蛋白質(zhì)指紋圖譜技術(shù)探究

蛋白質(zhì)指紋圖譜技術(shù)探究

1蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法

目前蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在實(shí)驗(yàn)診斷與臨床醫(yī)學(xué)中已經(jīng)得到越來越多的應(yīng)用。在蛋白質(zhì)組學(xué)中以下三項(xiàng)技術(shù)的進(jìn)步對(duì)于實(shí)驗(yàn)診斷與臨床醫(yī)學(xué)研究進(jìn)展將具有決定性的影響[2~5]。

1?1蛋白質(zhì)的分離技術(shù)

在蛋白質(zhì)組學(xué)中應(yīng)用分離技術(shù)有兩個(gè)目的。第一,通過將蛋白質(zhì)的混合物分離成單一蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)小組以簡化復(fù)雜的蛋白質(zhì)混合物;第二,通過標(biāo)記的方法可以比較兩個(gè)蛋白質(zhì)的混合物樣品中蛋白質(zhì)的不同表現(xiàn)。其中主要的技術(shù)有雙向電泳、高效液相層析、毛細(xì)管電泳、親和層析、蛋白芯片、磁性微球和免疫組等。特別是蛋白芯片和磁性微球兩項(xiàng)新的蛋白質(zhì)指紋圖譜技術(shù)克服了以往技術(shù)的缺點(diǎn),具有高靈敏度、高通量、結(jié)果重復(fù)性好、可機(jī)械化操作和方法靈活等特點(diǎn)。待測樣品來源廣泛,不需作特殊前處理,可以直接點(diǎn)樣檢測,如血清、尿液及組織液等;檢測快速,一般一例標(biāo)本的檢測時(shí)間僅需約5min,從標(biāo)本制備到出結(jié)果全過程僅約1h。蛋白芯片和磁性微球兩項(xiàng)新的蛋白質(zhì)指紋圖譜技術(shù)有可能在體液中潛在腫瘤標(biāo)志檢測方面創(chuàng)造革命性突破。

1?2生物質(zhì)譜技術(shù)

生物質(zhì)譜是化學(xué)領(lǐng)域中非常重要的一種分析方法。它通過測定分子質(zhì)量和相應(yīng)的離子電荷實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品中分子的分析。19世紀(jì)末科學(xué)家已經(jīng)奠定了這種方法的基礎(chǔ),1912年科學(xué)家第一次利用它獲得對(duì)分子的分析結(jié)果。在質(zhì)譜分析領(lǐng)域,已經(jīng)出現(xiàn)了幾項(xiàng)諾貝爾獎(jiǎng)成果,其中包括氫同位素氘的發(fā)現(xiàn)和碳60的發(fā)現(xiàn)。不過,最初科學(xué)家只能將它用于分析小分子和中型分子,由于生物大分子比水這樣的小分子大成千上萬倍,因而將這種方法應(yīng)用于生物大分子難度很大。美國科學(xué)家約翰?芬恩與日本科學(xué)家田中耕一在傳統(tǒng)的質(zhì)譜分析法基礎(chǔ)上發(fā)明了一種新方法:對(duì)生物大分子的質(zhì)譜分析法。首先將成團(tuán)的生物大分子拆成單個(gè)的生物大分子,并將其電離,使之懸浮在真空中,然后讓它們在電場的作用下運(yùn)動(dòng)。不同質(zhì)量的分子通過指定距離的時(shí)間不同,質(zhì)量小的分子速度快些,質(zhì)量大的分子速度慢些,通過測量不同分子通過指定距離的時(shí)間,就可計(jì)算出分子的質(zhì)量。蛋白質(zhì)組學(xué)常用的生物質(zhì)譜有五種,分別簡介如下。

1?2?1電噴霧電離質(zhì)譜:在毛細(xì)管的出口處施加一高電壓,所產(chǎn)生的高電場使從毛細(xì)管流出的液體霧化成細(xì)小的帶電液滴,隨著溶劑蒸發(fā),液滴表面的電荷強(qiáng)度逐漸增大,最后液滴崩解為大量帶一個(gè)或多個(gè)電荷的離子,致使分析物以單電荷或多電荷離子的形式進(jìn)入氣相。電噴霧離子化的特點(diǎn)是產(chǎn)生高電荷離子而不是碎片離子,使質(zhì)量電荷比降低到多數(shù)質(zhì)量分析儀器都可以檢測的范圍,因而大大擴(kuò)展了分子質(zhì)量的分析范圍,離子的真實(shí)分子質(zhì)量也可以根據(jù)質(zhì)荷比及電荷數(shù)算出。

1?2?2基質(zhì)輔助激光解析/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜的基本原理:將分析物分散在基質(zhì)分子中并形成晶體,當(dāng)用激光照射晶體時(shí),由于基質(zhì)分子經(jīng)輻射吸收能量,導(dǎo)致能量蓄積并迅速產(chǎn)熱,從而使基質(zhì)晶體升華,致使連同分析物一起進(jìn)入氣相。MALDI-TOF-MS所產(chǎn)生的質(zhì)譜圖多為單電荷離子,因而質(zhì)譜圖中的離子與多肽和蛋白質(zhì)的質(zhì)量有一一對(duì)應(yīng)關(guān)系。MALDI-TOF-MS與蛋白芯片分離技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用即為表面增強(qiáng)激光解析/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜。

1?2?3快原子轟擊質(zhì)譜:一種軟電離技術(shù),應(yīng)用快速惰性原子射擊存在于底物中的樣品,使樣品離子濺出進(jìn)入分析器。這種軟電離技術(shù)適于極性強(qiáng)、熱不穩(wěn)定的化合物的分析,特別適用于多肽和蛋白質(zhì)等的分析研究。

1?2?4同位素質(zhì)譜:一種開發(fā)和應(yīng)用比較早的技術(shù),被廣泛地應(yīng)用于各個(gè)領(lǐng)域,但它在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用只是近幾年的事。由于某些病原菌具有分解特定化合物的能力,該化合物又易于用同位素標(biāo)示,人們就想到用同位素質(zhì)譜的方法檢測其代謝物中同位素的含量以達(dá)到檢測該病原菌的目的,同時(shí)也為同位素質(zhì)譜在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用開辟了一條思路。

1?2?5免疫組質(zhì)譜:質(zhì)譜與抗體分離技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用。免疫組質(zhì)譜檢測的定義為一組多種抗體與質(zhì)譜聯(lián)合來精確地鑒別變異或修飾生物標(biāo)志群的方法。在一個(gè)抗體組基質(zhì)上同時(shí)捕獲多個(gè)生物標(biāo)志,并對(duì)捕獲的變異或修飾的生物標(biāo)志進(jìn)行質(zhì)譜精確分析?？梢酝瑫r(shí)檢測多個(gè)生物標(biāo)志群。免疫組質(zhì)譜檢測的主要優(yōu)點(diǎn)為節(jié)省生物標(biāo)志的排序鑒定及鑒別變異或修飾的生物標(biāo)志。在實(shí)驗(yàn)診斷與臨床醫(yī)學(xué)研究中應(yīng)用比較廣泛的是電噴霧電離質(zhì)譜技術(shù)和基質(zhì)輔助激光解析/電離質(zhì)譜技術(shù),這兩項(xiàng)質(zhì)譜技術(shù)都能與多種分離技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用,例如LC-MS、CE-MS和SELDI-TOF-MS等。質(zhì)譜技術(shù)在未來幾年的實(shí)驗(yàn)診斷與臨床醫(yī)學(xué)研究中必然會(huì)像SDS一樣普遍和重要。

1?3蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫

蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展離不開蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫的發(fā)展及檢索方法的改進(jìn),同時(shí)由于蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展,使得蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫日益豐富。數(shù)據(jù)庫的專一性和綜合性越來越強(qiáng),而且通過生物信息學(xué)的應(yīng)用,可以對(duì)多個(gè)不同的數(shù)據(jù)庫進(jìn)行銜接。蛋白質(zhì)組學(xué)常用的數(shù)據(jù)庫按研究內(nèi)容可以分為兩類:結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫和系統(tǒng)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫。結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫包括蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及蛋白質(zhì)功能等數(shù)據(jù)庫,這類蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫主要提供蛋白質(zhì)的序列、功能、主要結(jié)構(gòu)等信息以幫助鑒定蛋白質(zhì),如NCBInr,Genpept,SwissProt,OwlanddbEST等數(shù)據(jù)庫。系統(tǒng)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫包括雙向凝膠電泳及蛋白質(zhì)指紋圖譜庫等,這類蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫主要提供生命體各個(gè)系統(tǒng)或器官的總體蛋白質(zhì)系統(tǒng)動(dòng)態(tài)變化幫助對(duì)某個(gè)系統(tǒng)內(nèi)或疾病中的全景的蛋白質(zhì)水平進(jìn)行觀察,如、等數(shù)據(jù)庫。

2蛋白質(zhì)指紋圖譜技術(shù)用于疾病的檢測[6~9]

2006年10月28日美國長灘HUPO第五屆世界年會(huì)上提出疾病生物標(biāo)志的研究分為三個(gè)階段:發(fā)現(xiàn)疾病生物標(biāo)志、鑒定疾病生物標(biāo)志、驗(yàn)證疾病生物標(biāo)志。目前在臨床疾病檢查及診斷方面已建立了生化檢查、器械檢查、免疫及遺傳學(xué)檢查、手術(shù)及病理檢查等多種多樣的方法。但在疾病早期或受各種因素干擾而未出現(xiàn)癥狀或體征前,這些檢測方法多不靈敏或特異,難以對(duì)病人作出及時(shí)正確的診斷。而蛋白質(zhì)指紋圖譜技術(shù)在對(duì)臨床疾病檢測時(shí),抓住絕大多數(shù)疾病都有特異的生物標(biāo)志的本質(zhì),進(jìn)行疾病監(jiān)測和識(shí)別。即可對(duì)生物標(biāo)志做直接鑒定,故優(yōu)于酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、免疫熒光試驗(yàn)等間接測定生物標(biāo)志的方法。同時(shí),還有一套靈敏的監(jiān)測系統(tǒng)來檢測和識(shí)別這些微量生物標(biāo)志;因而決定了它在臨床檢測中的敏感性和準(zhǔn)確性。從理論上推論,任何有生物標(biāo)志表達(dá)的疾病都應(yīng)能被檢出,并作出及時(shí)診斷。在過去五年里,部分病例檢測和研究驗(yàn)證了此設(shè)想,特別是在腫瘤檢測方面取得了突破性進(jìn)展。

2?1腫瘤檢測

2004年,美國國立腫瘤研究所組織的早期疾病探測研究機(jī)構(gòu)多中心三期臨床實(shí)驗(yàn)得出結(jié)論:通過血清及儀器標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控,蛋白質(zhì)指紋圖譜技術(shù)是目前最有希望的腫瘤早期檢測方法[10]。據(jù)國內(nèi)外對(duì)12種腫瘤血清及尿液檢測結(jié)果統(tǒng)計(jì),蛋白質(zhì)指紋圖譜技術(shù)檢測敏感性和特異性均為80%~90%,明顯高于傳統(tǒng)腫瘤標(biāo)志物的檢測方法,故蛋白質(zhì)指紋圖譜技術(shù)特別對(duì)評(píng)估傳統(tǒng)腫瘤標(biāo)記物陰性的惡性腫瘤有意義[11]。

2?1?1肝癌:中國目前有1?3億乙型肝炎的病原攜帶者,其中包括2300萬乙型肝炎引起的肝硬化患者。肝細(xì)胞性肝癌主要由乙型肝炎導(dǎo)致的肝硬化引起。目前用于輔助診斷肝癌的甲胎蛋白試劑盒的特異性與敏感性都很差,無法用于鑒別肝癌與肝硬化。Liu等[12~13]在2003年《美國第94屆腫瘤年會(huì)》上正式報(bào)道蛋白質(zhì)指紋圖譜技術(shù)可鑒別由乙型肝炎引起的肝硬化與肝癌。通過分析血清蛋白質(zhì)指紋峰,發(fā)現(xiàn)下述五種蛋白質(zhì)指紋可以用于區(qū)分乙型肝炎肝硬化與肝癌。鑒定蛋白峰8933u為C3a-desArg。用已知的五項(xiàng)蛋白質(zhì)指紋,雙盲驗(yàn)證乙肝引起肝硬化與肝癌敏感性為91%,特異性為89%。用蛋白質(zhì)指紋圖譜技術(shù)也可鑒別由丙型肝炎引起的肝硬化與肝癌。Ward等[14]通過分析182例丙型肝炎引起肝硬化與肝癌,雙盲測試丙型肝炎引起肝硬化與肝癌敏感性為94%,特異性為86%。肝硬化的治療方法是保守治療,而肝癌必須通過手術(shù)治療,蛋白質(zhì)指紋方法準(zhǔn)確率為85%~90%。因此,這是目前最好的無創(chuàng)性檢測方法。

2?1?2乳腺癌:Li等[15]2002年發(fā)表了通過蛋白質(zhì)指紋圖譜技術(shù)發(fā)現(xiàn)三個(gè)腫瘤標(biāo)志BC1,BC2和BC3來聯(lián)合檢測乳腺癌。Mathelin等[16]通過實(shí)驗(yàn)的方法來驗(yàn)證這些腫瘤標(biāo)志的真實(shí)有效性,在49例乳腺癌,13例良性乳房疾病和27例健康婦女中進(jìn)行測試。BC2腫瘤標(biāo)志有效性未得到確定,但是發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)蛋白峰BC1a和BC1b能與Li的BC1相對(duì)應(yīng),在乳腺癌中表達(dá)下調(diào)。同樣BC3a和BC3b兩個(gè)蛋白峰能與Li的BC3相對(duì)應(yīng),在乳腺癌中表達(dá)上調(diào)。使用BC1a/BC1b/BC3a/BC3b的組合對(duì)乳腺癌的檢測準(zhǔn)確性達(dá)33%和45%,相同的樣品用CA153檢測準(zhǔn)確率僅為22%。結(jié)合BC1a/BC1b/BC3a/BC3b的組合和CA153增加了乳腺癌檢測的敏感性?？傮w來說,實(shí)驗(yàn)證明Li的研究結(jié)果BC1和BC3在對(duì)乳腺癌檢測中是具有幫助的。

2?1?3卵巢癌:CA125是一種廣泛用于卵巢癌檢測的較好的輔助診斷方法,但該抗原多在晚期病人中才能檢測出來,Ⅰ期病人僅50%~60%陽性。因此,病人經(jīng)臨床確診時(shí)多為晚期,五年存活率僅約35%。美國癌癥研究所等最早應(yīng)用SELDI-TOF-MS技術(shù)進(jìn)行卵巢癌檢測和研究,經(jīng)對(duì)50例卵巢癌病人,66例非惡性腫瘤病人及63名正常人進(jìn)行血清檢測,結(jié)果顯示,敏感性100%,特異性95%,陽性預(yù)測值94%[17]。提示采用蛋白質(zhì)指紋圖譜技術(shù)對(duì)卵巢癌病人進(jìn)行早期檢測,可大大提高她們的五年存活率[18]。

2?1?4前列腺癌:前列腺特異性抗原是目前檢測前列腺癌主要的敏感參考指標(biāo),雖然它的敏感性很高,不容易漏診,但特異性僅20%~40%,如在許多良性前列腺肥大病人中PSA亦增高。然而,應(yīng)用SELDI-TOF-MS技術(shù),通過檢測前列腺癌病人血清中9種特異蛋白質(zhì)生物標(biāo)志,可將正常人、前列腺癌和良性前列腺肥大病人清楚的區(qū)分開來,而其敏感性和特異性均在90%左右[19]。

2?1?5胃癌:Xu等[20]分析不同病理分期胃癌和健康人的血清蛋白質(zhì)指紋圖譜。進(jìn)一步鑒定一個(gè)1465u的蛋白質(zhì)指紋為端切纖維蛋白肽A。端切纖維蛋白肽A可作為最好的檢測早期胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的單個(gè)指標(biāo),雙盲驗(yàn)證在診斷胃癌的敏感性和特異性達(dá)到85?4%和100%。這些發(fā)現(xiàn)表明,凝血系統(tǒng)中纖維蛋白肽A減少或者纖維蛋白肽A的變異片段是胃癌生物學(xué)的早期事件。通過對(duì)胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者和胃癌無淋巴結(jié)侵犯者血清中的端切纖維蛋白肽A進(jìn)行分析,可用于臨床胃癌輔助診斷、手術(shù)療效、轉(zhuǎn)移與復(fù)發(fā)及分期的判斷。其他腫瘤診斷:我國已有38個(gè)單位應(yīng)用蛋白質(zhì)指紋圖譜技術(shù)進(jìn)行肺癌、肝癌、胃癌、腸癌、食管癌、卵巢癌、乳腺癌、胰腺癌、鼻咽癌、膀胱癌和神經(jīng)膠質(zhì)瘤等的臨床檢驗(yàn)和研究,均取得了與國際相似的結(jié)果[21~27]。美國NCI主席在2005年4月16日宣布美國將用蛋白質(zhì)指紋圖譜技術(shù)對(duì)腫瘤早期定性和PET-CT對(duì)腫瘤早期定位相結(jié)合等手段對(duì)腫瘤作出極早期診斷,使腫瘤在2015年成為非致死性疾病。

2?2其他疾病的檢測

蛋白質(zhì)指紋圖譜技術(shù)對(duì)其他疾病的檢測目前尚不普及,但一些研究報(bào)告的結(jié)果亦非常鼓舞人心。

2?2?1心血管疾病:蛋白質(zhì)指紋圖譜技術(shù)在心血管疾病診斷方面也取得重大突破。首先,用SELDI-TOF-MS鑒定血清載脂蛋白A-Ⅰ和載脂蛋白A-Ⅱ,解決了ELISA法的抗體交叉反應(yīng)問題,這對(duì)糖尿病及心血管病的并發(fā)癥的監(jiān)控有重大意義[28]。其次,用SELDI-TOF-MS鑒定補(bǔ)體C3-α鏈及纖維蛋白原的早期降解蛋白質(zhì)指紋,能更早地發(fā)現(xiàn)心肌梗死[29]。第三,用SELDI技術(shù)首次發(fā)現(xiàn)載脂蛋白C-Ⅰ和載脂蛋白C-Ⅲ可區(qū)別缺血性和出血性腦卒中[30]。

2?2?2感染性疾病:艾滋病是一種傳播越來越廣,嚴(yán)重危害人類健康和生命的一種嚴(yán)重免疫缺陷病。在艾滋病感染的人群中,有2%~3%的人并不發(fā)病。自1986年以來,經(jīng)過一系列的研究,認(rèn)為是被稱之為“CAF”的抑制因子抑制了HIV-1的復(fù)制。但對(duì)其確切機(jī)制并不十分清楚[31]。2002年美國著名艾滋病專家、雞尾酒療法創(chuàng)始者何大一教授借助蛋白質(zhì)指紋圖譜技術(shù),在短短三個(gè)月內(nèi)檢測發(fā)現(xiàn)在2%~3%艾滋病感染者而不發(fā)病的人群中,存在三個(gè)蛋白質(zhì)指紋,鑒定為α-defensin1、2和3抗艾滋病病毒的生物標(biāo)志[31]。這不僅極大推進(jìn)了艾滋病的發(fā)病機(jī)理及抗艾滋病機(jī)制的研究,也將推動(dòng)臨床艾滋病的防治進(jìn)展。對(duì)鼠疫和嚴(yán)重急性呼吸綜合征的病原學(xué)診斷,特別是發(fā)病早期的檢測有時(shí)比較困難,通常主要依靠臨床和流行病調(diào)查進(jìn)行診斷?，F(xiàn)在通過蛋白質(zhì)指紋圖譜技術(shù)在發(fā)病早期即可進(jìn)行病原學(xué)診斷,研究已發(fā)現(xiàn)有五種生物標(biāo)志與鼠疫桿菌發(fā)病有關(guān)[32]。中國學(xué)者對(duì)早期SARS病人血清進(jìn)行蛋白質(zhì)指紋圖譜技術(shù)檢測,發(fā)現(xiàn)病人在臨床發(fā)病早期,即可檢測出相關(guān)的特異蛋白,其敏感性為98?6%,特異性為94?6%[33]。

2?2?3老年性癡呆癥:老年性癡呆癥是危害老年人身心健康的常見病,過去由于缺乏可靠的檢查方法及客觀診斷標(biāo)準(zhǔn),所以主要依靠病人的臨床表現(xiàn)加以診斷,而且一經(jīng)確診病人病情則已比較嚴(yán)重。一些研究曾發(fā)現(xiàn),一種β型淀粉樣多肽增高與該病發(fā)病有關(guān),但由于缺乏精細(xì)的檢測方法,對(duì)引發(fā)該病的多肽確切片段和分子質(zhì)量不甚清楚。因此,不能將其作為確診的標(biāo)準(zhǔn)?，F(xiàn)用蛋白質(zhì)指紋圖譜技術(shù)則能確定抗原變異片段,發(fā)現(xiàn)β型多肽中的片段1~42,分子質(zhì)量4514u是引發(fā)疾病的關(guān)鍵生物標(biāo)志。該生物標(biāo)志不僅可作為診斷的主要參考指標(biāo),還可為病人進(jìn)行早期診斷和早期治療提供依據(jù)[34]。

2?2?4慢性腎病:慢性腎病是臨床常見病,既往臨床上主要依靠腎小球?yàn)V過率及血清肌酐水平檢測進(jìn)行診斷及評(píng)價(jià)腎功能的受損程度。但這些檢測結(jié)果受許多因素的影響,如血液的稀釋度及其他非腎臟疾病的影響,均可能引起腎小球?yàn)V過率及肌酐水平的改變,因而并非慢性腎病所特異。然而,用蛋白質(zhì)指紋圖譜技術(shù)已從慢性腎病病人中檢測到有一種分子質(zhì)量為26000u,鑒定為Lipocalin型前列腺素D合成酶的糖蛋白,在慢性腎病時(shí)增高,對(duì)診斷有特殊意義[35]。

2?2?5移植檢測:腎移植排斥反應(yīng)目前主要依靠腎活檢。但這種創(chuàng)傷性檢查有一定的危險(xiǎn)性和應(yīng)用的局限性?，F(xiàn)在,美國和加拿大科學(xué)家用蛋白質(zhì)指紋圖譜技術(shù)進(jìn)行尿液檢測,可無創(chuàng)性、24h不間斷地監(jiān)測病情變化,鑒定急性腎移植排斥反應(yīng),其準(zhǔn)確率高達(dá)91%~94%。這對(duì)腎移植后免疫抑制劑用量的調(diào)整、并發(fā)癥與療效判斷有重大意義[36~37],也將對(duì)其他移植技術(shù)的精密組織配型、療效判斷、并發(fā)癥的研究提供重大參考價(jià)值。

3免疫組質(zhì)譜檢測

質(zhì)譜與抗體分離技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用即為免疫組質(zhì)譜。免疫組質(zhì)譜檢測為一組多種抗體與質(zhì)譜聯(lián)合來精確地鑒別變異或修飾生物標(biāo)志群的方法。在一個(gè)抗體組基質(zhì)上同時(shí)捕獲多個(gè)生物標(biāo)志,并對(duì)捕獲的變異或修飾的生物標(biāo)志進(jìn)行質(zhì)譜精確分析?？梢酝瑫r(shí)檢測多個(gè)生物標(biāo)志群。目前ELISA等技術(shù)主要依靠間接的化學(xué)或放射測定法,因而無法直接鑒定抗原的變異,而用免疫組質(zhì)譜技術(shù)能測定抗原變異片段的分子質(zhì)量。另外,還可以將多種疾病的特異性抗原的抗體同時(shí)標(biāo)在一個(gè)基質(zhì)點(diǎn)上。即用質(zhì)譜同時(shí)可檢測多種疾病特異性抗原的分子質(zhì)量,及進(jìn)行窗口期檢查,而ELISA技術(shù)及免疫熒光技術(shù)無法做到[34,38]。我國Xu等[39]首創(chuàng)用抗FPA、抗C3a、抗ApoA-I、抗ApoA-II抗體組聯(lián)合標(biāo)記至磁珠上,通過分析正常人及消化系統(tǒng)腫瘤病人的血清蛋白質(zhì)指紋峰,發(fā)現(xiàn)1465u、8938u、28078u、8707u生物標(biāo)志可以用于區(qū)分正常人、消化系統(tǒng)腫瘤生物標(biāo)志群變異表達(dá)。該檢測方法的靈敏度為:胃癌95%、肝癌81%、結(jié)直腸癌病人87%。而消化系統(tǒng)腫瘤中胃癌、肝癌、結(jié)直腸癌的AFP和CEA檢測靈敏度為:46%~60%。免疫組質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)對(duì)AFP和CEA表達(dá)陰性的胃癌、肝癌、結(jié)直腸癌檢測陽性,故免疫組質(zhì)譜技術(shù)特別對(duì)評(píng)估傳統(tǒng)腫瘤標(biāo)記物陰性的惡性腫瘤有更大的意義。

由于每種特異性抗體所捕獲生物抗原的分子質(zhì)量是不同的,故免疫組與質(zhì)譜聯(lián)合應(yīng)用時(shí),質(zhì)譜儀就非常容易地將這四種抗原同時(shí)分開了。用三種以上抗體組標(biāo)在磁珠上與質(zhì)譜聯(lián)合,可同時(shí)檢測出多種的生物標(biāo)志及一種或一種以上變異或修飾的生物標(biāo)志。這樣產(chǎn)生了一種新型可用質(zhì)譜儀直接進(jìn)行分析多種生物標(biāo)志及一種或一種以上變異或修飾生物標(biāo)志的方法。三色免疫熒光法可以同時(shí)分析三種生物標(biāo)志,但無法達(dá)到三種以上的生物標(biāo)志的分析或像免疫組質(zhì)譜檢測來精確地、高效地確定一種變異或修飾的被分析物。這些生物標(biāo)志組合可以用于同時(shí)鑒別正常人及不同種類疾病的檢測方法。目前用于臨床疾病治療療效監(jiān)測的方法和評(píng)估預(yù)后的指標(biāo)多為宏觀和粗略的。如根據(jù)腫瘤包塊大小變化,陰影消失與否;血象和生化指標(biāo)的改變;根據(jù)骨髓中原始幼稚細(xì)胞的百分比作為判斷白血病緩解與否的指標(biāo);有時(shí)還采用的是回顧性分析指標(biāo)。因此,難以反映疾病本身本質(zhì)變化規(guī)律,在一定程度上缺乏客觀性。如果根據(jù)疾病生物標(biāo)志類型和含量的改變,可能更符合客觀實(shí)際,更有助于臨床治療。

4蛋白質(zhì)指紋圖譜庫建立及標(biāo)準(zhǔn)化

目前,由于全世界實(shí)驗(yàn)室在質(zhì)控血清建立及儀器標(biāo)準(zhǔn)化狀態(tài)、儀器自動(dòng)化應(yīng)用方面存在不統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn),故用蛋白質(zhì)指紋圖譜技術(shù)發(fā)現(xiàn)疾病標(biāo)志進(jìn)行臨床診斷和治療干預(yù)之前,必須經(jīng)過嚴(yán)格的多中心和三期臨床質(zhì)控驗(yàn)證。只有經(jīng)過如上所述的嚴(yán)格驗(yàn)證,才能將此技術(shù)用于疾病生物標(biāo)志的檢測與臨床診斷[10,40]。2004年,美國國立腫瘤研究所組織的早期疾病探測研究機(jī)構(gòu)多中心統(tǒng)一了血清及儀器標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控[10]。蛋白質(zhì)指紋圖譜儀也經(jīng)國家食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)進(jìn)入中國市場[41]。中國的質(zhì)譜標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控血清制備定義符合如下標(biāo)準(zhǔn):供血者男女各半,血型為O型;年齡為18~30歲;民族,漢。生化指標(biāo)正常,包括:總膽固醇、甘油三酯、空腹血糖、乙肝表面抗原、肝功能檢查、腎功能檢查;無遺傳病家族史;無重大傳染病史。女性無懷孕,男性無吸煙史者。使用蛋白質(zhì)指紋圖譜技術(shù)已經(jīng)成為研究比較蛋白質(zhì)組學(xué)和發(fā)現(xiàn)生物標(biāo)記可選用的方法,尤其在多肽及低分子質(zhì)量蛋白質(zhì)指紋圖譜分析的研究中非常有用[13,20~27]。但是,我們在進(jìn)行蛋白質(zhì)指紋圖譜分析時(shí)發(fā)現(xiàn)血液樣本離體后如不及時(shí)分離血清,對(duì)結(jié)果影響很大,因而及時(shí)分離血清成為實(shí)驗(yàn)的首要保障。分離血清的操作也比較簡便可行。

接下來便是血清樣本的質(zhì)量和保存的穩(wěn)定性問題了,這對(duì)一些需外送檢測的樣本顯得尤其重要。用WCX陰離子磁珠與質(zhì)譜的實(shí)驗(yàn)結(jié)果建議血液標(biāo)本的處理、運(yùn)送、操作及儲(chǔ)存的蛋白質(zhì)指紋圖譜分析的標(biāo)準(zhǔn)條件是:4℃下處理血液標(biāo)本,2h內(nèi)盡快分離血清及細(xì)胞。用9