發(fā)育生物學(xué)發(fā)育生物學(xué)研究技術(shù)

發(fā)育生物學(xué)研究技術(shù)當(dāng)前第1頁\共有48頁\編于星期五\18點常用發(fā)育生物學(xué)研究技術(shù)簡介顯微鏡技術(shù)(成像imaging);組織切片技術(shù)(經(jīng)典解剖形態(tài)學(xué)morphology);生化分子生物學(xué);原位雜交技術(shù)(insituhybridization);顯微注射;報告基因技術(shù);細(xì)胞標(biāo)記技術(shù);當(dāng)前第2頁\共有48頁\編于星期五\18點顯微鏡技術(shù)目的：觀察胚胎個體分類：

光學(xué)(optical)顯微鏡:體視顯微鏡:組織分離用

熒光顯微鏡：當(dāng)前第3頁\共有48頁\編于星期五\18點顯微鏡技術(shù)激光共聚焦顯微鏡(laserconfocal)：熒光標(biāo)記，對胚胎或細(xì)胞中的特定蛋白質(zhì)或mRNA的分布進(jìn)行定性或定量研究；圖像采集的效果很好；細(xì)胞或組織的三維重塑(reconstructing)當(dāng)前第4頁\共有48頁\編于星期五\18點組織切片技術(shù)目的：觀察胚胎的內(nèi)部組織學(xué)結(jié)構(gòu)分類：石蠟組織切片：石蠟包埋，切片機(jī)切片冷凍切片：低溫包埋劑包埋，低溫切片機(jī)切片，對樣品中核酸的保存較好，但切片的質(zhì)量差。當(dāng)前第5頁\共有48頁\編于星期五\18點分子生物學(xué)技術(shù)目的：檢測目的基因或蛋白質(zhì)在某一發(fā)育時期或特定組織中的表達(dá)分類：Polymerasechainreaction(PCR):DNAamplificationReal-timequantitativePCR:RNA定量RT-PCR/Northernblotting:mRNA

expressionWesternblotting:protein

expression

免疫共沉淀

(Co-IP):protein-proteininteraction當(dāng)前第6頁\共有48頁\編于星期五\18點NorthernBlottingAnalysis當(dāng)前第7頁\共有48頁\編于星期五\18點SouthernBlottingAnalysis當(dāng)前第8頁\共有48頁\編于星期五\18點Real-timePCR儀當(dāng)前第9頁\共有48頁\編于星期五\18點原位雜交技術(shù)目的：檢測某一特定基因mRNA在某胚胎和組織中的分布情況分類：放射性標(biāo)記探針：放射自顯影非放射性標(biāo)記探針：地高辛(DIG)-免疫組化

熒光素-熒光免疫組化(FISH)當(dāng)前第10頁\共有48頁\編于星期五\18點原位探測基因表達(dá)

GeneexpressingguidingdevelopmentWhenandwhereparticulargenesareactiveIntactembryosorsectionsofembryosInsituhybrid:probes-radioactiveisotope,fluorescencetagoranenzymeDectection:autoradiography,fluorescencemicroscope,enzyme-substratereaction當(dāng)前第11頁\共有48頁\編于星期五\18點原位探測基因表達(dá)當(dāng)前第12頁\共有48頁\編于星期五\18點原位探測基因表達(dá)DistributionofmRNAforthegrowthfactorVg-1intheamphibianegg.Insituhybridizationwitharadioactiveprobe.(yellowsignals)當(dāng)前第13頁\共有48頁\編于星期五\18點原位探測基因表達(dá)當(dāng)前第14頁\共有48頁\編于星期五\18點利用原位雜交技術(shù)研究基因表達(dá)的時空譜mRNA的檢測當(dāng)前第15頁\共有48頁\編于星期五\18點FISH探測基因表達(dá)當(dāng)前第16頁\共有48頁\編于星期五\18點報道基因(reportergene)技術(shù)目的：用于啟動子/增強(qiáng)子的分析研究。采用一些產(chǎn)物易于檢測的基因(報道基因)與待研究的表達(dá)調(diào)控序列串聯(lián)，通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)導(dǎo)入胚胎體內(nèi)，分析報道基因產(chǎn)物的表達(dá)來研究目的片斷的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)活性。常用報道基因分類：

綠色熒光蛋白(GFP):分布用熒光顯微鏡觀察

lacZ基因:編碼β-半乳糖苷酶,用特異底物顯色研究其產(chǎn)物分布

熒光素酶(luciferase):常用體外基因表達(dá)活性分析，近年開始體內(nèi)研究當(dāng)前第17頁\共有48頁\編于星期五\18點啟動子活性檢測法表達(dá)載體的構(gòu)建：當(dāng)前第18頁\共有48頁\編于星期五\18點利用大分子間的相互作用克隆新的基因鑒定可與蛋白質(zhì)結(jié)合的DNA序列分離靶蛋白質(zhì)，（可采用gel-shiftassay)克隆靶蛋白的表達(dá)基因。利用DNA與蛋白質(zhì)間的相互作用當(dāng)前第19頁\共有48頁\編于星期五\18點分離時空特異性表達(dá)基因的方法利用蛋白質(zhì)之間的相互作用酵母雙雜交法當(dāng)前第20頁\共有48頁\編于星期五\18點顯微注射及細(xì)胞標(biāo)記技術(shù)目的：將外源DNA、RNA或標(biāo)記物等導(dǎo)入早期胚胎細(xì)胞中，如運用細(xì)胞標(biāo)記技術(shù)對胚胎早期卵裂球分化命運圖譜的研究。在小鼠和果蠅中常用于轉(zhuǎn)基因分析。細(xì)胞標(biāo)記物分類：早期：活體染料如尼羅藍(lán)或中性紅，不能標(biāo)記胚胎內(nèi)部組織現(xiàn)在：細(xì)胞外-親脂性熒光染料如DiI/Dio，不適于組織切片細(xì)胞內(nèi)-熒光標(biāo)記葡聚糖和HRP，需顯微注射，通過熒光顯微鏡或組織化學(xué)方法進(jìn)行定位。

示蹤基因：GFP和LacZ基因當(dāng)前第21頁\共有48頁\編于星期五\18點染料細(xì)胞標(biāo)記當(dāng)前第22頁\共有48頁\編于星期五\18點熒光細(xì)胞標(biāo)記當(dāng)前第23頁\共有48頁\編于星期五\18點細(xì)胞移植當(dāng)前第24頁\共有48頁\編于星期五\18點DNA/蛋白芯片目的：高通量篩選不同胚胎細(xì)胞或組織中基因/蛋白表達(dá)圖譜，獲得不同時期或組織差異表達(dá)的基因或蛋白。DNAchipProteinchip

microRNAchip分類：當(dāng)前第25頁\共有48頁\編于星期五\18點當(dāng)前第26頁\共有48頁\編于星期五\18點應(yīng)用DNAmicroarrays研究基因表達(dá)Highoutputscreeninggenesexpresseddifferentlyindifferenttissuesoratdifferentstagesindevelopment當(dāng)前第27頁\共有48頁\編于星期五\18點基因組時代：人類基因組計劃控制發(fā)育的基因的鑒定及其表達(dá)和功能檢測方法當(dāng)前第28頁\共有48頁\編于星期五\18點后基因組時代＝功能基因組時代空間結(jié)構(gòu)？胞內(nèi)分布及靶位？影響器官？基因類型？底物？影響途徑？當(dāng)前第29頁\共有48頁\編于星期五\18點發(fā)育遺傳學(xué)技術(shù)

發(fā)育生物學(xué)基本任務(wù)之一：研究基因在胚胎發(fā)育中的作用正向遺傳學(xué)技術(shù)：大規(guī)模隨機(jī)誘變，產(chǎn)生發(fā)育異常的突變個體，然后再尋找突變的基因。

1.大規(guī)模誘變篩選;2.插入誘變篩選;

3.突變基因的克隆;從自然或人工突變體中分離鑒定控制發(fā)育的基因當(dāng)前第30頁\共有48頁\編于星期五\18點從自然或人工突變體中分離鑒定控制發(fā)育的基因自然群體中的突變體；化學(xué)誘變劑處理，如亞硝基－乙脲－乙亞硝基脲(N-nitroso-N-ethylureaethylnitrosourea,ENU)；外源DNA插入法，如DNA注射、病毒感染、轉(zhuǎn)座子利用等；X－射線或r－射線照射獲得突變體的方法當(dāng)前第31頁\共有48頁\編于星期五\18點自發(fā)突變

(spontaneousmutation)Recessivemutation(純合體狀態(tài))/Dominant(雜合體狀態(tài))

/semi-dominant當(dāng)前第32頁\共有48頁\編于星期五\18點自發(fā)突變

(spontaneousemutation)semi-dominantmutation(半顯性突變)當(dāng)前第33頁\共有48頁\編于星期五\18點斑馬魚上ENU化學(xué)突變研究的成就(1996)從自然或人工突變體中分離鑒定控制發(fā)育的基因化學(xué)誘變法當(dāng)前第34頁\共有48頁\編于星期五\18點大規(guī)模誘變篩選通過射線或化學(xué)誘變劑處理父本個體，在其生殖系細(xì)胞中產(chǎn)生隨機(jī)突變，然后與wild-type母本個體雜交，F(xiàn)1個體中可能攜帶有基因突變。F1與野生型，F(xiàn)2(50%雜合突變體)群體內(nèi)雜交，F(xiàn)3(25%)可出現(xiàn)純合突變個體，發(fā)育異常當(dāng)前第35頁\共有48頁\編于星期五\18點DNA插入誘變法當(dāng)前第36頁\共有48頁\編于星期五\18點反轉(zhuǎn)錄病毒插入引起的突變的鑒定DNA插入誘變法當(dāng)前第37頁\共有48頁\編于星期五\18點大規(guī)模誘變篩選突變后的表型改變：

致死性

功能喪失：最常見。突變后的蛋白質(zhì)比野生型活性差；某一蛋白質(zhì)完全失活的突變?yōu)闊o效突變(nullmutation)

功能獲得：如某些受體突變后活化當(dāng)前第38頁\共有48頁\編于星期五\18點插入誘變篩選利用轉(zhuǎn)座子(transposon)或病毒載體做誘變劑。果蠅中為P-因子，可以隨即插入基因組中，并可以在基因組中移動，包括特殊序列和轉(zhuǎn)座酶，后代生殖細(xì)胞中，轉(zhuǎn)座酶就會誘導(dǎo)P-因子在基因中隨即轉(zhuǎn)座造成基因突變。當(dāng)前第39頁\共有48頁\編于星期五\18點突變基因的克隆突變體獲得后，克隆引起該突變的基因

插入突變：利用P-因子序列作為探針，從突變體文庫中篩選出含P-因子的克隆，從而確定其插入點及被阻斷的基因。

化學(xué)誘變或射線突變：定位克隆(positionalcloning)—根據(jù)目的基因在染色體上的位置進(jìn)行基因分離的。通過分析突變位點與已知分子標(biāo)記的連鎖關(guān)系來確定突變基因的染色體位置。常用的分子標(biāo)記包括單核苷酸多態(tài)性(SNPs)。當(dāng)前第40頁\共有48頁\編于星期五\18點Positionalcloning:1)確定突變基因的染色體定位2)獲取該片斷的基因組序列：數(shù)據(jù)庫3)生物信息學(xué)確定該片段可能含有的基因，結(jié)合其可能的功能和該突變體的表型，確定候選基因4)實驗驗證：功能異常，野生型rescue,RNAi當(dāng)前第41頁\共有48頁\編于星期五\18點發(fā)育遺傳學(xué)技術(shù)反向遺傳學(xué)技術(shù)：通過功能喪失(lossoffunction)或功能獲得(gainoffunction)實驗，研究胚胎個體所產(chǎn)生的表型而分析目的基因的功能。

基因修飾

1.基因敲除;2.條件基因敲除;

3.轉(zhuǎn)基因;當(dāng)前第42頁\共有48頁\編于星期五\18點Constructingknockoutmice獲得攜帶有特定基因突變個體的技術(shù)，研究基因在發(fā)育中功能的重要方法。1)構(gòu)建用于基因重組的突變基因結(jié)構(gòu)2)重組基因?qū)肱咛ジ杉?xì)胞(ES)3)注射ES入胚胎中以獲得雜合性小鼠4)小鼠雜交獲得純合體小鼠并進(jìn)行表型分析。當(dāng)前第43頁\共有48頁\編于星期五\18點Conditionalknockout僅使靶基因在特定的組織或發(fā)育時期失活。Cre-lox

系統(tǒng)

1)Cre編碼一種重組酶，可識別并結(jié)合位點并切除位于兩個LoxP位點之間的序列。2)兩個品系：靶基因兩側(cè)都加入LoxP位點;轉(zhuǎn)入由組織特異性啟動子控制的cre基因3)小鼠雜交，cre基因會在特異性組織中表達(dá)，切除靶基因，使之失活。當(dāng)前第44頁\共有48頁\編于星期五\18點Transgenictechnique1)將外源基因注射到受精卵的細(xì)胞核中，缺點是無法控制外源基因的插入情況，只能通過后代檢查DNA。2)將外源基因轉(zhuǎn)化到ES中，同geneknockout3)小鼠雜交。當(dāng)前第45頁\共有48頁\編于星期五\18點發(fā)育遺傳學(xué)技術(shù)反向遺傳學(xué)技術(shù)：

通過抑制性因子抑制目的基因的功能1.RNA干擾;2.嗎啉代寡聚核苷酸(MO):

利用反義寡聚核苷酸抑制特定mRNA(5’-UTR)的翻譯而阻斷目的基因功能的方法。主要應(yīng)用在斑馬魚和爪蟾研究中，但現(xiàn)在也用于miRNA研究中。

當(dāng)前第46頁\共有48頁\編于星期五\18點RNAi技術(shù)1)雙鏈RNA抑制含其同源序列基因的表達(dá)，抑制基因表達(dá)的新方法2)線蟲中：直接導(dǎo)入dsRNA;脊椎動物中siRNA(21-23nt)當(dāng)前第47頁\共有48頁\編于星期五\18點發(fā)育遺傳學(xué)技術(shù)反向遺傳學(xué)技術(shù)：