遺傳學(xué)第4章-原生質(zhì)體培養(yǎng)及融合配色

遺傳學(xué)第4章-原生質(zhì)體培養(yǎng)及融合配色第一頁，共106頁。小原生質(zhì)體(miniprotoplast)：也稱核質(zhì)體(nuclearplast)，具備完整細胞核，但只含有部分細胞質(zhì)。微小原生質(zhì)體(microprotoplast)：只有1條或幾條染色體的情況。胞質(zhì)體（cytoplast）：不含細胞核，只有細胞質(zhì)。原生質(zhì)體融合：也稱為細胞融合或體細胞雜交。是指將植物的不同種、屬甚至科間的原生質(zhì)體，通過人工方法誘導(dǎo)融合，然后進行離體培養(yǎng)，使其再生成為雜種植株的技術(shù)。第二頁，共106頁。原生質(zhì)體植物細胞小原生質(zhì)體（核質(zhì)體）胞質(zhì)體細胞膜細胞壁細胞核微小原生質(zhì)體染色體第三頁，共106頁。

第一節(jié)

原生質(zhì)體培養(yǎng)一、原生質(zhì)體培養(yǎng)的發(fā)展歷史

要進行原生質(zhì)體培養(yǎng)，首先必須分離原生質(zhì)體，即去除細胞壁，得到完整的裸露細胞。植物原生質(zhì)體培養(yǎng)研究中幾個重要的成就：1880年，Hanstein首次提出原生質(zhì)體(protoplast)一詞。1892年，Klercker采用機械法分離原生質(zhì)體，但效率極低，無法進行培養(yǎng)和再生。第四頁，共106頁。甜菜洋蔥蘿卜黃瓜第五頁，共106頁。1960年，英國諾丁漢大學(xué)的Cocking教授首次使用纖維素酶酶解法處理番茄的幼根，獲得了大量具有高度活性的原生質(zhì)體。1968年后，由于纖維素酶、離析酶投入了市場，使原生質(zhì)體分離技術(shù)日益發(fā)展和成熟，原生質(zhì)體培養(yǎng)也開始成為熱門研究領(lǐng)域。1971年，Takebe等首次將煙草葉肉原生質(zhì)體培養(yǎng)成完整植株。1985年，F(xiàn)ujimura等獲得第一例禾谷類作物，即水稻原生質(zhì)體的再生植株。

1986年，Spangenberg等由甘藍型油菜的單個原生質(zhì)體培養(yǎng)得到再生植株。（白菜型、芥菜型和甘藍型）第六頁，共106頁。BACK第七頁，共106頁。

隨后，其它植物上也逐漸有原生質(zhì)體再生植株成功的報道，包括糧食作物、油料作物、經(jīng)濟作物和一些藥用植物。據(jù)1993統(tǒng)計，已有49個科，146個屬的320多種植物，都可經(jīng)原生質(zhì)體培養(yǎng)得到再生植株。雖然大體上仍以農(nóng)作物和經(jīng)濟作物為主，但已從一年植物生向多年生植物、從草本植物向木本植物、從高等植物向低等植物擴展。第八頁，共106頁。二、原生質(zhì)體培養(yǎng)的意義1、為細胞融合提供直接方法2、為遺傳轉(zhuǎn)化提供新的途徑原生質(zhì)體沒有細胞壁，可以直接吸收外源DNA，或通過電擊穿孔法、PEG法等方法，將基因?qū)朐|(zhì)體，實現(xiàn)遺傳轉(zhuǎn)化。3、利用原生質(zhì)體培養(yǎng)中廣泛發(fā)生的變異，選育新品種。第九頁，共106頁。4、用于細胞器的分離與轉(zhuǎn)移由于原生質(zhì)體沒有細胞壁的障礙，可以進行亞細胞水平的操作研究。如葉綠體、線粒體、細胞核、染色體等的攝取。在攝取細胞器后進行培養(yǎng)，獲得再生植株，根據(jù)再生植株的表現(xiàn)，即可進行遺傳分析，研究某種細胞器的功能或其所控制的性狀。也可以通過細胞器的轉(zhuǎn)移，使物種獲得相應(yīng)的性狀。第十頁，共106頁。

5、

用于理論研究如細胞壁的生物合成、原生質(zhì)膜的結(jié)構(gòu)與功能、激素的作用機理、病毒的侵染機理等。原生質(zhì)體研究已在細胞生物學(xué)、生物技術(shù)、生理學(xué)、遺傳學(xué)、病理學(xué)、病毒學(xué)、育種學(xué)等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。6、用于種質(zhì)資源保存

第十一頁，共106頁。第十二頁，共106頁。Aschemeofplantprotoplast

PlantsSuspensioncellsPre-treatmentenzymolysisPurificationVigourtestCutureandregeneration第十三頁，共106頁。三、原生質(zhì)體的分離

1、取材：材料的類別對原生質(zhì)體培養(yǎng)很重要可采用離體培養(yǎng)植株、田間或溫室植株，利用其葉片、葉柄、莖段等均可分離原生質(zhì)體，但一定要選用幼嫩部分。近年來，為了提高原生質(zhì)體再生的頻率，最常用的是以下幾類材料：無菌試管苗的葉片上胚軸和子葉處于對數(shù)生長期的細胞懸浮系第十四頁，共106頁。2、酶的種類和作用原生質(zhì)體分離的效果主要取決于酶的種類和濃度。目前主要使用的酶有：果膠酶類纖維素酶類半纖維素酶類和崩潰酶等有時還會使用蝸牛酶。第十五頁，共106頁。第十六頁，共106頁。1）果膠酶類從根霉或黑曲霉中提取，能降解中膠層，使細胞從組織中釋放出來。常用的果膠酶商品制劑：

PectinaseSigma

MacerozymeR-10JapanPectolyaseY-23

Japan(價格昂貴)

第十七頁，共106頁。2）纖維素酶類從綠色木霉中提取的一種復(fù)合酶制劑，其作用是降解細胞壁中的纖維素，使原生質(zhì)體釋放出來。常用的商品酶制劑：EA-867中科院上海植生所CellulaseOnzukaR-10JapanCellulaseOnzukaRSJapan（價格昂貴）MeicelasePJapanCellulaseUSADriselase（崩潰酶，具多種活性）Japan第十八頁，共106頁。3）半纖維素酶用于降解細胞壁中的半纖維素，主要商品制劑有：

HemicellulaseH-2125SigmaRhozymeHP-150USA4）蝸牛酶：分離孢粉素、胼胝質(zhì)第十九頁，共106頁。

各公司生產(chǎn)的酶的效果不盡相同，使用時應(yīng)予以注意。必須控制好濃度、溫度和處理時間，例如：

CellulaseOnzukaR-10Japan22hCellulaseOnzukaRSJapan3-5h（兩種纖維素酶的活性大約差10倍）第二十頁，共106頁。3、酶液的滲透壓原生質(zhì)體的一個基本屬性是滲透破損性。因此，酶液、原生質(zhì)體洗滌液及培養(yǎng)基中都要加入適量的滲透壓穩(wěn)定劑。常用的穩(wěn)定劑分為兩類：

1）糖溶液系統(tǒng)

2）鹽溶液系統(tǒng)第二十一頁，共106頁。1）糖溶液系統(tǒng)多用甘露醇、山梨醇、葡萄糖、蔗糖等，目前廣泛使用的是甘露醇和山梨醇。蔗糖因?qū)υ|(zhì)體培養(yǎng)不利，很少使用。

2）鹽溶液系統(tǒng)主要使用：KCl、MgSO4?7H2O第二十二頁，共106頁。4、細胞質(zhì)膜穩(wěn)定劑細胞質(zhì)膜穩(wěn)定劑，能防止質(zhì)膜破壞，提高原生質(zhì)體的穩(wěn)定性，保持原生質(zhì)體的活性，促進細胞壁再生及細胞分裂等。常用的質(zhì)膜穩(wěn)定劑有：葡聚糖硫酸鉀、CaCl?2H2O、KH2PO4等。

MES：2-(N-morpholino)ethanesulfonicacid，即2-氮嗎啉乙烷磺酸，可穩(wěn)定酶液的pH值。牛血清蛋白：可減少酶解過程中對細胞器的損傷，有利于原生質(zhì)體的存活。第二十三頁，共106頁。5、酶（混合）液的組成:

強活性的酶液配方，處理時間為3-5h：

PectolyaseY-230.1%CellulaseOnzukaRS2.0%

甘露醇0.6M

CaCl?2H2O0.5%

MES5.0mM

第二十四頁，共106頁。

弱活性的酶液配方，處理時間為20h：

MacerozymeR-100.2%CellulaseOnzukaR-100.4%

甘露醇0.6MCaCl?2H2O0.5%MES5.0mM第二十五頁，共106頁。酶混合液的滅菌：采用微孔過濾器除菌，其濾膜的孔徑有0.45μm和0.22μm兩種型號，一般采用兩級過濾法，徹底除去酶液中的微生物第二十六頁，共106頁。6、原生質(zhì)體的游離（分離）與純化

1）原生質(zhì)體的游離經(jīng)酶液處理后，細胞壁被降解，釋放出球狀原生質(zhì)體。為使原生質(zhì)體從組織上解離下來，酶解的最后2小時需輕度振蕩，速度為45轉(zhuǎn)/分（rpm）。第二十七頁，共106頁。酶解液酶及其它不利于原生質(zhì)體培養(yǎng)的試劑。破碎的原生質(zhì)體、未去壁的細胞（團）、細胞器及碎片酶解后的產(chǎn)物包括：完整原生質(zhì)體第二十八頁，共106頁。第二十九頁，共106頁。2）純化具體方法為：先用不銹鋼網(wǎng)過濾，孔徑分別為400目和200目，過濾時要加入一些培養(yǎng)基清洗，常用CPW鹽溶液。第三十頁，共106頁。CPW鹽成分為：KH2PO427.2mg/LKNO3101.0mg/LCaCl2.2H2O1480.0mg/LMgSO4.7H2O246.0mg/LKI0.16mg/LCuSO4.5H2O0.025mg/LpH5.8第三十一頁，共106頁。

然后，濾液中主要是原生質(zhì)體，可以采用三種方法進行進一步的純化：A、飄浮法B、沉降法C、界面法具體介紹如下：第三十二頁，共106頁。

A、漂浮法：使用的飄浮劑有蔗糖、Percoll（珀可，是由聚乙烯吡咯烷酮包被的SIO2顆粒的無菌膠體懸液）、Ficoll（菲可，水溶性聚蔗糖）。

原理：采用比原生質(zhì)體比重高的滲透溶液，使原生質(zhì)體漂浮在溶液表面，具體方法為：第三十三頁，共106頁。1、

將酶解后的原生質(zhì)體懸液混勻，通過孔徑44-169μm的篩網(wǎng)過濾（孔徑大小因植物種類而異），除去大的組織碎片和殘渣。2、將濾液與高滲溶液混合，在900-4500r/min下離心，小心吸取上層的原生質(zhì)體。重復(fù)洗2-3次。優(yōu)點：可得到較為純凈、完整的原生質(zhì)體。缺點：由于高滲溶液對原生質(zhì)體有傷害，因而活力高的原生質(zhì)體較少。第三十四頁，共106頁。第三十五頁，共106頁。B、離心沉淀法利用比重差別原理，在甘露醇溶液中低速離心，使原生質(zhì)體沉積在試管底部，然后再用Percoll飄浮一次。優(yōu)點：方法簡單。缺點：原生質(zhì)體沉積在試管底部，造成相互間擠壓，引起原生質(zhì)體破裂。酶解產(chǎn)物+原生質(zhì)體培養(yǎng)基400g，5min0.45mol/L甘露醇碎片帶原生體第三十六頁，共106頁。C、界面法：原理：采用兩種比重不同的溶液，其中一種比原生質(zhì)體大，一種更小，使原生質(zhì)體處于兩相的界面中。第三十七頁，共106頁。界面法（甘露醇182.17，蔗糖342.3

）優(yōu)點：可以收到數(shù)量較大的純凈原生質(zhì)體，避免收集過程中原生質(zhì)體相互擠壓而破碎。酶解產(chǎn)物+原生質(zhì)體培養(yǎng)基(0.45mol/L甘露醇)0.45mol/L蔗糖400g，離心5min碎片帶（輕）原生體帶0.45mol/L蔗糖第三十八頁，共106頁。采界面法分離形成的原生質(zhì)體帶第三十九頁，共106頁。四.原生質(zhì)體活力測定目測法：在顯微鏡下觀察，根據(jù)細胞形態(tài)、胞質(zhì)環(huán)流現(xiàn)象確定原生質(zhì)體活力。FDA法：FDA（熒光素雙醋酸酯）是一種非極性物質(zhì)，本身無熒光，能夠自由穿越細胞質(zhì)膜，在活細胞內(nèi)，F(xiàn)DA被酯酶分解為熒光素而發(fā)出熒光，而且熒光素不能自由出入質(zhì)膜，因而可在細胞內(nèi)積累，通過熒光顯微鏡即可觀察細胞是否具有活性。伊文斯藍（Evansblue）法：伊文斯藍不能穿過質(zhì)膜，只有當(dāng)質(zhì)膜受到嚴(yán)重損壞時，細胞才會被染色，故能通過細胞染色與否確定原生質(zhì)體的活力。

第四十頁，共106頁。第四十一頁，共106頁。影響原生質(zhì)體活力的因素所用材料的基因型和生理狀態(tài)

酶解條件：酶的質(zhì)量和濃度、抗氧化劑、酶解溫度、酶解時間長短、酶溶液系統(tǒng)的滲透壓

分離操作條件：離心次數(shù)、離心速度、純化方法、分離持續(xù)時間

環(huán)境條件：操作時的溫度、分離器具的影響等

第四十二頁，共106頁。

以煙草為例（漂浮法）：

材料1g切碎→黑暗條件下用酶液處理，震蕩，使原生質(zhì)體游離→50μm過濾→在20%-30%蔗糖溶液上方輕輕加入過濾后的解離液→350×g離心→收集漂浮的原生質(zhì)體→加洗滌液懸浮，150×g離心洗滌2次→用液體培養(yǎng)基洗滌1次→培養(yǎng)第四十三頁，共106頁。

五、原生質(zhì)體培養(yǎng)培養(yǎng)密度很重要（原因）：一般以104-105個/ml為宜。一般采用的培養(yǎng)方法：液體培養(yǎng)基→固體增殖培養(yǎng)基→再分化培養(yǎng)基→器官、胚胎或植株分化。培養(yǎng)方式詳見第二節(jié)。第四十四頁，共106頁。1）液體培養(yǎng)分成三個階段

培養(yǎng)基Ⅰ：1/2無機鹽、正常有機成分、適量的水解酪蛋白、適量的激素、1%蔗糖、0.4-0.6M甘露醇，pH5.8

培養(yǎng)基Ⅱ：1/2無機鹽、正常有機成分、適量的水解酪蛋白、適量的激素、2%蔗糖、0.2-0.3M甘露醇,pH5.8

培養(yǎng)基Ⅲ：正常培養(yǎng)基，適量的激素、3%蔗糖,pH5.8第四十五頁，共106頁。

2）固體增殖培養(yǎng)液體培養(yǎng)中，待小愈傷組織生長至1-2mm后，轉(zhuǎn)移到固體培養(yǎng)基上。固體增殖培養(yǎng)基：MS或其他基本培養(yǎng)基，添加適量的激素，使愈傷組織迅速增殖。

第四十六頁，共106頁。

3）再分化培養(yǎng)基以分裂素為主，也可不添加激素，目的是促使愈傷組織再生植株。根據(jù)植物不同，培養(yǎng)方法及再生途徑往往也不相同。有的植物，在液體培養(yǎng)基中就可以形成胚狀體，有的植物則需要在固體培養(yǎng)基上才能形成不定芽。

第四十七頁，共106頁。原生質(zhì)體培養(yǎng)過程原生質(zhì)體固體培養(yǎng)基上小愈傷組織細胞團再生植株再分化第四十八頁，共106頁。第四十九頁，共106頁。第五十頁，共106頁。第五十一頁，共106頁。第五十二頁，共106頁。

第二節(jié)

原生質(zhì)體融合一、細胞融合的概念細胞融合，也稱原生質(zhì)體融合或體細胞雜交。是指兩種異緣（種間、屬間）原生質(zhì)體，在誘導(dǎo)劑誘發(fā)下或電沖擊下，發(fā)生膜融合、胞質(zhì)融合和核融合，形成雜種細胞，并進一步發(fā)育成雜種植株。

第五十三頁，共106頁。第五十四頁，共106頁。第五十五頁，共106頁。

二、原生質(zhì)體融合的發(fā)展歷史

1909年，Kuster用低滲NaNO3溶液引起原生質(zhì)體的融合。

1972年，Carlson等用NaNO3融合方法獲得了第一株體細胞雜種，即煙草與其野生種間體細胞雜種。但NaNO3法異核體形成率低，且對細胞有毒害。第五十六頁，共106頁。1973年，Keller和Melchers用高pH和高鈣離子濃度（50mMCaCl2·2H2O，pH10.5）溶液誘導(dǎo)煙草葉肉原質(zhì)體融合，獲得種內(nèi)及種間的體細胞雜種。但該方法異核體形成率低，而且對細胞有毒害。

第五十七頁，共106頁。1974年，Kao和Michaylub用聚乙二醇（polyethyleneglycol，

PEG

）作融合劑，明顯提高了異核體的形成率，且對細胞的毒性很低。因此，該方法迅速推廣開來。

1978年，Melchers等用PEG法，成功獲得了西紅柿與馬鈴薯體細胞雜種。第五十八頁，共106頁。1979年，Senda發(fā)明電融合方法。對原生質(zhì)體無毒害，也得到廣泛應(yīng)用。目前，種內(nèi)、種間、屬間體細胞雜種已在許多植物上成功。

第五十九頁，共106頁。

三、細胞融合的意義1、克服遠緣雜交不親和性，為廣泛重組遺傳物質(zhì)開辟新途徑(如利用野生種資源）2、可縮短育種年限3、利用細胞融合技術(shù)轉(zhuǎn)移細胞器（如葉綠體、線粒體等）及目的基因等。第六十頁，共106頁。4、利用非對稱融合創(chuàng)造核質(zhì)雜種

非對稱細胞融合技術(shù)，是利用物理因素(如X、γ或UV射線)輻射某一種原生質(zhì)體，使其細胞核或染色體失活；同時利用碘乙酰胺、碘乙酸或羅丹明6-G處理另一種原生質(zhì)體，使其細胞質(zhì)失活，然后融合這兩類原生質(zhì)體，即可實現(xiàn)細胞質(zhì)和細胞核基因的組合，或使前者中被打碎的部分染色體片段滲入到后者原生質(zhì)體內(nèi)，實現(xiàn)個別基因的轉(zhuǎn)移，用以改良個別性狀。第六十一頁，共106頁。四、融合方式：根據(jù)融合時細胞的完整程度，原生質(zhì)體融合可分為：（一）、對稱融合（asymmetricfusion）－即兩個完整的細胞原生質(zhì)體融合。（二）、非對稱融合（symmetricfusion）－利用物理或化學(xué)方法使某親本的核或細胞質(zhì)失活后再進行融合，

第六十二頁，共106頁。（三）、體-配融合（gameto-somaticfusion）用親本之一的四分體小孢子原生質(zhì)體與另一親本的體細胞原生質(zhì)體進行融合的過程。融合后的雜種細胞經(jīng)培養(yǎng)可獲得三倍體植株。第六十三頁，共106頁。與有性雜交培育三倍體相比它省去培育四倍體的程序，提高了效率；另一方面，親本之一為體細胞，沒有發(fā)生基因分離重組，融合產(chǎn)生的三倍體雜種有希望保持原來親本的優(yōu)良性狀(穩(wěn)定)而四分體小孢子是減數(shù)分裂的產(chǎn)物，其原生質(zhì)體之間存在差異，兩者融合后為變異雜種的選擇提供了可能（變異）。鄧秀新等已獲得柚子四分體小孢子原生質(zhì)體與伏令夏甜橙胚性愈傷組織原生質(zhì)體的三倍體胚狀體。第六十四頁，共106頁。（四）、亞原生質(zhì)體-原生質(zhì)體融合即用射線照射親本之一的原生質(zhì)體，使其細胞核失活對另一親本原生質(zhì)體用代謝抑制劑處理，抑制其細胞質(zhì)分裂雜合體具有親本之一的細胞質(zhì)與另一親本的細胞質(zhì)和細胞核，但染色體的倍性不增加。第六十五頁，共106頁。用于細胞核或細胞質(zhì)失活的方法分為物理和化學(xué)兩大類：物理方法常采用射線處理，如X射線、射線等，它們能使細胞核失活；化學(xué)處理目前常用的試劑有，核失活－碘乙酰胺（IOA）、碘乙酸(Iodoacetate)；質(zhì)失活－羅丹明（R－6－G，它是一種親脂染料，能夠抑制線粒體的氧化磷酸化過程而達到失活作用。

第六十六頁，共106頁。五、細胞融合的方法（一）自發(fā)融合在酶解細胞壁的過程中，有些相鄰的原生質(zhì)體能彼此融合形成同核體（可包括2~40個核）。這種融合稱為自發(fā)融合，或自體融合，是由于細胞間胞間連絲的收縮和粘連造成的。不是我們的實驗?zāi)康摹５诹唔?，?06頁。

（二）誘發(fā)融合

1、

鹽類誘導(dǎo)融合法是應(yīng)用最早的融合法，但由于其異核體形成率低，而且對細胞有毒害，目前已不大采用。如NaNO3、KNO3、Ca(NO3)2、NaCl、CaCl2、葡聚糖硫酸鈉、葡聚糖硫酸鉀等。第六十八頁，共106頁。2、高pH－高鈣誘導(dǎo)融合法

CaCl2?2H2O0.05mol/L，，可使質(zhì)膜表面特性發(fā)生改變，促進融合發(fā)生。但由于異核體形成率低，而且對細胞有毒害，目前也已不大采用。

第六十九頁，共106頁。3、PEG誘導(dǎo)融合法

PEG（聚乙二醇）誘導(dǎo)融合的優(yōu)點是融合成本低（不需要特殊設(shè)備）；融合子的異核率較高；融合過程不受物種限制。但缺點是融合過程繁瑣，且PEG對細胞也有一定的毒害。

PEG的作用機理：Kao等認為，由于PEG分子具有輕微的負極性，故可以與具有正極性基團的水、蛋白質(zhì)和碳水化合物等形成氫鍵，從而在原生質(zhì)體之間形成分子橋，有助于原生質(zhì)體發(fā)生相互粘連，進而促使原生質(zhì)體的融合；另外，PEG還能增加類脂膜的流動性，也可使原生質(zhì)體的核、細胞器等發(fā)生融合。

第七十頁，共106頁。,P1P2P1P2混合靜止1min.融合融合液加入PEG稀釋洗滌加入稀釋液加入培養(yǎng)液培養(yǎng)選擇聚乙二醇（PEG）融合法操作程序第七十一頁，共106頁。PEG法原誘導(dǎo)生質(zhì)體融合過程融合過程：圖：ABCDEF融合原生質(zhì)體的位置：BICIDIEIFIBⅡCⅡDⅡEⅡFⅡBⅢCⅢDⅢEⅢFⅢ第七十二頁，共106頁。

融合過程可分為三個階段：

1）

凝聚作用階段，在此期間兩個或兩個以上的原生質(zhì)體的質(zhì)膜彼此靠近。

2）

在局部區(qū)域質(zhì)膜緊密粘連并融合，形成細胞質(zhì)橋。

3）

細胞質(zhì)橋進一步擴展，融合完成，形成異核體或同核體。第七十三頁，共106頁。第七十四頁，共106頁。第七十五頁，共106頁。4．電融合法

原理：當(dāng)原生質(zhì)體以適當(dāng)?shù)拿芏葢腋』旌虾螅迳想姌O，接通一定的交變電場，原生質(zhì)體發(fā)生極化后順著電場緊密接觸成串狀，再施以瞬間高強度的電脈沖，可使原生質(zhì)膜發(fā)生可逆性擊穿而實現(xiàn)融合。與PEG融合比較起來，電融合有三大優(yōu)點：不使用有毒試劑，作用條件溫和，對細胞較安全；融合基本上是同步發(fā)生的，融合效率高；融合技術(shù)操作簡便。電融合法開發(fā)較晚，但目前的應(yīng)用比較廣泛。第七十六頁，共106頁。電融合儀的結(jié)構(gòu)特點：

交變電場部分高頻直流電擊部分第七十七頁，共106頁。第七十八頁，共106頁。電融合的基本過程：質(zhì)膜的接觸：當(dāng)原生質(zhì)體置于低電導(dǎo)率的溶液中，電場通電（2-4V/mm）后，電流即通過原生質(zhì)體而不是通過溶液，使原生質(zhì)體極化而產(chǎn)生偶極子，從而使原生質(zhì)體緊密接觸排列成串珠狀；膜的擊穿：原生質(zhì)體成串排列后，立即給予高頻直流脈沖(強度50-200V/mm，脈沖期為20-50微秒)，即可使原生質(zhì)膜擊穿，導(dǎo)致兩個緊密接觸的細胞融合在一起。通常一次融合處理可給予幾個脈沖，脈沖間隔為1-2秒。第七十九頁，共106頁。第八十頁，共106頁。a.未通電時，b.通電后；c.高頻直流脈沖第八十一頁，共106頁。第八十二頁，共106頁。六、融合細胞的培養(yǎng)（4種方法）

液體淺層培養(yǎng)將含有原生質(zhì)體的培養(yǎng)液在培養(yǎng)皿底部鋪一薄層，封口后進行培養(yǎng)。優(yōu)點：操作簡單，對原生質(zhì)體的損傷小，且易于添加新鮮培養(yǎng)基和轉(zhuǎn)移培養(yǎng)物。缺點：原生質(zhì)體分布不均勻，常常發(fā)生原生質(zhì)體之間的粘連現(xiàn)象而影響其進一步的生長和發(fā)育。此外，難以跟蹤觀察某一個細胞的發(fā)育情況。原生質(zhì)體懸浮液（原生質(zhì)體+培養(yǎng)基）第八十三頁，共106頁。固體平板培養(yǎng)

固體培養(yǎng)也就是瓊脂糖包埋培養(yǎng)。低融點的瓊脂糖可在30C左右融化并與原生質(zhì)體混合而不影響其活力?；旌虾蟮暮性|(zhì)體的培養(yǎng)基鋪于培養(yǎng)皿底部，封口后進行培養(yǎng)。優(yōu)點：可以跟蹤觀察單個原生質(zhì)體的發(fā)育情況，易于統(tǒng)計原生質(zhì)體分裂頻率。缺點：操作要求嚴(yán)格，尤其是混合時的溫度掌握必需合適，溫度偏高影響原生質(zhì)體的活力，偏低則瓊脂糖凝固太快導(dǎo)致與原生質(zhì)體混合不均勻。第八十四頁，共106頁。液體－固體雙層培養(yǎng)在培養(yǎng)皿的底部鋪一層瓊脂糖固體培養(yǎng)基，再將原生質(zhì)體懸浮液滴于固體培養(yǎng)基表面。優(yōu)點：固體培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)可以緩慢釋放到液體培養(yǎng)基中，如果在下層固體培養(yǎng)基中添加一定量的活性炭，則還可以吸附培養(yǎng)物產(chǎn)生的一些有害物質(zhì)，促進原生質(zhì)體的分裂和細胞團的形成。缺點：不易觀察細胞的發(fā)育過程。瓊脂糖固體培養(yǎng)基原生質(zhì)體懸浮液第八十五頁，共106頁。瓊脂糖珠培養(yǎng)將含有原生質(zhì)體的液態(tài)瓊脂糖培養(yǎng)基用吸管以大約50l一滴的量滴于直徑6cm的培養(yǎng)皿，待其固化后向其中添加3ml液體培養(yǎng)基并于搖床上低速旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)(Thompson等,1986)。培養(yǎng)過程中，通過調(diào)整液體培養(yǎng)基的滲透壓來調(diào)節(jié)培養(yǎng)物的滲透壓以利于其進一步的生長和發(fā)育。這種方法由于改善了培養(yǎng)物的通氣和營養(yǎng)環(huán)境，從而促進了原生質(zhì)體的分裂和細胞團的形成。瓊脂糖珠培養(yǎng)液第八十六頁，共106頁。第三節(jié)雜種細胞的選擇

及體細胞雜種植株的鑒定雜種細胞的選擇體細胞雜種植株的鑒定第八十七頁，共106頁。

一、融合體的類型

1、未融合細胞再生植株與雙親之一相同

2、自體融合得到“同核體”或同源多倍體

第八十八頁，共106頁。3、

異體融合得到“異核體”，但由于融合形式不同，又可得到以下的不同結(jié)果：（1）完全和諧的細胞雜種細胞完全融合，具有雙親各自的全套遺傳信息（包括細胞核、細胞質(zhì)）。再生植株為異源雙二倍體。這是最理想的融合。（2）部分和諧的細胞雜種細胞完全融合，但由于染色體排斥，在細胞分裂過程中，部分染色體被排斥掉。如甘薯+野生種的體細胞雜種第八十九頁，共106頁。

（3）核質(zhì)雜種細胞質(zhì)來自于雙親或雙親之一，核只來自于一個親本，另一個親本的核被完全排斥。（4）嵌合細胞雜種細胞質(zhì)發(fā)生融合，但細胞核未融合，細胞核各自分裂，形成嵌合體，再生植株為嵌合體植株。第九十頁，共106頁。

二、雜種細胞的選擇融合處理后，會產(chǎn)生各種各樣的細胞。異核體的分裂和分化，往往受到抑制，因此，必要時，應(yīng)在培養(yǎng)早期對雜種細胞進行選擇和單獨培養(yǎng)。但并非所有的融合都