酶的生產(chǎn)與分離純化

2.1國內(nèi)外酶制劑工業(yè)生產(chǎn)及應(yīng)用現(xiàn)狀當(dāng)前第1頁\共有69頁\編于星期四\13點2.1.1．新技術(shù)在生產(chǎn)中的應(yīng)用：三種方法：組織提取：木瓜蛋白酶、凝乳蛋白酶微生物發(fā)酵：最大量的來源化學(xué)及生物合成：生物重組高新技術(shù)的應(yīng)用：酶的修飾、固定化、基因重組、膜分離技術(shù)、冷凍干燥、微膠囊當(dāng)前第2頁\共有69頁\編于星期四\13點2.1.2.集中壟斷，市場全球化：規(guī)模企業(yè)由20世紀(jì)80年代初的80多家減少至20多家，占市場90%丹麥諾和諾得公司（諾維信novozymes）→1978年進(jìn)入中國諾維信公司，占50%市場（天津）；美國杰能科公司（Genencor）→98年進(jìn)入中國，與無錫合資，控股80%（無錫），兩家公司銷售額占全球2/3；（2005年杰能科國際公司被丹尼斯克公司收購）；芬蘭科特公司和丹麥丹尼斯克公司酶制劑業(yè)務(wù)合并，Pfizer，Rhone，SKW,Biosystems，日本天野當(dāng)前第3頁\共有69頁\編于星期四\13點2.1.3.品種、規(guī)模不斷擴大目前30多家600多個品種，應(yīng)用于18個工業(yè)領(lǐng)域。我國2000年酶制劑產(chǎn)量為30萬噸，100家，市場份額僅占5%，以未經(jīng)除菌去渣的粗制品粉狀酶為主。國際以液體、顆粒為主。國內(nèi)糖化酶、ａ-淀粉酶、蛋白酶三大類占了97%，顯然不合理。重要產(chǎn)品普魯蘭酶、真菌淀粉酶、系列果膠酶、低溫堿性蛋白酶，國內(nèi)尚未投入生產(chǎn);我國有7家上市公司介入酶制劑開發(fā)生產(chǎn)。當(dāng)前第4頁\共有69頁\編于星期四\13點2.1.4.應(yīng)用領(lǐng)域不斷擴大：美國酶制劑年產(chǎn)值6.25億美元，食品工業(yè)占62%，拓展飼料工業(yè)、洗滌劑工業(yè)、化學(xué)工業(yè)。當(dāng)前第5頁\共有69頁\編于星期四\13點2.2酶的發(fā)酵技術(shù)利用微生物產(chǎn)酶的優(yōu)點是：(1)微生物種類多、酶種豐富，且菌株易誘變，菌種多樣。(2)微生物生長繁殖快，易提取酶，特別是胞外酶。(3)微生物培養(yǎng)基來源廣泛、價格便宜。(4)可以采用微電腦等新技術(shù)，控制酶發(fā)酵生產(chǎn)過程，生產(chǎn)可連續(xù)化、自動化，經(jīng)濟效益高。(5)可以利用以基因工程為主的現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)，選育菌種、增加酶產(chǎn)率和開發(fā)新酶種。因此，下面將主要介紹微生物發(fā)酵法產(chǎn)酶的一般原理和工藝。當(dāng)前第6頁\共有69頁\編于星期四\13點2.2.1產(chǎn)酶微生物菌種是發(fā)酵生產(chǎn)酶的重要條件。菌種不僅與產(chǎn)酶種類、產(chǎn)量密切相關(guān)，而且與發(fā)酵條件、工藝等關(guān)系密切。已經(jīng)在自然界中發(fā)現(xiàn)的酶有數(shù)千種，目前投入工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)的酶約有50～60種。它們的生產(chǎn)菌種十分廣泛，包括細(xì)菌、放線菌、酵母菌、霉菌。當(dāng)前第7頁\共有69頁\編于星期四\13點2.2.2酶的發(fā)酵技術(shù)2.2.2.1培養(yǎng)基培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分是微生物發(fā)酵產(chǎn)酶的原料，主要是碳源、氮源，其次是無機鹽、生長因子和產(chǎn)酶促進(jìn)劑等。重要當(dāng)前第8頁\共有69頁\編于星期四\13點（1）碳源碳素是構(gòu)成菌體成分的主要元素，也是細(xì)胞貯藏物質(zhì)和生產(chǎn)各種代謝產(chǎn)物的骨架，還是菌體生命活動的能量的主要來源。當(dāng)前酶制劑生產(chǎn)上使用的菌種大都是只能利用有機碳的異養(yǎng)型微生物。有機碳的主要來源有：一是農(nóng)副產(chǎn)品中如甘薯、麩皮、玉米、米糠等淀粉質(zhì)原料；二是野生的如土茯苓、橡子、石蒜等淀粉質(zhì)原料。此外，以石油產(chǎn)品中12～16碳的成分來作碳源，如以某些嗜石油微生物生產(chǎn)蛋白酶、脂酶，均已獲得成功。重要當(dāng)前第9頁\共有69頁\編于星期四\13點不同的細(xì)胞對各種碳源的利用差異很大，所以在配制培養(yǎng)基時應(yīng)根據(jù)不同細(xì)胞的不同要求而選擇合適的碳源。另外，選擇碳源除考慮營養(yǎng)要求外，還要考慮酶生物合成的誘導(dǎo)作用和是否存在分解代謝物阻遏作用。盡量選用具有誘導(dǎo)作用的碳源，盡量不用或少用有分解代謝物阻遏作用的碳源。例如，α－淀粉酶的發(fā)酵生產(chǎn)中，應(yīng)該選用有誘導(dǎo)作用的淀粉作為碳源，而不用對該酶有分解代謝物阻遏作用的果糖作為碳源。重要當(dāng)前第10頁\共有69頁\編于星期四\13點（2）氮源氮是生物體內(nèi)各種含氮物質(zhì)，如氨基酸、蛋白質(zhì)、核苷酸、核酸等的組成成分。酶制劑生產(chǎn)中的氮源主要有有機氮源和無機氮源兩種，常用的有機氮源有：豆餅、花生餅、菜籽餅、魚粉、蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、多肽、氨基酸等；無機氮源有：(NH4)2SO4、NH4Cl、NH4NO3、(NH4)3P04、尿素等。重要當(dāng)前第11頁\共有69頁\編于星期四\13點不同的細(xì)胞對各種氮源的要求各不相同，應(yīng)根據(jù)要求進(jìn)行選擇和配制。一般來說，動物細(xì)胞要求有機氮，植物細(xì)胞主要要求無機氮。多數(shù)情況下將有機氮源和無機氮源配合使用才能取得較好的效果。例如黑曲霉酸性蛋白酶生產(chǎn)，只用銨鹽或硝酸鹽為氮源時，酶產(chǎn)量僅為有胨時的30%。只用有機氮源而不用無機氮源時產(chǎn)量也低，故一般除使用高濃度有機氮源外尚需添加1%~3%的無機氮源。重要當(dāng)前第12頁\共有69頁\編于星期四\13點（3）碳氮比在微生物酶生產(chǎn)培養(yǎng)基中碳源與氮源的比例是隨生產(chǎn)的酶類、生產(chǎn)菌株的性質(zhì)和培養(yǎng)階段的不同而改變的。一般蛋白酶(包括酸性、中性和堿性蛋白酶)生產(chǎn)采用碳氮比低的培養(yǎng)基比較有利，例如黑曲霉3.350酸性蛋白酶生產(chǎn)采用由豆餅粉3.75%、玉米粉0.625%、魚粉0.625%。NH4Cl1%、CaCl20.5%、Na2HP040.2%、豆餅石灰水解液10%組成的培養(yǎng)基；重要當(dāng)前第13頁\共有69頁\編于星期四\13點淀粉酶(包括α－淀粉酶、糖化酶、β－淀粉酶等)生產(chǎn)的碳氮比一般比蛋白酶生產(chǎn)略高，例如枯草桿菌TUD127α－淀粉酶生產(chǎn)采用由豆餅粉4%、玉米粉8%、Na2HP040.8%、(NH4)2SO40.4%、CaCl20.2%組成的培養(yǎng)基。而在淀粉酶生產(chǎn)中糖化酶生產(chǎn)培養(yǎng)基的碳氮比是最高的。以上是蛋白酶和淀粉酶生產(chǎn)培養(yǎng)基碳氮比的一般規(guī)律，但是由于菌種很多而其性質(zhì)各異。很難說都是符合上述規(guī)律的。重要當(dāng)前第14頁\共有69頁\編于星期四\13點在微生物酶生產(chǎn)過程中，培養(yǎng)基的碳氮比也因培養(yǎng)過程不同而異。例如種子培養(yǎng)時，為了適應(yīng)菌體生長繁殖的需要，要求提供合成細(xì)胞蛋白質(zhì)的氮多些，容易利用的氮源的比例大些，種子培養(yǎng)基的碳氮比一般要比發(fā)酵培養(yǎng)基低些。發(fā)酵時，不同發(fā)酵階段要求的碳氮比也是不同的。例如在枯草桿菌BF－7658生產(chǎn)α－淀粉酶的發(fā)酵過程中，發(fā)酵前期要求培養(yǎng)基的碳氮比適當(dāng)降低，以利菌體生長繁殖，發(fā)酵中后期要求培養(yǎng)基的碳氮比適當(dāng)提高，以促進(jìn)淀粉酶的生成。重要當(dāng)前第15頁\共有69頁\編于星期四\13點（4）無機鹽微生物酶生產(chǎn)和其他微生物產(chǎn)品生產(chǎn)一樣，培養(yǎng)基中需要有磷酸鹽及硫、鉀、鈉、鈣、鎂等元素存在。在酶生產(chǎn)中常以磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀等磷酸鹽作為磷源，以硫酸鎂為硫源和鎂源。鈣離子對淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶等多種酶的活性有十分重要的穩(wěn)定作用，例如在無Ca2+存在時灰色鏈霉菌中性蛋白酶只在pH7~7.5很小范圍內(nèi)穩(wěn)定，當(dāng)有Ca2+存在時穩(wěn)定pH范圍可以擴大到5～7。鈉離子有控制細(xì)胞滲透壓使酶產(chǎn)量增加的作用，酶生產(chǎn)的培養(yǎng)基中有時以磷酸氫二鈉及硝酸鈉等形式加入，例如米曲霉α－淀粉酶生產(chǎn)，添加適量的硝酸鈉以促進(jìn)酶生產(chǎn)。在天然培養(yǎng)基中，一般微量元素不必另外加入，但也有一些例外。如玉米粉、豆粉為碳源時，添加100ppmCo2+和Zn2+，放線菌166蛋白酶活力可增加70%～80%。重要當(dāng)前第16頁\共有69頁\編于星期四\13點（5）生長因子微生物還需一些微量的像維生素一類的物質(zhì)，才能正常生長發(fā)育，這類物質(zhì)統(tǒng)稱生長因子(或生長素)。其中包括某些氨基酸、維生素、嘌呤或嘧啶等。酶制劑生產(chǎn)中所需的生長因子，大多是由天然原料提供，如玉米漿、麥芽汁、豆芽汁、酵母膏、麩皮、米糠等。玉米漿中一般含有生長素32~128mg/mL。重要當(dāng)前第17頁\共有69頁\編于星期四\13點（6）產(chǎn)酶促進(jìn)劑產(chǎn)酶促進(jìn)劑是指在培養(yǎng)基中添加某種少量物質(zhì)，能顯著提高酶的產(chǎn)率，這類物質(zhì)稱為產(chǎn)酶促進(jìn)劑。產(chǎn)酶促進(jìn)劑大體上分為兩種：一是誘導(dǎo)物，二是表面活性劑。表面活性劑，如吐溫－80的濃度為0.1%時能增加許多酶的產(chǎn)量。表面活性劑能增加細(xì)胞的通透性，處在氣－液界面改善了氧的傳遞速度，還可以保護(hù)酶的活性。生產(chǎn)上常采用非離子型表面活性劑，如聚乙二醇、聚乙烯醇衍生物、植酸類、焦糖、羧甲基纖維素、苯乙醇等。離子型的表面活性劑對微生物有害。用于食品、醫(yī)藥的酶的生產(chǎn)中所用的表面活性劑還須對人、畜無害。此外各種產(chǎn)酶促進(jìn)劑的效果還受到菌種，種齡、培養(yǎng)基組成的影響。重要當(dāng)前第18頁\共有69頁\編于星期四\13點2.2.2.3液體深層發(fā)酵的工藝控制酶的發(fā)酵生產(chǎn)中發(fā)酵效果除了受到菌種產(chǎn)酶性能的影響外，還受到發(fā)酵溫度、pH、溶氧量等條件的影響。(1)溫度對產(chǎn)酶的影響發(fā)酵溫度的變化主要隨著微生物代謝反應(yīng)、發(fā)酵中通風(fēng)、攪拌速度的變化而變化的。微生物在生長發(fā)育中，不斷地吸收培養(yǎng)基營養(yǎng)成分來合成菌體的細(xì)胞物質(zhì)和酶時的生化反應(yīng)都是吸熱反應(yīng)；培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)被大量分解時的生化反應(yīng)都是放熱反應(yīng)。發(fā)酵初期合成反應(yīng)吸收的熱量大于分解反應(yīng)放出的熱量，發(fā)酵液需要升溫。當(dāng)菌體繁殖旺盛時，情況則相反，發(fā)酵液溫度就自行上升，加上通風(fēng)攪拌所帶來的熱量，這時，發(fā)酵液必須降溫，以保持微生物生長繁殖和產(chǎn)酶所需的適宜溫度。當(dāng)前第19頁\共有69頁\編于星期四\13點微生物生長繁殖和產(chǎn)酶的最適溫度隨著菌種和酶的性質(zhì)不同而異，生長繁殖和產(chǎn)酶的最適溫度往往不一致。一般細(xì)菌為37℃，霉菌和放線菌為28～30℃，一些嗜熱微生物需在40~50℃下生長繁殖，如紅曲霉生長溫度35~37℃，而生產(chǎn)糖化酶的最適溫度為37～40℃。在酶生產(chǎn)中，為了有利于菌體生長和酶的合成，也有進(jìn)行變溫生產(chǎn)的。例如以枯草桿菌ASl.398進(jìn)行中性蛋白酶生產(chǎn)時，培養(yǎng)溫度必須從31℃逐漸升溫至40℃，然后再降溫到31℃進(jìn)行培養(yǎng)，蛋白酶產(chǎn)量比不升溫者高66%。據(jù)報道，酶生產(chǎn)的溫度對酶活力的穩(wěn)定性有影響，例如用嗜熱芽孢桿菌進(jìn)行α－淀粉酶生產(chǎn)時，在55℃培養(yǎng)所產(chǎn)生的酶的穩(wěn)定性比35℃好。當(dāng)前第20頁\共有69頁\編于星期四\13點(2)pH對產(chǎn)酶的影響種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基的pH直接影響酶的產(chǎn)量和質(zhì)量。在發(fā)酵過程中，微生物不斷分解和同化營養(yǎng)物質(zhì)，同時排出代謝產(chǎn)物。由于這些產(chǎn)物都與pH有直接關(guān)系，因此發(fā)酵液pH在不斷發(fā)生變化。生產(chǎn)上根據(jù)pH的變化情況常作為生產(chǎn)控制的根據(jù)。一般來說，培養(yǎng)基成分中碳/氮(C/N)比高，發(fā)酵液傾向于酸性，pH低；C/N低，發(fā)酵液傾向于堿性，pH高。pH的這些變化情況，常常引起細(xì)胞生長和產(chǎn)酶環(huán)境的變化，對產(chǎn)酶帶來不利的影響。因此生產(chǎn)中常采用一些控制pH的方法，通常有：添加緩沖液維持一定的pH；調(diào)節(jié)通風(fēng)量維持發(fā)酵液的氧化還原電位于一定范圍；調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的初始pH，保持一定的C/N比；當(dāng)發(fā)酵液pH過高時用糖或淀粉來調(diào)節(jié)，pH過低時，通過氮調(diào)節(jié)。當(dāng)前第21頁\共有69頁\編于星期四\13點(3)通風(fēng)量對產(chǎn)酶的影響其實通風(fēng)量的多少應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)基中的溶解氧而定。一般來說，在發(fā)酵初期，雖然幼細(xì)胞呼吸強度大，耗氧多，但由于菌體少，相對通風(fēng)量可以少些；菌體生長繁殖旺盛期時，耗氧多，要求通風(fēng)量大些；產(chǎn)酶旺盛時的通風(fēng)量因菌種和酶種而異，一般需要強烈通風(fēng)；但也有例外，通風(fēng)量過多反而抑制酶的生成。因此，菌種、酶種、培養(yǎng)時期、培養(yǎng)基和設(shè)備性能都能影響通風(fēng)量，從而影響酶的產(chǎn)量。目前用于酶制劑生產(chǎn)的微生物都為好氣性微生物，生產(chǎn)上普遍采用自動測定和記錄溶解氧的儀表。當(dāng)前第22頁\共有69頁\編于星期四\13點(4)攪拌的影響對于好氣性微生物的深層發(fā)酵，除了需要通氣外，還需要攪拌。攪拌有利于熱交換、營養(yǎng)物質(zhì)與菌體均勻接觸，降低細(xì)胞周圍的代謝產(chǎn)物，從而有利于新陳代謝。同時可打破空氣氣泡，使發(fā)酵液形成湍流，增加湍流速度，從而提高溶氧量，增加空氣利用。但攪拌速度主要因菌體大小而異，由于攪拌產(chǎn)生剪切力，易使細(xì)胞受損。同時攪拌也帶來一定機械熱，易使發(fā)酵液溫度發(fā)生變化。攪拌速度還與發(fā)酵液黏度有關(guān)。當(dāng)前第23頁\共有69頁\編于星期四\13點(5)泡沫的影響發(fā)酵中往往產(chǎn)生較多的泡沫。泡沫的存在阻礙了CO2的排除，影響溶氧量，同時泡沫過多影響補料，也易使發(fā)酵液溢出罐外造成跑料。因此，生產(chǎn)上必須采用消泡措施。一般除了機械消泡外，還可利用消泡劑。消泡劑主要是一些天然的礦物油類、醇類、脂肪酸類、胺類、酰胺類、醚類、硫酸酯類、金屬皂類、聚硅氧烷和聚硅酮，其中以聚甲基硅氧烷最好。我國常用聚氧丙烯甘油醚或泡敵(聚環(huán)氧丙環(huán)氧乙烷甘油醚)。理想的消泡劑，其表面相互作用力應(yīng)低，而且應(yīng)難溶于水，還不能影響氧的傳遞速率和微生物的正常代謝。當(dāng)前第24頁\共有69頁\編于星期四\13點(6)濕度用固體培養(yǎng)基生產(chǎn)酶制劑時，一般前期濕度低些，培養(yǎng)后期濕度大些，有利于產(chǎn)酶。當(dāng)前第25頁\共有69頁\編于星期四\13點2.3酶的分離純化酶的分離純化工作，是酶學(xué)研究的基礎(chǔ)。酶的純化過程，就目前而言，還是一門實驗科學(xué)。一個特定酶的提純往往需要通過許多次小實驗進(jìn)行摸索，沒有通用的規(guī)律可循。酶的純化過程與一般的蛋白質(zhì)純化過程相比，又有其本身獨有的特點：一是特定的一種酶在細(xì)胞中的含量很少，二是酶可以通過測定活力的方法加以跟蹤，前者給純化帶來了困難，而后者卻能使我們迅速找出純化過程的關(guān)鍵所在。當(dāng)前第26頁\共有69頁\編于星期四\13點2.3.1酶原料的選擇一般來說，為了使純化過程容易進(jìn)行，總是選擇目的酶含量最多的生物組織為原料來進(jìn)行提取純化的。當(dāng)然，也要考慮原料的來源、取材方便、經(jīng)濟等因素。在分離純化動物Cu，Zn－SOD(超氧化物歧化酶)時，一般就以含Cu，Zn－SOD很高的動物血球為原材料。Mn－SOD主要存在于線粒體中，所以，龍蝦、靈芝草、人體組織適宜于作為提取Mn－SOD的原材料。但龍蝦、靈芝草等非常昂貴，人體組織也很難得到，因而，除非是特殊目的的純化，一般不選用這些材料提取酶。當(dāng)前第27頁\共有69頁\編于星期四\13點目前，利用動、植物細(xì)胞體外大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)，可以大量獲得以前極為珍貴的原材料(例如人參細(xì)胞、某些昆蟲細(xì)胞等)，用于酶的分離純化。利用基因工程重組DNA技術(shù)，能夠使某些在細(xì)胞中含量極微的酶的純化成為可能。例如，大腸桿菌胞內(nèi)芳香族氨基酸的合成需要EPSP合成酶（丙酮酰莽草酸磷酸合成酶）的參與?，F(xiàn)已分離出這種酶的基因并重組入多拷貝質(zhì)粒pAT153，將此質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌，產(chǎn)生一種比野生型大腸桿菌株高100倍EPSP合成酶含量的新菌株。從18g新菌株的菌體中，可純化得4.8mgEPSP合成酶。當(dāng)前第28頁\共有69頁\編于星期四\13點2.3.2酶的提取當(dāng)前第29頁\共有69頁\編于星期四\13點2.3.2.1生物組織的破碎各種生物組織的細(xì)胞有著不同的特點，在考慮破碎方法時，要根據(jù)細(xì)胞性質(zhì)、處理量及酶的性質(zhì)，采用合適的方法。(1)機械(勻漿)法利用機械力的攪拌、剪切、研碎細(xì)胞。常用的有高速組織搗碎機，高壓勻漿泵、玻璃或Teflon加研棒勻漿器高速球磨機或直接用研缽研磨等。(2)超聲波法超聲波是破碎細(xì)胞或細(xì)胞器的一種有效手段。經(jīng)過足夠時間的超聲波處理，細(xì)菌和酵母細(xì)胞都能得到很好的破碎。超聲處理的主要問題是超聲空穴局部過熱引起酶活性喪失，所以超聲振蕩處理的時間應(yīng)盡可能短，容器周圍以冰浴冷卻處理，盡量減小熱效應(yīng)引起的酶的失活。當(dāng)前第30頁\共有69頁\編于星期四\13點(3)凍融法生物組織經(jīng)冰凍后，細(xì)胞胞液結(jié)成冰晶，使細(xì)胞壁脹破。凍融法所需設(shè)備簡單，普通家用冰箱的冷凍室即可進(jìn)行凍融。一般需在凍融液中加入蛋白酶抑制劑，如PMSF(苯甲基磺酰氟)、絡(luò)合劑EDTA、還原劑DTT(二硫蘇糖醇)等以防破壞目的酶。(4)滲透壓法滲透破碎是破碎細(xì)胞最溫和的方法之一。細(xì)胞在低滲溶液中由于滲透壓的作用，溶脹破碎。如紅血球在純水中會發(fā)生破壁溶血現(xiàn)象。但這種方法對具有堅韌的多糖細(xì)胞壁的細(xì)胞，如植物、細(xì)菌和霉菌不太適用，除非用其他方法先除去這些細(xì)胞外層堅韌的細(xì)胞壁。當(dāng)前第31頁\共有69頁\編于星期四\13點(5)酶消化法利用溶菌酶、蛋白水解酶、糖苷酶對細(xì)胞膜或細(xì)胞壁的酶解作用，使細(xì)胞崩解破碎。將革蘭氏陽性菌(如枯草桿菌)與溶菌酶一起溫育，就能得到易破碎的原生質(zhì)體，用EDTA與革蘭氏陰性菌(如大腸桿菌)一起溫育，也可制得相應(yīng)的原生質(zhì)體。幾丁質(zhì)酶和3－葡聚糖酶則常用于水解曲霉、面包霉等的細(xì)胞壁。(6)化學(xué)破碎法化學(xué)破碎法是應(yīng)用各種化學(xué)試劑與細(xì)胞膜作用，使細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)改變或破壞的方法。常用的化學(xué)試劑可分為有機溶劑和表面活性劑兩大類。當(dāng)前第32頁\共有69頁\編于星期四\13點①有機溶劑處理常用的有機溶劑有甲苯、丙酮、丁醇、氯仿等。有機溶劑可使細(xì)胞膜的磷脂結(jié)構(gòu)破壞，從而改變細(xì)胞膜的透過性，再經(jīng)提取可使膜結(jié)合酶或胞內(nèi)酶等釋出胞外。例如，將細(xì)胞懸浮在10倍體積的預(yù)冷至－20℃的丙酮之中，攪拌均勻，待自然沉降后棄上清液，抽濾得細(xì)胞，再用2.5倍體積的－20℃丙酮洗滌，抽干后，把得到的細(xì)胞立即放入真空干燥器中，除去殘余的丙酮，得到細(xì)胞干粉，可長期保存，使用時再用水或緩沖液把胞內(nèi)的酶提取出來。②表面活性劑處理表面活性劑可以和細(xì)胞膜中的磷脂及脂蛋白相互作用使細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)破壞，增加膜的透過性。當(dāng)前第33頁\共有69頁\編于星期四\13點2.3.2.2酶的提取酶的提取是指在一定條件下，用適當(dāng)?shù)娜軇┨幚砗冈?，使酶充分溶解到溶劑中的過程，也稱作酶的抽提。酶提取時首先應(yīng)根據(jù)酶的結(jié)構(gòu)和溶解性質(zhì)，選擇適當(dāng)?shù)娜軇４蠖鄶?shù)酶能溶解于水，可用水或稀酸、稀堿、稀鹽溶液提?。挥行┟概c脂質(zhì)結(jié)合或含較多的非極性基團(tuán)，則可用有機溶劑提取。為了提高酶的提取率并防止酶的變性失活，在提取過程中，要注意控制好溫度、pH值等各種條件。破碎生物組織一般在適當(dāng)?shù)木彌_液中進(jìn)行。典型的抽提液由以下幾部分組成：當(dāng)前第34頁\共有69頁\編于星期四\13點抽提液＝離子強度調(diào)節(jié)劑十pH緩沖劑＋溫度效應(yīng)劑(KCl、NaCl、蔗糖)(各種緩沖液)(甘油、二甲基亞砜)＋蛋白酶抑制劑＋防氧化劑＋重金屬絡(luò)合劑＋增溶劑(PM3F、DIFP)(DTT巰基乙醇)(EDTA、檸檬酸)(TritonX－100)根據(jù)酶提取時所采用的溶劑或溶液的不同，酶的提取方法主要有鹽溶液提取、酸溶液提取、堿溶液提取和有機溶劑提取等。當(dāng)前第35頁\共有69頁\編于星期四\13點(1)鹽溶液提取大多數(shù)酶溶于水，而且在一定濃度的鹽存在條件下，酶的溶解度增加，這稱之為鹽溶現(xiàn)象，然而酶濃度不能太高，否則溶解度反而降低，出現(xiàn)鹽析現(xiàn)象。所以一般采用稀鹽溶液進(jìn)行酶的提取，鹽濃度一般控制在0.02~0.5mol/L的范圍內(nèi)。例如，用固體發(fā)酵生產(chǎn)的麩曲中的α－淀粉酶、糖化酶、蛋白酶等胞外酶，用0.15mol/L的氯化鈉溶液或0.02~0.05mol/L的磷酸緩沖液提?。唤湍复济摎涿赣?.5~0.6mol/L的磷酸氫二鈉溶液提??；6－磷酸葡萄糖脫氫酶用0.1mol/L的碳酸鈉提?。嚎莶輻U菌堿性磷酸酶用0.1mol/L的氯化鎂提取等。有少數(shù)酶，如霉菌產(chǎn)生的脂肪酶，用清水提取比鹽溶液提取的效果較好。當(dāng)前第36頁\共有69頁\編于星期四\13點(2)酸溶液提取有些酶在酸性條件下溶解度較大且穩(wěn)定性較好宜用酸溶液提取。例如從胰臟中提取胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶，采用0.12mol/L的硫酸溶液進(jìn)行提取。(3)堿溶液提取有些在堿性條件下溶解度較大且穩(wěn)定性較好的酶，應(yīng)采用堿溶液提取。例如，細(xì)菌L－天門冬酰胺酶的提取是將含酶菌體懸浮在pH11~12.5的堿溶液中，振蕩20min，即達(dá)到顯著的提取效果。(4)有機溶劑提取有些與脂質(zhì)結(jié)合比較牢固或分子中含非極性基團(tuán)較多的酶，不溶或難溶于水、稀酸、稀堿和稀鹽溶液中，需用有機溶劑提取。常用的有機溶劑是與水能夠混溶的乙醇、丙酮、丁醇等。其中丁醇對脂蛋白的解離能力較強，提取效果較好，已成功地用于琥珀酸脫氫酶、細(xì)胞色素氧化酶、膽堿酯酶等的提取。當(dāng)前第37頁\共有69頁\編于星期四\13點2.3.2.3離心分離離心是借助于離心機旋轉(zhuǎn)所產(chǎn)生的離心力，使不同大小和不同密度的物質(zhì)分離的技術(shù)，在酶的提取和分離純化過程中，細(xì)胞的收集、細(xì)胞碎片和沉淀的分離以及酶的純化等往往要使用離心分離。在離心分離時，要根據(jù)欲分離物質(zhì)以及雜質(zhì)的大小、密度和特性的不同，選擇適當(dāng)?shù)碾x心機、離心方法和離心條件。離心機多種多樣，按照離心機的最大轉(zhuǎn)速的不同可以分為常速(低速)、高速和超速三種。常速離心機的最大轉(zhuǎn)速在8000r/min以內(nèi)，相對離心力(RCF)在1×104g以內(nèi)，在酶的分離純化過程中，主要用于細(xì)胞、細(xì)胞碎片和培養(yǎng)基殘渣等固形物的分離。當(dāng)前第38頁\共有69頁\編于星期四\13點高速離心機的最大轉(zhuǎn)速為1×104~2.5×104r/min，相對離心力達(dá)到1×104g~1×105g，在酶的分離中主要用于沉淀、細(xì)胞碎片和細(xì)胞器等的分離。超速離心機的最大轉(zhuǎn)速達(dá)2.5×104~8×104r/min，相對離心力可以高達(dá)5×105g。超速離心可以采用差速離心、密度梯度離心或等密梯度離心等方法。超速離心可用于酶分子的分離純化。在離心過程中，應(yīng)該根據(jù)需要，選擇好離心力(或離心速度)和離心時間，并且控制好溫度和pH值等條件。當(dāng)前第39頁\共有69頁\編于星期四\13點2.3.3酶的純化抽提的酶液是否需要進(jìn)一步經(jīng)過純化，要視其應(yīng)用部門的要求。一般工業(yè)的酶，如紡織工業(yè)應(yīng)用α－淀粉酶脫膠處理，往往采用液體粗酶便可；皮革工業(yè)應(yīng)用的細(xì)菌蛋白酶也是如此。食品工業(yè)應(yīng)用的酶如果粗酶液已達(dá)到食品級標(biāo)準(zhǔn)要求，特別是衛(wèi)生指標(biāo)，也無需進(jìn)一步純化。然而，應(yīng)用于醫(yī)藥、化學(xué)試劑級的酶液必須進(jìn)一步純化。在濃縮液或發(fā)酵液中，除含有我們需要的酶以外，還不可避免地存在著其他大分子物質(zhì)和小分子物質(zhì)。其中小分子物質(zhì)在以后的純化步驟中會自然而然的除去。大分子物質(zhì)中包括核酸、粘多糖及其他蛋白質(zhì)等。因此，酶的分離純化工作主要是，將酶從雜蛋白中分離出來或者將雜蛋白從酶溶液中除去?，F(xiàn)有酶的分離純化方法都是依據(jù)酶和雜蛋白在性質(zhì)上的差異而建立的。當(dāng)前第40頁\共有69頁\編于星期四\13點酶和雜蛋白的性質(zhì)差異大體有以下幾個方面，它們的分離方法根據(jù)這個基礎(chǔ)分為：(1)根據(jù)分子大小而設(shè)計的方法。如離心分離法、篩膜分離法、凝膠過濾法等。(2)根據(jù)溶解度大小分離的方法、如鹽析法、有機溶劑沉淀法、共沉淀法、選擇性沉淀法、等電點沉淀法等。(3)按分子所帶正負(fù)電荷多少分離的方法，如離子交換分離法、電泳分離法、聚焦層析法等。(4)按穩(wěn)定性差異建立的分離方法，如選擇性熱變性法、選擇性酸堿變性法、選擇性表面變性法等。(5)按親和作用的差異建立的分離方法，如親和層析法、親和電泳法等。酶的純化方法：重要當(dāng)前第41頁\共有69頁\編于星期四\13點有機溶劑沉淀法利用和水互溶的有機溶劑使酶沉淀的方法很早就用來純化酶。在工業(yè)上也很重要，例如血漿蛋白質(zhì)的分離純化，至今仍采用本法。由于本法的機理和鹽析法不同，可作為鹽析法的補充。加入有機溶劑于酶溶液中產(chǎn)生多種效應(yīng)，這些效應(yīng)結(jié)合起來，使酶沉淀。其中主要效應(yīng)是水的活度的降低。當(dāng)有機溶劑濃度增大時，水對酶分子表面上荷電基團(tuán)或親水基團(tuán)的水化程度降低，或者說溶劑的介電常數(shù)降低，因而靜電吸力增大。在憎水區(qū)域附近有序排列的水分子可以為有機溶劑所取代，使這些區(qū)域的溶解性增大。但除了憎水性特別強的酶外，對多數(shù)酶來說，后者影響較小，所以總的效果是導(dǎo)致酶分子聚集而沉淀。

當(dāng)前第42頁\共有69頁\編于星期四\13點有機溶劑沉淀法的優(yōu)點是溶劑容易蒸發(fā)除去，不會殘留在成品中，因此適用于制備食品級酶。而且有機溶劑密度低，與沉淀物密度差大，便于離心分離。有機溶劑沉淀法的缺點是，容易使酶變性失活，且有機溶劑易燃、易爆、安全要求較高。當(dāng)前第43頁\共有69頁\編于星期四\13點凝膠過濾(gelfiltrationchromatography)凝膠過濾有多種名稱，又稱凝膠排阻層析、分子篩層析法、凝膠層析法等。是根據(jù)溶質(zhì)分子的大小進(jìn)行分離的方法。它具有一系列的優(yōu)點：操作方便，不會使物質(zhì)變性，層析介質(zhì)不需再生，可反復(fù)使用等；因而在酶純化中占有重要位置。由于凝膠層析劑的容量比較低，所以在生物大分子物質(zhì)的分離純化中，一般不作為第一步的分離方法，而往往在最后的處理中被使用。它的應(yīng)用主要包括脫鹽，生物大分子按分子大小分級分離以及分子量測定等。當(dāng)前第44頁\共有69頁\編于星期四\13點(1)基本原理在顯微鏡下，可觀察到凝膠過濾層析介質(zhì)具有海綿狀結(jié)構(gòu)。將凝膠裝于層析柱中，加入混合液，內(nèi)含不同分子量的物質(zhì)，小分子溶質(zhì)能在凝膠海綿狀網(wǎng)格內(nèi)，即凝膠內(nèi)部空間全都能為小分子溶質(zhì)所達(dá)到，凝膠內(nèi)外小分子溶質(zhì)濃度一致。在向下移動的過程中，它從一個凝膠顆粒內(nèi)部擴散到膠?？紫逗笤龠M(jìn)入另一凝膠顆粒，如此不斷地進(jìn)人與流出，使流程增長，移動速率慢故最后流出層析柱。而中等大小的分子，它們也能在凝膠顆粒內(nèi)外分布，部分送入凝膠顆粒，從而在大分子與小分子物質(zhì)之間被洗脫。大分子溶質(zhì)不能透人凝膠內(nèi)，而只能沿著凝膠顆粒間隙流運動，因此流程短，下移速度較小分子溶質(zhì)快而首先流出層析柱。因而樣品通過定距離的層析柱后，不同大小的分子將按先后順序依次流出，彼此分開。當(dāng)前第45頁\共有69頁\編于星期四\13點圖2－4凝膠過濾層析的原理a.小分子由于擴散作用進(jìn)入凝膠內(nèi)部被截留；大分子被排阻在顆粒外，在顆粒間迅速通過。b.1.蛋白質(zhì)混合物上柱，2.洗脫開始，小分子擴散進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)大分子被排阻在顆粒外，3.小分子被截留，大分子向下移動，大小分子分開，4.大小分子完全分開，5.大分子行程較短，已洗脫出層析柱，小分子尚在行進(jìn)中。當(dāng)前第46頁\共有69頁\編于星期四\13點(2)凝膠種類①葡聚糖凝膠是分子量幾萬到幾十萬的葡聚糖凝膠通過環(huán)氧氯丙烷交聯(lián)而成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)物質(zhì)，可分離分子量從l000~500000的分子。其商品名是SephadexG，有各種型號(表2－3)，G后的數(shù)字表示每g干膠吸水量(即吸水值)的10倍。其特性如表2－3所示，另外還有一種為Sephacryl－S，通過N，N－甲叉雙丙烯酰胺交聯(lián)的烯丙基葡聚糖，可適用于水、有機溶劑及高濃度解離試劑存在的系統(tǒng)。另一類Sephadex－LH，適用于脂類化合物的分離。當(dāng)前第47頁\共有69頁\編于星期四\13點葡聚糖凝膠在干燥狀態(tài)是堅硬的白色粉末，不溶于水和鹽類溶液。因具有大量的羥基，故有很大的親水性，在水中即顯膨脹，吸水后機械強度大大降低。它對堿和弱酸(pH2~12)穩(wěn)定。在強酸溶液中，特別是在高溫度下，糖苷鍵會水解。在中性下，可在120℃加壓消毒保存。和氧化劑接觸會分解。長久不用時，有時會長霉，應(yīng)加防腐劑。當(dāng)前第48頁\共有69頁\編于星期四\13點②聚丙烯酰胺凝膠是以丙烯酰胺為單體，通過N，N－甲叉雙丙烯酰胺為交聯(lián)劑共聚而成的凝膠物質(zhì)。商品名是Bio－GelP，有各種型號，P－后的數(shù)字乘以1000表示其分離的最大分子量(即排阻分子量)。當(dāng)前第49頁\共有69頁\編于星期四\13點③瓊脂糖凝膠瓊脂糖是瓊脂抽去瓊脂膠等之后所得D－半乳糖和3，6－脫水半乳糖，自動締合而成的網(wǎng)眼結(jié)構(gòu)物質(zhì)，孔徑大小由膠的濃度決定。以商品Sepharose為例，有2B、4B和6B等規(guī)格，B前面數(shù)字表示膠百分濃度。這類凝膠孔徑都比較大，適于分離較大的物質(zhì)，如病毒、細(xì)胞顆粒和DNA等。當(dāng)前第50頁\共有69頁\編于星期四\13點其他純化方法親和層析法利用生物體內(nèi)存在的特異性相互作用分子對而設(shè)計的層析方法染料層析法具有親和配基的染料可以吸附酶，由于配基的結(jié)構(gòu)類似某些酶的底物。疏水層析將疏水性基團(tuán)如丁烷、辛烷、苯固定化到介質(zhì)上，這些基團(tuán)會與蛋白質(zhì)生物大分子上的疏水區(qū)親和。電泳靠溶質(zhì)在電場移動中移動速度不同而分離的方法。當(dāng)前第51頁\共有69頁\編于星期四\13點2.4酶分離、純化的評價酶經(jīng)分離、純化后要確定該純化步驟是否適宜，必須經(jīng)過對有關(guān)參數(shù)的測定及計算才能確定。酶的產(chǎn)量是以活力單位表示，因此在整個分離過程中每一步始終貫穿比活力和總活力的檢測、比較。當(dāng)前第52頁\共有69頁\編于星期四\13點基本概念1酶活力(Enzymeactivity)：酶活力是指酶催化反應(yīng)的能力，它表示樣品中酶的含量。1961年國際酶學(xué)會規(guī)定，lmin催化lμmol分子底物轉(zhuǎn)化的酶量為該酶的一個活力單位(國際單位)，溫度為25℃，其它條件(pH、離子強度)采用最適條件。重要當(dāng)前第53頁\共有69頁\編于星期四\13點酶的總活力為樣品的全部酶活力?？偦盍?酶活力×總體積(mL)或=酶活力×總質(zhì)量(g)當(dāng)前第54頁\共有69頁\編于星期四\13點比活力(Specificactivity)：比活力是指單位蛋白質(zhì)(毫克蛋白質(zhì)或毫克蛋白氮)所含有的酶活力(單位/毫克蛋白)。比活力是酶純度指標(biāo)，比活力愈高表示酶愈純，即表示單位蛋白質(zhì)中酶催化反應(yīng)的能力愈大。但是，比活力仍然是個相對酶純度指標(biāo)。要了解酶的實際純度，尚需采用電泳等測定方法。當(dāng)前第55頁\共有69頁\編于星期四\13點

回收率(Yieldpercent)：回收率是指提純前與提純后酶的總活力之比。它表示提純過程中酶的損失程度，回收率愈高，其損失愈少。提純倍數(shù)：提純倍數(shù)是指提純前后兩者比活力之比。它表示提純過程中酶純度提高的程度，提純倍數(shù)愈大，提純效果愈佳。當(dāng)前第56頁\共有69頁\編于星期四\13點酶純化評價實例當(dāng)前第57頁\共有69頁\編于星期四\13點2.5酶的劑型與保存酶制劑通常有下列四種劑型：液體酶制劑固體粗酶制劑純酶制劑固定化酶制劑（見書中第五章）當(dāng)前第58頁\共有69頁\編于星期四\13點2.5.1液體酶制劑包括稀酶液和濃縮酶液。一般除去固體雜質(zhì)后，不再純化而直接制成，或加以濃縮而成，一般需要加穩(wěn)定劑。這種酶制劑不穩(wěn)定，且成分復(fù)雜，只用于某些工業(yè)生產(chǎn)。當(dāng)前第59頁\共有69頁\編于星期四\13點2.5.2固體粗酶制劑發(fā)酵液經(jīng)殺菌后直接濃縮或噴霧干燥制成。有的加入淀粉等填充料，用于工業(yè)生產(chǎn)。有的經(jīng)初步純化后制成，如用于洗滌劑、藥物生產(chǎn)。用于加工或生產(chǎn)某種產(chǎn)品時，務(wù)須除去起干擾作用的雜酶，才不會影響質(zhì)量。固體酶制劑適于運輸和短期保存，成本也不高。當(dāng)前第60頁\共有69頁\編于星期四\13點2.5.3純酶制劑包括結(jié)晶酶，通常用作分析試劑和醫(yī)療藥物。要求較高的純度和一定的活力單位數(shù)。用作分析工具酶時，除了要求沒有干擾作用