第六章基因操作中大分子的分離和分析詳解演示文稿

第六章基因操作中大分子的分離和分析詳解演示文稿當(dāng)前第1頁\共有150頁\編于星期三\10點(diǎn)優(yōu)選第六章基因操作中大分子的分離和分析當(dāng)前第2頁\共有150頁\編于星期三\10點(diǎn)分離核酸應(yīng)注意以下幾點(diǎn)：①減少化學(xué)因素對核酸的降解：酸、堿②減少物理因素對核酸的降解：機(jī)械力③防止核酸的生物降解：進(jìn)行核酸分離時最好新鮮生物組織或細(xì)胞樣品，若不能馬上進(jìn)行提取，應(yīng)將材料貯存于液氮中或-70℃冰箱中。當(dāng)前第3頁\共有150頁\編于星期三\10點(diǎn)1.1DNA提取的步驟一、細(xì)胞破碎二、除去與核酸結(jié)合的蛋白質(zhì)等雜質(zhì)三、除去其他雜質(zhì)核酸四、獲得DNA樣品當(dāng)前第4頁\共有150頁\編于星期三\10點(diǎn)一、細(xì)胞破碎目前細(xì)胞破碎主要有物理破碎（主要是機(jī)械破碎）和非物理破碎（主要化學(xué)破碎和生物酶解）

當(dāng)前第5頁\共有150頁\編于星期三\10點(diǎn)（一）、物理破碎

目前常用物理破碎的方法主要有：均質(zhì)珠子研磨振蕩、液氮研磨、乳缽研磨、凍融、煮沸、超聲波(ultrasonication)和微波加熱(microwaveheating)等。1、微波加熱對于革蘭氏陽性細(xì)菌非常有效，但是加熱必須適中，否則DNA可能被破壞。

當(dāng)前第6頁\共有150頁\編于星期三\10點(diǎn)2、熱激處理包含冷凍和融解兩步，冷凍主要是用液氮、冰箱(?70℃、－20℃)或冰，而融解主要是37℃、50℃、65℃或100℃水浴，其中凍融循環(huán)次數(shù)和孵育時間可以根據(jù)不同要求變化。如，Lee(1996)等通過用吖啶橙染色直接統(tǒng)計經(jīng)三次熱激(?70℃/65℃)聯(lián)合溶菌酶和SDS處理后的細(xì)胞裂解率為90%。

熱激處理比其他物理處理的剪切力要小很多，而且提取效率、得到片段完整性較好。當(dāng)前第7頁\共有150頁\編于星期三\10點(diǎn)3、珠子打擊法(beadbeating)加入不同直徑的玻璃珠，有利于不同細(xì)胞DNA的提?。孩僦睆綖?10～1180μm玻璃珠可打碎土壤塊和植物細(xì)胞；②425～600μm玻璃珠可打碎真菌、植物和其他真核細(xì)胞；③106μm玻璃珠可打碎細(xì)菌細(xì)胞。在使用玻璃珠研磨法時，應(yīng)在珠子大小和數(shù)量上具有合適的配比，這樣才能有效地破碎和抽提微生物的營養(yǎng)細(xì)胞、內(nèi)生孢子或分生孢子的DNA。當(dāng)前第8頁\共有150頁\編于星期三\10點(diǎn)珠子打擊法優(yōu)點(diǎn)：有更好的裂解效率和產(chǎn)量，而且其DNA產(chǎn)量隨著打擊時間和打擊速度的增加而增加，因此，可以用較小的抽提緩沖液體積處理較小的樣品得到滿意的獲得率。珠子打擊法缺點(diǎn)：隨著打擊處理而增加產(chǎn)量的同時，剪切力增大并導(dǎo)致小片段增加，從而影響PCR的敏感性，甚至可能增加嵌合體形成率而影響隨后的分子生物學(xué)處理及結(jié)果，特別是引起多樣性分析的偏差。當(dāng)前第9頁\共有150頁\編于星期三\10點(diǎn)（二）非物理破碎法非物理破碎法相對比較溫和，利于保持DNA的完整性。其主要是包括化學(xué)破碎和生物酶解。當(dāng)前第10頁\共有150頁\編于星期三\10點(diǎn)1、化學(xué)破碎目前化學(xué)破碎法常用的化學(xué)試劑主要是陰離子型去污劑SDS（十二烷基硫酸鈉）、Sarkosyl（N-十二烷基肌氨酸鈉）和陽離子型去污劑CTAB（十六烷基三乙基溴化銨）等。

當(dāng)前第11頁\共有150頁\編于星期三\10點(diǎn)2、生物酶解在生物酶解中最普遍使用的是溶菌酶，其主要是通過水解細(xì)胞壁而達(dá)到裂解細(xì)胞的目的，特別是對革蘭氏陽性菌的破碎，同時溶菌酶還可以水解糖苷鍵和腐殖酸的化合鍵從而改善DNA純度。由于生物酶解比較溫和，故其常常還需要跟化學(xué)、物理等裂解方法聯(lián)合使用。目前除了使用溶菌酶外，也有添加旨在提高革蘭氏陽性菌裂解的消色肽酶(achromopeptidase)、消化蛋白的蛋白酶K(proteinaseK)(主要通過酶解膜蛋白來提高裂解細(xì)胞以及消化蛋白而有利于隨后的核酸分離純化)以及在富含有機(jī)酸的樣品中有利于核酸釋放的鏈霉蛋白酶(pronase)等。當(dāng)前第12頁\共有150頁\編于星期三\10點(diǎn)一般來說，單獨(dú)使用一種處理方法效果都不會很好，而適當(dāng)?shù)慕M合可產(chǎn)生很好的效果。當(dāng)前第13頁\共有150頁\編于星期三\10點(diǎn)二、除去與核酸結(jié)合的蛋白質(zhì)等雜質(zhì)苯酚對蛋白質(zhì)有極強(qiáng)的變性作用，而對DNA無影響；氯仿也可使蛋白質(zhì)變性，對DNA無影響；蛋白酶可降解蛋白質(zhì)，故在實(shí)驗中也常使用。注：苯酚的殘留會嚴(yán)重干擾后續(xù)的分子操作，故用苯酚去除蛋白質(zhì)后還需用氯仿/異戊醇（24:1）抽提兩次，以去除殘留的蛋白質(zhì)和苯酚。當(dāng)前第14頁\共有150頁\編于星期三\10點(diǎn)三、除去其他雜質(zhì)核酸在DNA提取中會有少量的RNA雜質(zhì)殘留，但RNA極易降解，一般情況下對后續(xù)的DNA操作無大影響。如要求DNA純度較高時可加入RNA酶（RNase）以降解RNA。當(dāng)前第15頁\共有150頁\編于星期三\10點(diǎn)四、獲得DNA樣品含DNA的水相可用以下幾種沉淀劑沉淀：a.無水乙醇（最常用）：易于從DNA沉淀中除去。但所需的體積大（2倍），由于使用的管多為一次性，比較浪費(fèi)。b.異丙醇：能與自由水緊密結(jié)合。結(jié)合了溶解DNA的水分子，使DNA沉淀?？沙爻恋恚x心，加入體積為0.6—1倍體積，但不易除去，需用70%酒精洗滌幾次，否則對后續(xù)分子操作有影響。異戊醇：幾乎不能與自由水結(jié)合，但可分離有機(jī)醇與溶液層，還可去氣泡，也可做去蛋白的輔助劑。c.PEG（聚乙二醇，分子量6000—8000）選擇性沉淀：低濃度PEG（如1%）選擇沉淀大分子DNA，在構(gòu)建基因組文庫則用低濃度PEG沉淀幾十kb；高濃度PEG（20%），選擇沉淀小分子，幾百bp。如：PBR3224.3kb用PEG12%沉淀。PEG選擇沉淀的分辨率達(dá)100bp。當(dāng)前第16頁\共有150頁\編于星期三\10點(diǎn)沉淀時的注意事項：（1）當(dāng)DNA分子量<1kb或濃度較低,<1μg/ml，加入沉淀劑后應(yīng)在-70℃下幾小時或過夜，否則回收不徹底。此外，應(yīng)16000rpm離心；（2）DNA>1kb，加入沉淀劑后再加入糖原，幾分鐘可↓完全；（3）DNA<200bp，回收時，先加MgCl2至終濃度達(dá)10mmol/L，再用乙醇沉淀；（4）溶液中磷酸鹽>1mmol/LorEDTA>10mmol/L，則用乙醇沉淀得不到DNA，應(yīng)選其它方法沉淀DNA。當(dāng)前第17頁\共有150頁\編于星期三\10點(diǎn)DNA樣品的貯存：4℃短期貯存;-20℃長期貯存，冰上緩解凍（取時）；也可將DNA樣品以乙醇沉淀的形式保存在-20℃。當(dāng)前第18頁\共有150頁\編于星期三\10點(diǎn)Figure3.4

Preparationofacellextract.Preparationofacellextract當(dāng)前第19頁\共有150頁\編于星期三\10點(diǎn)Figure3.5

Removalofproteincontaminantsbyphenolextraction.◆

PurificationofDNAfromacellextract當(dāng)前第20頁\共有150頁\編于星期三\10點(diǎn)Figure3.6CollectingDNAbyethanolprecipitation.◆ConcentrationofDNAsamples當(dāng)前第21頁\共有150頁\編于星期三\10點(diǎn)兩種經(jīng)典的化學(xué)試劑提取法：

1、CTAB法

2、SDS法當(dāng)前第22頁\共有150頁\編于星期三\10點(diǎn)?CTAB法（1）原理：CTAB,十六烷基三甲基溴化銨是一種去污劑，可溶解細(xì)胞膜，它能與核酸形成復(fù)合物，在高鹽溶液中（0.7mol/LNaCl）是可溶的，當(dāng)降低溶液鹽濃度到一定程度（0.3mol/LNaCl）時，從溶液中沉淀，通過離心就可將CTAB與核酸的復(fù)合物同蛋白質(zhì)、多糖類物質(zhì)分開，然后將CTAB與核酸的復(fù)合物沉淀溶解于高鹽溶液，再加入乙醇使核酸沉淀，CTAB能溶解于乙醇。當(dāng)前第23頁\共有150頁\編于星期三\10點(diǎn)（2）具體操作：在所需量的CTAB抽提液中加入β－巰基乙醇，使終濃度達(dá)2％（v/v）。將此溶液預(yù)熱至65℃。對于每克新鮮的葉組織大約需要4ml的β－ME/CTAB抽提液。用液氮（－196℃）或干冰（－78℃）冷卻粉碎器/勻漿器，將0.5g植物組織粉碎成細(xì)粉，然后將組織轉(zhuǎn)移到2.0ml離心管。加入800μl預(yù)熱的β－Me/CTAB，混合使之充分濕潤，于65℃溫育20min，不時顛倒混勻。待冷至室溫后，加入800μl氯仿/異戊醇（24：1），顛倒混勻至溶液呈乳濁狀（但不要振蕩）。25℃，10000rpm離心10min。當(dāng)前第24頁\共有150頁\編于星期三\10點(diǎn)⑤上清（約700μl）轉(zhuǎn)移至另一干凈的離心管中，加入5μlRNaseA貯液，37℃溫育30min。⑥加入700μl氯仿/異戊醇，顛倒混勻，25℃，10000rpm離心10min。⑦上清（約600μl）轉(zhuǎn)移至另一干凈的1.5ml離心管中，加入600μl異丙醇，顛倒混勻，室溫或-20℃放置20min。⑧25℃，12000rpm，離心10min，收集沉淀。⑨去上清，加1ml70%乙醇洗滌沉淀兩次（25℃，12000rpm，離心10min）⑩晾干DNA，溶于50μlddH2O，4℃保存?zhèn)溆?。?dāng)前第25頁\共有150頁\編于星期三\10點(diǎn)（3）優(yōu)缺點(diǎn)：①能很好地去除糖類物質(zhì)；②在提取的前期能同時得到高含量的DNA及RNA；③步驟多，復(fù)雜，提取的DNA分子量比SDS法小。當(dāng)前第26頁\共有150頁\編于星期三\10點(diǎn)（4）說明：β—巰基乙醇的作用：a.是一種蛋白質(zhì)的輔助變性劑；b.主要作還原劑，加入溶液中可防止整個溶液的氧化，大大提高DNA得率。由于氣體（多酚類物質(zhì)）刺鼻，通風(fēng)柜操作。當(dāng)前第27頁\共有150頁\編于星期三\10點(diǎn)?SDS法（1）原理:利用高濃度的SDS，在較高溫度（55—65℃）條件下裂解細(xì)胞，蛋白質(zhì)變性，釋放出核酸，然后采用提高鹽濃度及降低溫度的做法使蛋白質(zhì)及多糖雜質(zhì)沉淀（最常用的是加入5M的KAc于冰上保溫，在低溫條件下KAc與蛋白質(zhì)及多糖結(jié)合成不溶物），離心除去沉淀后，上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，反復(fù)抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。

當(dāng)前第28頁\共有150頁\編于星期三\10點(diǎn)（2）過程：將0.3g植物材料于液氮速凍，然后在研缽中將其磨碎，將粉末轉(zhuǎn)至2ml離心管中。加入1.2ml預(yù)熱至65℃的提取緩沖液（其中加入3μlβ—巰基乙醇，增加DNA的穩(wěn)定性），置65℃水浴中放置30分鐘，不時顛倒混勻。加入0.45ml5M的醋酸鉀，混勻，冰浴20分鐘，在10000rpm離心20min。需要的話，用紗布過濾除去沉淀，上清液轉(zhuǎn)入另一離心管中。加入等體積氯仿：異戊醇（24：1），輕輕顛倒混勻，12000rpm離心15min。當(dāng)前第29頁\共有150頁\編于星期三\10點(diǎn)⑥轉(zhuǎn)移上清液到另一新離心管中，加5μlRNaseA貯液，37℃溫育30min。⑦加入等體積氯仿：異戊醇（24：1），輕輕顛倒混勻，12000rpm離心15min。⑧轉(zhuǎn)移上清液到另一新離心管中，加入0.7V異丙醇，輕輕顛倒混勻，-20℃放置30分鐘沉淀核酸。⑨25℃，12000rpm，離心10min，收集沉淀。⑩棄上清，70％乙醇洗兩次。涼干DNA，溶于50μlddH2O，4℃保存?zhèn)溆?。?dāng)前第30頁\共有150頁\編于星期三\10點(diǎn)（3）與CTAB法比較：SDS法較溫和，對DNA的切割不大，可獲得大分子量的DNA。故該法可建立基因組文庫，多酚類物質(zhì)的材料適用。該法極易造成SDS-DNA共沉淀。對SDS質(zhì)量要求較高。稱取SDS時，動作要緩慢，因SDS易于形成微顆粒。溶解時，水應(yīng)沿壁使水輕緩流下，56℃助溶。

當(dāng)前第31頁\共有150頁\編于星期三\10點(diǎn)例1：水稻基因組DNA提取取3-5g新鮮水稻葉片，用液氮速凍，在研缽中快速研成粉末狀，轉(zhuǎn)入50ml離心管中；立即加入20ml預(yù)熱至65℃的提取緩沖液，65℃水浴30min；加入7.5ml5M醋酸鉀，輕輕混勻，冰上放置20min，4000rpm離心20min。將上清轉(zhuǎn)入另一干凈的50ml離心管中；加入15ml氯仿：異戊醇（24：1），輕輕顛倒混勻，4000rpm離心20min。將上清轉(zhuǎn)入另一個干凈的50ml離心管中；加入15ml冰預(yù)冷的異丙醇，輕輕顛倒混勻，-20℃放置30min；4000rpm離心20min，棄上清，用20ml70%的乙醇洗一遍，倒置離心管于干凈的濾紙，室溫晾干沉淀；將沉淀重懸于0.6mlTE緩沖液，加10μl10mg/mlRNA酶，37℃保溫10min；轉(zhuǎn)入干凈的2ml離心管中，加入等體積的酚：氯仿：異戊醇（25：24：1），12000rpm離心10min；將上清轉(zhuǎn)入一干凈的2ml離心管中，加入1/10體積冰預(yù)冷的3M醋酸鈉（pH5.2），2倍體積冰預(yù)冷的無水乙醇，12000rpm離心30min。棄上清，用70%的乙醇洗一遍，晾干后，容于500μlTE，保存于-20℃?zhèn)溆谩．?dāng)前第32頁\共有150頁\編于星期三\10點(diǎn)例2：細(xì)菌DNA大量提取吸取1ml過夜培養(yǎng)的細(xì)菌于50ml不加抗生素的PSA中，28℃，200rpm過夜培養(yǎng)；6000rpm離心5分鐘，收集菌體；用50ml冰冷的1×TE沖洗菌體兩次；將菌體重新打散，懸于20ml1×TE中；加入（37℃預(yù)消化1小時）的蛋白酶、SDS使其終濃度分別為625g/ml(w/v)及1.25％（w/v）,冰浴45分鐘至有白色SDS析出；室溫放置30分鐘，不時輕輕搖動；3%NaCl飽和的苯酚、苯酚/氯仿（1:1,v/v）及氯仿各抽提一次，收集上清于新的離心管；加入1/10體積的3MNaAc(pH4.8),再加等體積冰冷的異丙醇，混勻后置室溫30min，待出現(xiàn)無色透明的白色絮狀DNA，用Tip頭吸出，室溫干燥后溶于1xTE中；DNA保存于-20oC，可長期保存。

當(dāng)前第33頁\共有150頁\編于星期三\10點(diǎn)例4：人類DNA提取親手提取自己的DNA

作為“紀(jì)念DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)五十周年系列展覽”的一部分，現(xiàn)場萃取DNA制成掛件模型實(shí)驗，昨天在北京王府井新東安廣場舉行。十幾名學(xué)生在英國老師斯蒂娜的指導(dǎo)下親手萃取了自己的絮狀DNA，並制作成可愛的掛件，掛在脖子上。據(jù)悉，這次開放式實(shí)驗活動將持續(xù)到3日。

圖為北京外國語大學(xué)學(xué)生小周看見自己的DNA奇跡般地出現(xiàn)在試液中，驚奇不已。

本報記者吳平

張紅晉攝影報道

《京華時報》(2003年10月2日第2版)

當(dāng)前第34頁\共有150頁\編于星期三\10點(diǎn)1.2質(zhì)粒DNA的提取1、堿裂解法◆堿裂解法由Birnboim和Doly設(shè)計并于1979年發(fā)表，基于染色體DNA與質(zhì)粒DNA變性與復(fù)性的差異而達(dá)到分離目的?！粼趐H高達(dá)12.5的堿性條件下，染色體DNA的氫鍵斷裂，雙螺旋結(jié)構(gòu)解開而變性，質(zhì)粒DNA的大部分氫鍵也斷裂，但超螺旋共價閉合環(huán)狀的兩條互補(bǔ)鏈不會完全分離?！舢?dāng)以pH4.6的KAc高鹽緩沖液調(diào)節(jié)其pH至中性時，變性的質(zhì)粒DNA又恢復(fù)原來的構(gòu)型，保存在溶液中，而染色體DNA不能復(fù)性而形成纏連的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)?！敉ㄟ^離心，染色體DNA與不穩(wěn)定的大分子RNA、蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物等一起沉淀下來而被除去?；驹恚寒?dāng)前第35頁\共有150頁\編于星期三\10點(diǎn)Figure3.11

Plasmidpurificationbythealkalinedenaturationmethod.當(dāng)前第36頁\共有150頁\編于星期三\10點(diǎn)三種溶液：溶液I：50mM葡萄糖/25mMTris-Cl/10mMEDTA：pH8.0；

溶液II，0.2NNaOH/1%SDS；

溶液III：3M醋酸鉀/2M醋酸

提取步驟：當(dāng)前第37頁\共有150頁\編于星期三\10點(diǎn)pET28c(+)電泳結(jié)果

當(dāng)前第38頁\共有150頁\編于星期三\10點(diǎn)堿抽提法所用試劑的生化作用

提取過程中所用的材料有：LB培養(yǎng)基、葡萄糖/Tris/EDTA溶液(5Ommol/L葡萄糖；25mmol/LTris?HCl；pH8.0，lOmmol/LEDTA)、TE緩沖液、3mol/L乙酸鉀溶液、NaOH-SDS溶液、溶菌酶液、異丙醇、100%乙醇和70%乙醇等。

當(dāng)前第39頁\共有150頁\編于星期三\10點(diǎn)①溶菌酶:溶菌酶是糖苷水解酶，水解菌體細(xì)胞壁的主要化學(xué)成分肽聚糖中的β-1，4糖苷鍵，因而具有溶菌作用。

葡萄糖:葡萄糖增加溶液粘度，維持滲透壓，防止DNA受機(jī)械剪切力作用而降解。

EDTA:EDTA螯合Mg2+和Ca2+等金屬離子，抑制脫氧核糖核酸酶對DNA的降解作用,同時有利于溶菌酶的作用。

當(dāng)前第40頁\共有150頁\編于星期三\10點(diǎn)②NaOH-SDS液:NaOH濃度為0.2mol/L，加抽提液時，該系統(tǒng)的pH就高達(dá)12.6，因而促使染色體DNA與質(zhì)粒DNA的變性。SDS是離子型表面活性劑，它可以溶解細(xì)胞膜上的脂質(zhì)與蛋白，因溶解膜蛋白而破壞細(xì)胞膜、解聚細(xì)胞中的核蛋白，還能與蛋白質(zhì)結(jié)合成為R-O-S03-…R+一蛋白質(zhì)的復(fù)合物,使蛋白質(zhì)變性沉淀下來。當(dāng)前第41頁\共有150頁\編于星期三\10點(diǎn)③KAc:

pH4.8的KAc溶液是為了把pHl2.6的抽提液調(diào)節(jié)至中性，使變性的質(zhì)粒DNA能夠復(fù)性，并能穩(wěn)定存在。高鹽：3mol/LKAc有利于變性的大分子染色體DNA、RNA以及SDS-蛋白復(fù)合物的凝聚而沉淀。染色體DNA因為中和了核酸上的電荷，減少相斥力而互相聚合，鉀鹽與RNA、SDS-蛋白復(fù)合物作用后，形成鉀鹽形式復(fù)合物，使沉淀更完全。

當(dāng)前第42頁\共有150頁\編于星期三\10點(diǎn)④無水乙醇:沉淀DNA，它的優(yōu)點(diǎn)是可以任意比例和水相混溶，且乙醇與核酸不會起任何化學(xué)反應(yīng)，對DNA很安全。DNA溶液是DNA以水合狀態(tài)穩(wěn)定存在，當(dāng)加入乙醇時，乙醇會奪去DNA周圍的水分子，使DNA失水而易于聚合。

⑤酚-氯仿:酚與氯仿是非極性分子，水是極性分子，當(dāng)?shù)鞍姿芤号c酚或氯仿混合時，蛋白質(zhì)分子之間的水分子就被酚或氯仿擠去，使蛋白質(zhì)失去水合狀態(tài)而變性。經(jīng)過離心，變性蛋白質(zhì)的密度比水的密度大，因而與水相分離，沉淀在水相下面，從而與溶解在水相中的DNA分開。而酚與氯仿有機(jī)溶劑比重更大，保留在最下層。⑥異戊醇:異戊醇能降低分子表面張力，能減少抽提過程中泡沫的產(chǎn)生。同時異戊醇有助于分相，使離心后的上層水相、中層變性蛋白相以及下層有機(jī)溶劑相維持穩(wěn)定。當(dāng)前第43頁\共有150頁\編于星期三\10點(diǎn)2、通過試劑盒分離純化質(zhì)粒DNA

分離純化過程是通過一個簡單的結(jié)合—洗滌—洗脫程序來完成的。

優(yōu)點(diǎn)：該方法操作簡單，回收效率高，洗脫出來后的DNA可立即使用，無需濃縮、沉淀或脫鹽。

當(dāng)前第44頁\共有150頁\編于星期三\10點(diǎn)當(dāng)前第45頁\共有150頁\編于星期三\10點(diǎn)1.3瓊脂糖凝膠電泳分離純化的DNA是否真的存在、是否有降解現(xiàn)象，以及DNA經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切后其產(chǎn)物的大小如何等都是在基因操作中時刻面對的問題。目前最成熟的檢測DNA的技術(shù)就是瓊脂糖凝膠電泳。當(dāng)前第46頁\共有150頁\編于星期三\10點(diǎn)一、瓊脂糖的特點(diǎn)及凝膠電泳的原理

瓊脂糖是從海藻中提取出的一種線性多糖聚合物。在高溫水溶液中會溶解，在常溫下凝固并形成一定大小孔徑的惰性介質(zhì)。在電場的作用下，DNA可在孔洞中遷移。當(dāng)前第47頁\共有150頁\編于星期三\10點(diǎn)瓊脂糖凝膠電泳是以瓊脂糖為支持物，在適當(dāng)條件下對帶電生物大分子進(jìn)行電泳的技術(shù)。主要用于DNA分子的分離、純化和鑒定。瓊脂糖凝膠電泳的原理：DNA分子在溶液中帶負(fù)電荷，在電場中向正極移動，由于DNA分子的分子質(zhì)量差別，電泳后不同大小的DNA分子呈現(xiàn)遷移位置的差異，把已知分子質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)DNA與待測DNA同時電泳，比較兩者在凝膠板上所呈現(xiàn)的區(qū)帶，就可以鑒定出待測DNA的大小。當(dāng)前第48頁\共有150頁\編于星期三\10點(diǎn)當(dāng)前第49頁\共有150頁\編于星期三\10點(diǎn)二、瓊脂糖凝膠電泳基本操作步驟

在瓊脂糖中加入電泳緩沖液→微波加熱溶解→溫度降至60℃左右時，加入電泳染料→混勻后倒入凝膠槽→待凝膠完全凝結(jié)后，小心拔去梳子→放入電泳槽中，倒入電泳緩沖液，緩沖液高過凝膠面0.5cm→點(diǎn)樣→根據(jù)需要設(shè)置電泳電壓和時間，開始電泳→電泳結(jié)束后在凝膠成像儀上觀察、照相→進(jìn)一步分析。當(dāng)前第50頁\共有150頁\編于星期三\10點(diǎn)瓊脂糖凝膠電泳的操作過程當(dāng)前第51頁\共有150頁\編于星期三\10點(diǎn)當(dāng)前第52頁\共有150頁\編于星期三\10點(diǎn)染色體DNA瓊脂糖電泳圖譜紫外線光源靈敏度:302nm>254nm>366nm當(dāng)前第53頁\共有150頁\編于星期三\10點(diǎn)當(dāng)前第54頁\共有150頁\編于星期三\10點(diǎn)電泳結(jié)果分析：0.8%的瓊脂糖凝膠，應(yīng)呈現(xiàn)一條清晰帶。若呈長帶狀彌散熒光則表明DNA降解,原因可能有：①是否滅菌器皿及試劑；②材料收集是否立即冷凍，研磨（后）提取是否融化；③是否劇烈振動，吸管口過窄，產(chǎn)生氣泡。反復(fù)吸打及凍融等問題。若在溴酚藍(lán)處出現(xiàn)明亮的熒光，則有RNA，可用RNase消化。消化后用氯仿抽提，乙醇沉淀方法純化。若在樣品槽內(nèi)有熒光出現(xiàn)，可能樣品中DNA未完全溶解或濃度過高，或樣品不純，可能是大量帶正電荷的雜質(zhì)與DNA樣品結(jié)合。當(dāng)前第55頁\共有150頁\編于星期三\10點(diǎn)

凝膠類型及濃度

分離DNA片段的大小范圍（bp）

0.3%瓊脂糖50000~10000.7%瓊脂糖20000~10001.4%瓊脂糖6000~3004.0%聚丙烯酰胺1000~10010.0%聚丙烯酰胺500~2520.0%聚丙烯酰胺50~1三、瓊脂糖凝膠電泳的影響因素1、凝膠濃度凝膠濃度的選擇取決于DNA分子的大小。具體的濃度及分離DNA片段的大小范圍如下表。

當(dāng)前第56頁\共有150頁\編于星期三\10點(diǎn)2、DNA分子的大小和構(gòu)象線狀雙鏈DNA分子在一定濃度瓊脂糖凝膠上電泳距離與DNA的分子質(zhì)量對數(shù)成反比。但當(dāng)DNA分子處于不同構(gòu)象時，它在電場中移動距離不僅和分子質(zhì)量有關(guān)，還和它本身構(gòu)象有關(guān)。有相同分子質(zhì)量的線狀DNA<開環(huán)狀DNA<超螺旋DNA。當(dāng)前第57頁\共有150頁\編于星期三\10點(diǎn)3、電泳緩沖液目前常用的緩沖液有TAE（40mol/LTris-乙酸、1mmol/LEDTA）和TBE（90mmol/L硼酸、1mmol/LEDTA）。TAE緩沖液的緩沖能力較低，適用于低電壓長時間電泳；TBE有較強(qiáng)的緩沖能力，是比較通用的緩沖液。當(dāng)前第58頁\共有150頁\編于星期三\10點(diǎn)4、指示劑

電泳過程中，常使用一種有顏色的標(biāo)記物以指示樣品的遷移過程。目前常用的核酸電泳指示劑是溴酚藍(lán)，呈藍(lán)紫色。當(dāng)前第59頁\共有150頁\編于星期三\10點(diǎn)5、染色①溴化乙錠（ethidiumbromide,EB）可很好地?fù)饺氲诫p鏈DNA中，在紫外光的激發(fā)下會呈現(xiàn)橙紅色的熒光，便于鑒定，可用于對DNA進(jìn)行染色和觀察。②SYBRGreenI

:新型低毒，高靈敏度染料，加入樣品中，價格較EB貴。

強(qiáng)烈誘變劑當(dāng)前第60頁\共有150頁\編于星期三\10點(diǎn)1.4聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）可很好的分辨100bp-1kb大小的核酸分子。對單鏈DNA來說，其分辨率可達(dá)1bp，這種分辨能力在DNA序列測定中發(fā)揮了重要作用。

特點(diǎn)：分辨率高；載樣量大；回收DNA純度高；適于寡聚核苷酸及DNA序列分析，DNA<500bp當(dāng)前第61頁\共有150頁\編于星期三\10點(diǎn)當(dāng)前第62頁\共有150頁\編于星期三\10點(diǎn)當(dāng)前第63頁\共有150頁\編于星期三\10點(diǎn)1.5脈沖電場凝膠電泳（pulsed-fieldgelelectrophoresis,PEGE）

1984年，D.C.Schwartz和C.R.Cantor發(fā)明。用來分離整條染色體這樣的超大分子量DNA分子，如大腸桿菌染色體基因組DNA，>4000kb。DNA分子的遷移方向隨所用電場方向的周期性變化而不斷改變。可成功分離到分子量高達(dá)107bp的DNA大分子。

當(dāng)前第64頁\共有150頁\編于星期三\10點(diǎn)脈沖場凝膠電泳實(shí)際上是一種交替變化電場方向的電泳，以一定的角度并以一定的時間變換電場方向，使DNA分子在微觀上按“Z”字形向前泳動，從而到達(dá)分離大分子DNA的目的。與常規(guī)的直流單向電場凝膠電泳不同，這項技術(shù)采用定時改變電場方向的交變電源，每次電流方向改變后持續(xù)1秒到5分鐘左右，然后再改變電流方向，反復(fù)循環(huán)，所以稱之為脈沖式交變電場。脈沖場凝膠電泳的工作方式：橫向交變電泳（TAFE）、場翻轉(zhuǎn)凝膠電泳（FIGE）、旋轉(zhuǎn)凝膠電泳和箝位勻場電泳（CHEF）。其中使用最廣泛的是CHEF。當(dāng)前第65頁\共有150頁\編于星期三\10點(diǎn)+++-----2當(dāng)前第66頁\共有150頁\編于星期三\10點(diǎn)當(dāng)前第67頁\共有150頁\編于星期三\10點(diǎn)當(dāng)前第68頁\共有150頁\編于星期三\10點(diǎn)當(dāng)前第69頁\共有150頁\編于星期三\10點(diǎn)脈沖電泳槽電泳儀冷凝器真空泵BIio-Rad公司CHEF-DR脈沖電泳儀當(dāng)前第70頁\共有150頁\編于星期三\10點(diǎn)影響脈沖場凝膠電泳的因素：脈沖時間、分子大小、電場強(qiáng)度、溫度和電場間角度。若分子重新定向時間和脈沖時間的比值在0.1-1之間，對較長的DNA片段的分離具有最佳的分辨率。當(dāng)前第71頁\共有150頁\編于星期三\10點(diǎn)1.6DNA片段的純化1、低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠電泳法瓊脂糖總體上可分為兩類：普通瓊脂糖和低熔點(diǎn)（LMP

）瓊脂糖。LMP瓊脂糖的熔點(diǎn)為62-65℃，其一旦溶解，便可在37℃持續(xù)保持液體狀態(tài)達(dá)數(shù)小時，而在25℃下也可持續(xù)保持液體狀態(tài)約10min。當(dāng)前第72頁\共有150頁\編于星期三\10點(diǎn)純化步驟：用LMP瓊脂糖凝膠分離特定的DNA片段→切割帶有目的DNA的瓊脂糖凝膠塊→加入適量緩沖液→加熱到60℃使凝膠溶化，DNA進(jìn)入水溶液中→通過苯酚/氯仿抽提和乙醇沉淀→獲得純化的DNA片段。（這是經(jīng)典的DNA片段回收方法，現(xiàn)在一般比較少用。）其在回收大片段DNA時仍是一個比較好的辦法，在回收大片段DNA時在加熱融化后常用瓊脂糖酶水解瓊脂糖，從而減少殘留的雜質(zhì)，提高回收效率。當(dāng)前第73頁\共有150頁\編于星期三\10點(diǎn)2、透析袋電洗脫法

純化步驟：將含有目的DNA片段的瓊脂糖凝膠塊切割下來→放在透析袋中→置于電泳緩沖液中電泳→DNA分子在電場作用下從凝膠塊中游離出來，貼在透析袋內(nèi)壁上→取出凝膠塊→更換新鮮緩沖液，反向電泳，使DNA游離于緩沖液中→取出含DNA的緩沖液→通過苯酚/氯仿抽提和乙醇沉淀→獲得純化的DNA分子。

透析袋電洗脫法現(xiàn)在多用來純化相對分子量較大的DNA片段。

當(dāng)前第74頁\共有150頁\編于星期三\10點(diǎn)3、GlassMilk（bead）結(jié)合法該方法涉及兩個關(guān)鍵技術(shù)：①瓊脂糖凝膠在3倍體積的3mol/LNaI溶液作用下與55℃會溶化，從而使DNA釋放到水溶液中；②在這樣的高鹽濃度下有一種硅粒（glassbead，硅的細(xì)微顆粒，其水溶液呈牛奶狀，故也成為玻璃奶，glassmilk）可特異性吸附DNA。當(dāng)硅粒吸附DNA后，通過離心的方法很容易對硅粒進(jìn)行洗滌，然后用水或低鹽緩沖液可從硅粒中將吸附的DNA洗脫出來。該方法操作簡便，回收效率高，易于推廣。但回收的DNA片段一般不超過10kb，否則回收效率低。

當(dāng)前第75頁\共有150頁\編于星期三\10點(diǎn)4、純化試劑盒純化DNA

目前已有純化各類DNA的商品試劑盒，大部分都是使用帶硅膠膜的純化柱吸附DNA，再經(jīng)過洗滌、洗脫步驟得到純化的DNA。該方法操作簡便快速，且純化效果好。但其只對小于10kb的DNA片段有好的純化效果，且價格相對于其他方法較昂貴。（目前也有一些公司開發(fā)出可以純化>20kbDNA的純化試劑盒，有些還可純化回收到50kb左右的DNA片段）當(dāng)前第76頁\共有150頁\編于星期三\10點(diǎn)1.7DNA或RNA的紫外分光光度法測定純度

定量測定DNA或RNA時需要讀取260nm和280nm兩個波長下的讀數(shù)。根據(jù)260nm處的讀數(shù)可計算出樣品中核酸的濃度，1個OD值相當(dāng)于約50μg/ml雙鏈DNA、40μg/ml單鏈DNA和RNA及33μg/ml單鏈寡核苷酸。利用OD260和OD280的比值可計算出核酸的純度，DNA的純制品OD260：OD280為1.8，RNA的純制品OD260：OD280為2.0.若低于這兩個值說明核酸中含有酚或蛋白質(zhì)等雜質(zhì)。當(dāng)前第77頁\共有150頁\編于星期三\10點(diǎn)1.8DNA分離、純化過程中常用到的有毒試劑1、SDS有毒，是一種刺激物，對眼睛會造成嚴(yán)重?fù)p傷，可因吸入、咽下或皮膚吸收而損害健康。使用時需戴手套，稱量時需戴口罩。2、β-巰基乙醇高濃度的β-巰基乙醇對黏膜、上呼吸道、皮膚和眼睛有嚴(yán)重的損失作用，使用時需要戴手套于通風(fēng)櫥操作。3、PEG可因吸入、咽下或皮膚吸收而危害健康。使用時需戴手套于通風(fēng)櫥操作。當(dāng)前第78頁\共有150頁\編于星期三\10點(diǎn)4、蛋白酶K是一種刺激物，使用時需戴手套。5、溴化乙錠（EB）是一種強(qiáng)誘變劑，使用時要避免吸入其粉末。在用含有EB的溶液工作時需戴合適的手套。6、苯酚具有很強(qiáng)的毒性和高度的腐蝕性，并能引起嚴(yán)重的灼傷，可因吸入、咽下或皮膚吸收而受到危害。使用時要戴手套，于通風(fēng)櫥操作。如皮膚接觸到酚，需立即用大量的水沖洗接觸酚的部位，并用肥皂和水洗。7、氯仿、異戊醇、異丙醇等溶劑都具有刺激性氣味，可因吸入、咽下或皮膚吸收而危害健康，使用時需戴手套于通風(fēng)櫥操作。當(dāng)前第79頁\共有150頁\編于星期三\10點(diǎn)第二節(jié)RNA的分離、檢測和純化

細(xì)胞內(nèi)的RNA主要有：rRNA、tRNA、mRNA。對于基因操作來說，所需的RNA主要是mRNA，其在細(xì)胞中的含量最少，僅占總RNA的1%-5%。由于mRNA是單鏈的，容易受到核酸酶的攻擊，導(dǎo)致在RNA操作過程中易降解。故RNA的提取要比DNA困難許多。實(shí)驗成敗關(guān)鍵：創(chuàng)造一個無RNase的環(huán)境去除外源性RNase的污染：DEPC(焦碳酸二乙酯)抑制內(nèi)源性RNase的活性RＮase阻抑蛋白（RＮasin，非競爭性抑制劑）氧銅核糖核苷復(fù)合物硅藻土當(dāng)前第80頁\共有150頁\編于星期三\10點(diǎn)2.1控制潛在RNA酶的活性

一、溶液和用具的去RNA酶處理RNA酶能耐高溫，即使是高溫濕熱滅菌也不可能完全清除其活性。對于一些耐熱的物品，如玻璃制品，可通過高溫干熱滅菌。（180℃烘箱中烘烤8h以上）對于一些塑料物品，如移液吸頭和微量離心管，應(yīng)用0.1％焦碳酸二乙酯（DEPC）處理過的水浸泡后再滅菌，或者購買無RNA酶污染的用具。當(dāng)前第81頁\共有150頁\編于星期三\10點(diǎn)對于電泳用具最好使用專用的，不要用于其他分析，并且在使用之前用洗滌劑洗刷干凈，再用3%H2O2和0.1%DEPC處理的水浸泡，清洗干凈。對于可能接觸RNA的溶液，需要用DEPC處理的水配制。在提取過程中要戴口罩，盡量少講話，始終戴一次性橡膠手套，并且經(jīng)常更換，以防止手、臂上的細(xì)菌和真菌以及人體自身分泌的RNA酶污染用具。（不要使用一次性塑料手套，因為塑料手套多出的部分常常在器具的RNA酶污染處和無RNA酶處傳播RNA酶，擴(kuò)大污染。）當(dāng)前第82頁\共有150頁\編于星期三\10點(diǎn)二、RNA酶抑制劑的使用目前應(yīng)用較多的是蛋白類抑制劑，如人胎盤RNase抑制劑。除此外，還有氧銅核糖核苷復(fù)合物和硅藻土。當(dāng)前第83頁\共有150頁\編于星期三\10點(diǎn)2.2RNA的抽提和純化RNA提取的一般步驟：①破碎細(xì)胞；②使核蛋白復(fù)合體充分變性，即使核蛋白迅速與核酸分離；③抑制內(nèi)源RNase以及容器污染的外源RNase的活性；④將RNA與DNA、蛋白質(zhì)和多糖分開。當(dāng)前第84頁\共有150頁\編于星期三\10點(diǎn)1、酚—異硫氰酸胍抽提法(TRIZOL試劑)

TRIZOL試劑是使用最廣泛的抽提總RNA的專用試劑，主要由苯酚和異硫氫酸胍組成。對任何生物材料的RNA提取，首先研磨組織或細(xì)胞，或使之裂解；加入該試劑后，可保持RNA的完整，同時進(jìn)一步破碎細(xì)胞并溶解細(xì)胞成分；加入氯仿抽提，離心，水相和有機(jī)相分離；收集含RNA的水相；通過異丙醇沉淀，可獲得RNA樣品。

Trizol的主要成分是酚，主要作用是裂解細(xì)胞。酚不能完全抑制RNA酶活性。0.1%的8-羥基喹啉與氯仿聯(lián)合使用可增強(qiáng)對RNase的抑制；異硫氰酸胍屬于解偶劑，是一類強(qiáng)力的蛋白質(zhì)變性劑，可溶解蛋白質(zhì)，并使蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)消失，細(xì)胞結(jié)構(gòu)降解，核蛋白迅速與核酸分離。β-巰基乙醇主要破壞RNase蛋白質(zhì)中的二硫鍵。

當(dāng)前第85頁\共有150頁\編于星期三\10點(diǎn)2、硅膠膜純化法（純化柱試劑盒）設(shè)計思路與DNA的分離純化思路相似：含有目標(biāo)核酸的細(xì)胞破碎液通過硅膠膜時，核酸吸附在硅膠膜上，從而與其它細(xì)胞成分分開，然后在低鹽濃度下核酸可從硅膠膜上洗脫出來。

當(dāng)前第86頁\共有150頁\編于星期三\10點(diǎn)2.3mRNA的純化

mRNA的純化主要是針對于真核生物的，由于真核生物mRNA的3’端有一個poly（A）尾，可與oligo（dT）-纖維素吸附，從而可利用親和層析的方法純化。對于原核生物，其mRNA與其他的RNA沒有明顯的結(jié)構(gòu)差異，難以從總RNA中純化出來。當(dāng)前第87頁\共有150頁\編于星期三\10點(diǎn)當(dāng)前第88頁\共有150頁\編于星期三\10點(diǎn)2.4RNA的電泳檢測

通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行RNA分析與DNA分析的原理是類似的。不同的是，由于RNA呈單鏈狀態(tài)，易形成鏈內(nèi)二級結(jié)構(gòu)。為保證電泳過程中RNA的遷移率與其相對分子質(zhì)量呈線性關(guān)系，因此，RNA分析是在變性條件下進(jìn)行的。常用的變性劑為甲醛，也可使用氫氧化甲基汞和乙二醛-二甲基亞砜（DMSO）。當(dāng)前第89頁\共有150頁\編于星期三\10點(diǎn)當(dāng)前第90頁\共有150頁\編于星期三\10點(diǎn)第三節(jié)分子雜交分子雜交是在分子克隆中的一類核酸和蛋白質(zhì)分析方法，用于檢測混合樣品中特定核酸分子或蛋白質(zhì)分子是否存在，以及期相對分子質(zhì)量的大小。生物化學(xué)中分子雜交是指DNA在變性后，在復(fù)性的過程中兩個不同來源但具有同源性的核酸分子形成雜合雙鏈的過程。當(dāng)前第91頁\共有150頁\編于星期三\10點(diǎn)當(dāng)前第92頁\共有150頁\編于星期三\10點(diǎn)

根據(jù)檢測對象的不同，分子雜交可分為Southern雜交、Northern雜交和Western雜交，以及由此簡化的斑點(diǎn)雜交、狹線雜交和菌落雜交等。當(dāng)前第93頁\共有150頁\編于星期三\10點(diǎn)3.1Southern雜交

根據(jù)毛細(xì)管作用的原理，使在電泳凝膠中分離的DNA片段轉(zhuǎn)移并結(jié)合在適當(dāng)?shù)臑V膜上，然后通過同標(biāo)記的單鏈DNA或RNA探針的雜交作用檢測這些被轉(zhuǎn)移的DNA片段，這種實(shí)驗方法叫DNA印跡雜交技術(shù)。由E.Southern1975年設(shè)計，故又叫SouthernDNA印跡轉(zhuǎn)移技術(shù)。

印跡轉(zhuǎn)移（blotting)：通過電泳將DNA、RNA或蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行分離，使不同相對分子質(zhì)量的的分子在凝膠上展開，然后將凝膠上的樣品通過影印的方式轉(zhuǎn)移到濾膜上的過程稱為印跡。當(dāng)前第94頁\共有150頁\編于星期三\10點(diǎn)Southern雜交流程圖樣品制備電泳雜交轉(zhuǎn)膜結(jié)果顯示探針制備當(dāng)前第95頁\共有150頁\編于星期三\10點(diǎn)（一）Southern雜交的操作步驟1.預(yù)處理：（1）用限制性內(nèi)切酶將基因組DNA進(jìn)行酶切。（2）將酶切后的DNA片段進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。（3）將電泳出來的凝膠泡在強(qiáng)堿溶液中，此時雙鏈的DNA樣品變性成單鏈DNA結(jié)構(gòu)。（4）用酸中和，使單鏈DNA維持其單鏈狀態(tài)（5）大片段DNA脫嘌呤，0.2NHCl。2.原位轉(zhuǎn)移：將凝膠上的單鏈DNA轉(zhuǎn)移到尼龍膜或硝酸纖維素膜上。（毛細(xì)管、電轉(zhuǎn)移、真空轉(zhuǎn)移）當(dāng)前第96頁\共有150頁\編于星期三\10點(diǎn)當(dāng)前第97頁\共有150頁\編于星期三\10點(diǎn)當(dāng)前第98頁\共有150頁\編于星期三\10點(diǎn)當(dāng)前第99頁\共有150頁\編于星期三\10點(diǎn)3.固定：在真空烤箱里，80℃下烤1-3h或紫外線照射或微波烘烤，將核酸樣品進(jìn)一步固定在濾膜上。4.雜交：雜交之前須有一個預(yù)雜交，封阻膜的背景，避免雜交時背景吸附探針。（魚精DNA或脫脂牛奶）將濾膜移在含有放射性同位素標(biāo)記的探針分子溶液中，溶液上的單鏈DNA分子與探針分子通過互補(bǔ)配對進(jìn)行雜交，形成雜種分子。當(dāng)前第100頁\共有150頁\編于星期三\10點(diǎn)5.漂洗：將濾膜上沒有和單鏈DNA樣品結(jié)合的游離的探針分子漂洗下來，此后濾膜上只有雜交分子。6.放射自顯影：在X光曝射下進(jìn)行放射自顯影形成自顯影圖片。7.比較鑒定：將放射自顯影圖片上的譜帶與凝膠上的譜帶進(jìn)行比較。確定與探針分子結(jié)合的DNA分子是凝膠上DNA鏈的那個片段。當(dāng)前第101頁\共有150頁\編于星期三\10點(diǎn)放射自顯影DNA印跡轉(zhuǎn)移探針雜交－＋當(dāng)前第102頁\共有150頁\編于星期三\10點(diǎn)SouthernBlotting的過程1.堿變性的瓊脂糖凝膠電泳分離的DNA2.通過電泳液的移動轉(zhuǎn)移膠中的DNA3.固定膠中的DNA4.預(yù)雜交和雜交(放射性和熒光檢測)5.結(jié)果檢測當(dāng)前第103頁\共有150頁\編于星期三\10點(diǎn)

Southern印跡雜交方法操作簡單，結(jié)果十分靈敏，在理想的條件下，應(yīng)用放射性同位素標(biāo)記的特異性探針和放射自顯影技術(shù)，即使每帶電泳條帶僅含有2ng的DNA也能被清晰地檢測出來。

Southern雜交主要用于判斷某一生物樣品中是否存在某一基因，以及該基因所在的限制性酶切片段的大小。（鑒定特定的目的基因）當(dāng)前第104頁\共有150頁\編于星期三\10點(diǎn)當(dāng)前第105頁\共有150頁\編于星期三\10點(diǎn)當(dāng)前第106頁\共有150頁\編于星期三\10點(diǎn)

1.硝酸纖維素濾膜在印跡技術(shù)中，硝酸纖維素濾膜是目前應(yīng)用最廣的一種固相支持物，但它存在一些不足之處:

（1）硝酸纖維素濾膜是依賴疏水性相互作用結(jié)合DNA的，這種結(jié)合并不十分牢固，隨著雜交及洗膜進(jìn)程，DNA會慢慢脫離硝酸纖維素濾膜，從而使雜交效率下降。（二）Southern雜交的雜交濾膜當(dāng)前第107頁\共有150頁\編于星期三\10點(diǎn)（2）硝酸纖維素濾膜質(zhì)地較脆弱，容易碎裂，因此操作須小心謹(jǐn)慎(特別是經(jīng)烘烤后)。（3）硝酸纖維素濾膜與核酸的結(jié)合有賴于高鹽濃度，在低鹽濃度時結(jié)合DNA效果不佳，不適宜于電轉(zhuǎn)印跡法。（4）硝酸纖維素濾膜對于小分子質(zhì)量的DNA片段(特別是小于200bp的DNA片段)結(jié)合能力不強(qiáng)。當(dāng)前第108頁\共有150頁\編于星期三\10點(diǎn)2.尼龍膜優(yōu)點(diǎn)：結(jié)合DNA和RNA的能力強(qiáng)于硝酸纖維素濾膜，對小分子質(zhì)量的核酸也能較好地結(jié)合。尼龍膜韌性強(qiáng)，操作較方便，對離子濃度要求不高，可重復(fù)用于雜交。缺點(diǎn)：雜交信號本底較硝酸纖維素濾膜高。當(dāng)前第109頁\共有150頁\編于星期三\10點(diǎn)3.2Northern雜交將RNA分子從電泳凝膠轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜或其他化學(xué)修飾的活性濾紙上，進(jìn)行核酸雜交的一種實(shí)驗方法。檢測RNA（主要是mRNA）的方法與Southern雜交的不同靶核酸：RNARNA電泳轉(zhuǎn)膜：不需變性當(dāng)前第110頁\共有150頁\編于星期三\10點(diǎn)Northern雜交的過程

①提取總RNA。②分離mRNA。利用親和層析的原理純化mRNA。③制備RNA探針。根據(jù)mRNA序列合成同源DNA探針，或以cDNA為探針。④Northern雜交。Northern雜交的方法包括點(diǎn)雜交和印跡雜交，兩者都能鑒定外源基因是否得到轉(zhuǎn)錄，但后者還能確定mRNA分子質(zhì)量大小及豐度。當(dāng)前第111頁\共有150頁\編于星期三\10點(diǎn)當(dāng)前第112頁\共有150頁\編于星期三\10點(diǎn)

Northern雜交的應(yīng)用：

（1）檢測mRNA長度分子量大?。ㄒ离娪具w移率估計）；（2）mRNA的含量，即基因表達(dá)高低。（密度掃描儀，定量分析）

當(dāng)前第113頁\共有150頁\編于星期三\10點(diǎn)3.3Westen雜交

其雜交總體過程與Southern雜交相似，只是在印跡轉(zhuǎn)移過程中轉(zhuǎn)移的是蛋白質(zhì)而不是DNA。

Westen雜交主要用來檢測細(xì)胞或組織樣品中是否存在能被某抗體識別的蛋白質(zhì)，從而判斷在翻譯水平上某基因是否表達(dá)。當(dāng)前第114頁\共有150頁\編于星期三\10點(diǎn)主要步驟：蛋白質(zhì)樣品的制備SDS-聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)電泳蛋白質(zhì)的電轉(zhuǎn)移：硝酸纖維素膜靶蛋白的免疫學(xué)檢測靶蛋白與第一抗體（一抗）反應(yīng)與標(biāo)記的第二抗體（酶標(biāo)二抗）反應(yīng)顯色反應(yīng)：酶促反應(yīng)當(dāng)前第115頁\共有150頁\編于星期三\10點(diǎn)當(dāng)前第116頁\共有150頁\編于星期三\10點(diǎn)當(dāng)前第117頁\共有150頁\編于星期三\10點(diǎn)當(dāng)前第118頁\共有150頁\編于星期三\10點(diǎn)3.4其他分子雜交

以上三種分子雜交可以獲得較精確的結(jié)果，但在操作程序上比較繁瑣，當(dāng)樣品量很大時，難以滿足實(shí)驗的需要。為此，當(dāng)檢測大量樣品時可以采用簡化的方式做初步的檢測，如菌落雜交、噬菌斑雜交、斑點(diǎn)雜交和狹線雜交，然后再對陽性樣品作精確的測試。當(dāng)前第119頁\共有150頁\編于星期三\10點(diǎn)一、菌落雜交將細(xì)菌菌落影印到濾膜上，或?qū)⒕N點(diǎn)種在濾膜上然后再生長出可見的菌落→對濾膜上的菌體進(jìn)行原位裂解使DNA釋放出來，并使之固定在濾膜上→通過分子雜交，判斷哪個或哪些菌落含有與探針同源的DNA。菌落雜交主要用來從通過質(zhì)?；蝠ち］d體構(gòu)建的基因文庫中尋找陽性克隆子，當(dāng)?shù)玫疥栃钥寺∽雍?，再通過Southern雜交進(jìn)一步驗證。這種方法在一張直徑為9cm的濾膜上，可檢測幾百到幾千個菌落，達(dá)到高通量篩選的目的。當(dāng)前第120頁\共有150頁\編于星期三\10點(diǎn)圖2—3檢測重組體克隆的菌落雜交技術(shù)(a)將硝酸纖維素濾膜鋪放在生長著轉(zhuǎn)化菌落的平板表面，使其中的DNA轉(zhuǎn)移到濾膜上；(b)取出濾膜，做溶菌、堿變性、酸中和等處理后，置80℃下烤干；(c)帶有DNA印跡的濾膜同32P標(biāo)記的適當(dāng)探針雜交。以檢測帶有重組質(zhì)粒（含有被研究的DNA插入片段）的陽性菌落；(d)將放射自顯影的X光底片同保留下來的原菌落平板對照，從中挑出陽性菌落供作進(jìn)一步的分析研究當(dāng)前第121頁\共有150頁\編于星期三\10點(diǎn)二、噬菌斑雜交噬菌斑雜交與菌落雜交相似，只是所檢測的不是菌落而是噬菌體。主要用來篩選λ噬菌體載體構(gòu)建的基因文庫中的陽性重組體，通過Southern雜交進(jìn)一步驗證后可獲得所需要的目的基因。當(dāng)前第122頁\共有150頁\編于星期三\10點(diǎn)三、點(diǎn)雜交其是分子雜交中最簡單的一種，直接將DNA或RNA分子以斑點(diǎn)的形式固定在濾膜上，進(jìn)行分子雜交。其雜交的信號比菌落雜交和噬菌斑雜交受到蛋白質(zhì)等細(xì)胞成分的干擾小，其結(jié)果的可靠性更強(qiáng)。當(dāng)前第123頁\共有150頁\編于星期三\10點(diǎn)四、狹線雜交其是在斑點(diǎn)雜交的基礎(chǔ)上改進(jìn)而來的，只是點(diǎn)種核酸樣品的方式不同?？捎糜趯RNA進(jìn)行定量比較，從而比較目的基因的表達(dá)強(qiáng)度。當(dāng)前第124頁\共有150頁\編于星期三\10點(diǎn)3.5雜交探針的獲得

雜交探針是指經(jīng)放射性或非放射性等物質(zhì)標(biāo)記的已知或特定的DNA/RNA序列，用于核酸雜交可檢測特定的基因或轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。探針（probe）可以是DNA、RNA或寡核苷酸，可以是單鏈也可以是雙鏈（在使用前先變性成為單鏈）。

當(dāng)前第125頁\共有150頁\編于星期三\10點(diǎn)一、制備特異性探針?biāo)枰幕緱l件1.被檢基因結(jié)構(gòu)清楚；2.有明確的基因產(chǎn)物;3.已知某一基因產(chǎn)物對表型的反應(yīng)或缺少某一基因?qū)Ρ硇偷姆磻?yīng)。具備以上條件之一就可以制備特異性基因探針。當(dāng)前第126頁\共有150頁\編于星期三\10點(diǎn)二、探針的標(biāo)記

將探針標(biāo)記上一種標(biāo)識物以便雜交后檢測。常用于標(biāo)記探針的標(biāo)識物：

放射性同位素標(biāo)記（32P,35S,3H-dNTP等）：靈敏度高，成本低,但操作不便，標(biāo)記效率不太穩(wěn)定，壽命受半衰期限制

非放射性標(biāo)記（地高辛、生物素、熒光素等）：安全，標(biāo)記穩(wěn)定，探針壽命較長，但靈敏度較低，背景較高，成本高當(dāng)前第127頁\共有150頁\編于星期三\10點(diǎn)1、缺口平移法（NickTranslation）原理及過程：反應(yīng)體系中DNA酶I隨機(jī)在探針DNA上打開缺口，然后利用DNA聚合酶I5’→3’外切酶活性，在缺口處按5’→3’方向切除單核苷酸；同時DNA聚合酶I有5’→3’的聚合酶活性，在缺口處3’端加入底物中的單核苷酸，彌補(bǔ)缺口處的核苷酸鏈。隨著反應(yīng)的進(jìn)行底物中被標(biāo)記單核苷酸，并被隨機(jī)摻入。DNA聚合酶I的兩種作用交替進(jìn)行，探針即被標(biāo)記。當(dāng)前第128頁\共有150頁\編于星期三\10點(diǎn)NickTranslationOHpOH+PPDNAdNTP，DNA酶I，DNA聚合酶I32P-dNTP

Bio-dNTP當(dāng)前第129頁\共有150頁\編于星期三\10點(diǎn)2、隨機(jī)引物法（6核苷酸引物標(biāo)記法）

原理及過程：利用由六個核苷酸組成的序列隨機(jī)的寡核苷酸為引物，在Klenow酶的作用下對待標(biāo)記DNA進(jìn)行隨機(jī)擴(kuò)增。Klenow具有5’→3’聚合酶活性。被標(biāo)記的DNA（探針）變性成單鏈，引物與模板結(jié)合。在Klenow的催化下，以引物3’端為起點(diǎn)，沿模板3’→5’方向合成DNA新鏈。反應(yīng)體系中含有標(biāo)記的dNTP,隨機(jī)摻入新合成的DNA鏈中，探針即被標(biāo)記。當(dāng)前第130頁\共有150頁\編于星期三\10點(diǎn)隨機(jī)引物標(biāo)記探針5`3`5`5`3`DNA32p-dNTP,Bio-Dntp6bpprimerKlenow,dNTP變性-復(fù)姓當(dāng)前第131頁\共有150頁\編于星期三\10點(diǎn)****探針制備****當(dāng)前第132頁\共有150頁\編于星期三\10點(diǎn)非放射性標(biāo)記：地高辛標(biāo)記地高辛可以與dNTP連接成地高辛-dUTP(UTP)等，參入DNA(RNA)的合成過程，形成地高辛標(biāo)記的DNA(RNA)探針。利用抗地高辛的抗體通過酶聯(lián)免疫反應(yīng)來完成。當(dāng)前第133頁\共有150頁\編于星期三\10點(diǎn)探針檢測原理地高辛探針序列待測基因地高辛抗體酶底物產(chǎn)物探針DNA用地高辛標(biāo)記。地高辛抗體與酶偶聯(lián)。酶催化一個顯色反應(yīng)。地高辛抗體與地高辛結(jié)合。當(dāng)前第134頁\共有150頁\編于星期三\10點(diǎn)偶聯(lián)酶及其底物：堿性磷酸酶（AlkalinePhosphatase,AP）當(dāng)前第135頁\共有150頁\編于星期三\10點(diǎn)當(dāng)前第136頁\共有150頁\編于星期三\10點(diǎn)轉(zhuǎn)化的原理與技術(shù)轉(zhuǎn)化率轉(zhuǎn)化細(xì)胞的擴(kuò)增第五節(jié)重組DNA分子導(dǎo)入大腸桿菌當(dāng)前第137頁\共有150頁\編于星期三\10點(diǎn)5.1轉(zhuǎn)化的原理與技術(shù)5.1.1Ca2+誘導(dǎo)的完整細(xì)菌細(xì)胞的轉(zhuǎn)化Ca2+誘導(dǎo)的完整細(xì)胞的轉(zhuǎn)化適用于革蘭氏陰性細(xì)菌（如大腸桿菌等），1970年建立此技術(shù).其原理是Ca2+與細(xì)菌外膜磷脂在低溫下形成液晶結(jié)構(gòu)，后者經(jīng)熱脈沖發(fā)