌肉層。

用第二套器械，小心剝離老鼠四肢上的肌肉層，露出股骨和脛骨當(dāng)前第24頁\共有38頁\編于星期三\22點用第三套器械，小心剝離老鼠的脛骨和股骨注意：此步驟很關(guān)鍵，在分離四肢股骨、脛骨時要格外小心，最好用眼科剪，不可暴露骨髓腔將股骨和脛骨轉(zhuǎn)移到小培養(yǎng)皿內(nèi)，里面倒入少許NS.，用眼科剪和眼科鑷將骨頭周圍的肌肉組織剝離

將剝離后的股骨和脛骨轉(zhuǎn)移到一新的培養(yǎng)皿內(nèi)，小心并迅速用大號組織剪剪斷骨頭兩端，暴露骨髓腔。不建議使用酒精，此步驟以前各步在保證無菌操作情況下可避免染菌當(dāng)前第25頁\共有38頁\編于星期三\22點將剪斷的骨髓，用5ml的注射器吸取無血清培養(yǎng)基反復(fù)沖洗骨髓腔。收集骨髓懸液的培養(yǎng)基。

在50ml離心管內(nèi)加入Ficoll人淋巴細胞分離液，將細胞懸液小心的鋪在分離液上層注意：在操作此步驟時，要戴好手套，口罩，在Ficoll液面上鋪細胞時眼睛要與頁面平齊小心封口離心管，離心機內(nèi)離心，設(shè)定為2000r/min,30分鐘

離心后取出離心管，小心吸取離心管內(nèi)中間白色云霧層，用無血清培養(yǎng)基混勻后再次離心，設(shè)定為1500r/min,10分鐘當(dāng)前第26頁\共有38頁\編于星期三\22點將離心后的上清液棄除，用新鮮的全培養(yǎng)基垂懸細胞，裝入細胞培養(yǎng)瓶15將細胞培養(yǎng)瓶放入37℃,5%，CO2孵箱培養(yǎng)24小時后將細胞瓶內(nèi)的培養(yǎng)基吸出放入新的培養(yǎng)瓶內(nèi)，讓尚未貼壁的細胞繼續(xù)貼壁

一般在24h后細胞便可見梭型形，一周后傳代當(dāng)前第27頁\共有38頁\編于星期三\22點EPC的原代培養(yǎng)方法同MSC，培養(yǎng)基內(nèi)加入VEGF誘導(dǎo)因子即可SPC的原代培養(yǎng)方法同上，培養(yǎng)基內(nèi)加入PDGF-BB誘導(dǎo)因子即可

外周血來源的EPC的培養(yǎng)同MSC的操作步驟（11—17）

人臍帶間充質(zhì)干細胞的培養(yǎng)同SMC組織貼壁法。去除動脈血管和靜脈血管后組織貼壁即可當(dāng)前第28頁\共有38頁\編于星期三\22點八細胞試驗中注意的要點關(guān)于傳代問題atry配置時PH=7.4時效果較好btry使用時的溫度37度時效果較好，過低不易消化，導(dǎo)致細胞死亡ctry消化后離心重新垂懸細胞活性高當(dāng)前第29頁\共有38頁\編于星期三\22點d細胞傳代時要充分混勻上圖為傳代時沒有充分混勻?qū)е录毎麍F聚嚴(yán)重當(dāng)前第30頁\共有38頁\編于星期三\22點關(guān)于血清問題aEC培養(yǎng)時血清含量不要高于20%。否則老化速度過快bsmc培養(yǎng)時原代血清含量控制在15%，傳代后控制10%左右，可有效控制其老化速度c干細胞培養(yǎng)時同SMC，在細胞旺盛期血清含量可進一步下調(diào)至5%當(dāng)前第31頁\共有38頁\編于星期三\22點關(guān)于染菌問題a常見的多為真菌感染，細胞瓶內(nèi)可見白色菌絲。一旦出現(xiàn)此種情況，需要立刻丟棄細胞瓶。孵箱內(nèi)重新進行滅菌處理b常見細菌感染如桿菌球菌支原體等c最近實驗室出現(xiàn)黑膠蟲染菌現(xiàn)象當(dāng)前第32頁\共有38頁\編于星期三\22點對于“黑膠蟲”的處理方法：

首先，血清買回來滅活前凍融應(yīng)逐級凍融，即按照-20℃——4℃完全融化后，再置入水浴中，與室溫一起升高到56度，這樣的目的是避免溫度驟變，導(dǎo)致血清中的營養(yǎng)物質(zhì)喪失活性。

第二，血清滅活后分裝保存。按照每次用血清的量分裝，盡量減少血清凍融的次數(shù)。分裝時注意無_第三，細胞培養(yǎng)時血清濃度稍大一些。通常細胞培養(yǎng)血清濃度為10%-15%，但如果血清凍融次數(shù)過多，那營養(yǎng)物質(zhì)喪失活性，按15%的濃度配制事實上達不到15%的營養(yǎng)成分，故培養(yǎng)基配置時一般用18%-20%的血清。當(dāng)前第33頁\共有38頁\編于星期三\22點4關(guān)于細胞凍存a10%的DMSO、40%胎牛血清、50%培養(yǎng)基b4℃,40分鐘;-20℃,30分鐘;-80℃,24h后液氮罐保存

c如果凍存細胞多要先把凍存液配好放四度冰箱(因為DMSO放熱，剛加進去和容易損傷細胞，常溫DMSO對細胞毒性也大。)

d凍存的原則是慢凍快蘇

當(dāng)前第34頁\共有38頁\編于星期三\22點關(guān)于熒光染色實驗步驟

1細胞取出固定2h后，也可4℃保存多日后一起染色2將孔板內(nèi)固定液（2.5%戊二醛或者4%多聚甲醛）吸出，用PBS清洗3次，每次5分鐘3用triton脫細胞液（0.1%濃度）包被樣品5分鐘，目的是增加細胞通透性，后用PBS清洗3次當(dāng)前第35頁\共有38頁\編于星期三\22點BSA封閉液封閉（具體看抗體的種屬來選擇包被液)37℃4h,也可以4℃過夜

Ⅰ抗30um/well即可，37℃30分鐘

取出樣品清洗3次，每次