十三細胞凋亡與衰老

●細胞凋亡(Apoptosis)

●細胞衰老

(cellularaging或cellsenescence)第十三章細胞凋亡與衰老當前第1頁\共有50頁\編于星期四\16點第一節(jié)細胞凋亡(Apoptosis)●細胞凋亡的概念及其生物學意義●細胞凋亡的形態(tài)學和生物化學特征●細胞凋亡的分子調(diào)控機理當前第2頁\共有50頁\編于星期四\16點一、細胞凋亡的概念及其生物學意義●概念：細胞凋亡是一個主動的由基因決定的自動結(jié)束生命的過程，由于細胞凋亡受到嚴格的遺傳機制決定的程序性控制，所以也常常被稱為細胞編程死亡（programmedcelldeath,PCD）。

●生物學意義：細胞凋亡對于多細胞生物個體發(fā)育的正常進行，自穩(wěn)平衡的保持以及抵御外界各種因素的干擾方面都起著非常關鍵的作用。

細胞凋亡的失調(diào)可導致多種疾?。旱蛲霾蛔銜е掳[瘤在內(nèi)的多種疾??；凋亡過度會導致機體免疫功能的喪失或免疫低下。

當前第3頁\共有50頁\編于星期四\16點

(1)維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定.

通過細胞凋亡可以清除機體不再需要的細胞而不引起炎癥反應。(2)確保正常的生長發(fā)育

蝌蚪尾的消失，骨髓和腸的細胞凋亡

脊椎動物的神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育，

發(fā)育過程中手和足的成形過程。

(3)積極參與機體防御如:病毒感染細胞后,細胞通過DNA片段化阻止病毒

DNA復制。當前第4頁\共有50頁\編于星期四\16點當前第5頁\共有50頁\編于星期四\16點當前第6頁\共有50頁\編于星期四\16點當前第7頁\共有50頁\編于星期四\16點二、細胞凋亡的形態(tài)學和生物化學特征●細胞凋亡的形態(tài)學特征●細胞凋亡的生化特征●誘導細胞凋亡的因子●細胞凋亡的檢測●細胞凋亡與壞死(necrosis)當前第8頁\共有50頁\編于星期四\16點1.細胞凋亡的形態(tài)學特征◆凋亡的起始：細胞表面的特化結(jié)構(gòu)如微絨毛消失，細胞間接觸的消失，但細胞膜依然完整；線粒體大體完整，但核糖體逐漸從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上脫離，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)囊腔膨脹，并逐漸與質(zhì)膜融合；染色質(zhì)固縮，形成新月形帽狀結(jié)構(gòu)等形態(tài)，沿著核膜分布。

◆凋亡小體的形成：核染色質(zhì)斷裂為大小不等的片段，與某些細胞器如線粒體一起聚集，為反折的細胞質(zhì)膜所包圍。細胞表面產(chǎn)生了許多泡狀或芽狀突起，逐漸形成單個的凋亡小體

◆凋亡小體逐漸為鄰近的細胞吞噬并消化當前第9頁\共有50頁\編于星期四\16點

a正常T細胞雜交瘤細胞b凋亡細胞(掃描電鏡)c凋亡細胞(透射電鏡)當前第10頁\共有50頁\編于星期四\16點當前第11頁\共有50頁\編于星期四\16點2.細胞凋亡的生化特征◆細胞凋亡的主要特征是形成大小為

180～200bp特征性的DNAladders ◆凋亡細胞組織轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶tTG

（tissueTransglutaminase）積累并達 到較高水平當前第12頁\共有50頁\編于星期四\16點3.誘導細胞凋亡的因子◆物理性因子，包括射線（紫外線，射線等），較溫和的溫度刺激（如熱激，冷激）等◆化學及生物因子：包括活性氧基團和分子，DNA

和蛋白質(zhì)合成的抑制劑，激素，細胞生長因子，腫瘤壞死因子（TNF），抗Fas/Apo-1/CD95抗體等當前第13頁\共有50頁\編于星期四\16點4.細胞凋亡的檢測◆形態(tài)學觀測：染色法：臺盼蘭:使死細胞染色中性紅:活細胞染色

DAPI:可觀察到細胞核的形態(tài)變化

Giemsa:可觀察到染色質(zhì)固縮、趨邊，凋亡小體的形成透射和掃描電鏡觀察◆DNA電泳：DNA片段就呈現(xiàn)出梯狀條帶◆TUNEL測定法：指末端脫氧核苷酸移換酶介導的dUTP缺口末端標記測定法。通過DNA末端轉(zhuǎn)移酶將帶標記的dNTP（多為dUTP）間接或直接接到DNA片段的3’-OH端，再通過酶聯(lián)顯色或熒光檢測定量分析結(jié)果。當前第14頁\共有50頁\編于星期四\16點◆彗星電泳法（cometassay）將單個細胞懸浮于瓊脂糖凝膠中，經(jīng)裂解處理后，再在電場中進行短時間的電泳，并用熒光染料染色，凋亡細胞中形成的DNA降解片段．在電場中泳動速度較快，使細胞核呈現(xiàn)出一種彗星式的圖案；而正常的無DNA斷裂的核在泳動時保持圓球形，這是一種快速簡便的凋亡檢測法?！袅魇郊毎治?/p>

根據(jù)凋亡細胞DNA斷裂和丟失，采用碘化丙啶使DNA產(chǎn)生激發(fā)熒光，用流式細胞儀檢出凋亡的亞二倍體細胞，同時又能觀察細胞的周期狀態(tài)。

當前第15頁\共有50頁\編于星期四\16點5.細胞凋亡與壞死(necrosis)●二者的主要區(qū)別是：細胞凋亡過程中，細胞質(zhì)膜反折，包裹斷裂的染色質(zhì)片段或細胞器，然后逐漸分離，形成眾多的凋亡小體（apoptoticbodies），凋亡小體則為鄰近的細胞所吞噬。整個過程中，細胞質(zhì)膜的整合性保持良好，死亡細胞的內(nèi)容物不會逸散到胞外環(huán)境中去，因而不引發(fā)炎癥反應。相反，在細胞壞死時，細胞質(zhì)膜發(fā)生滲漏。細胞內(nèi)容物，包括膨大和破碎的細胞器以及染色質(zhì)片段，釋放到胞外，導致炎癥反應。可能是細胞程序性死亡的另一種形式?！窦毎允桑菏桥c細胞凋亡不同的另一種程序性死亡。當前第16頁\共有50頁\編于星期四\16點壞死細胞凋亡細胞當前第17頁\共有50頁\編于星期四\16點細胞變圓,與周圍細胞脫開細胞外形不規(guī)則變化核染色質(zhì)凝聚溶酶體破壞細胞膜反折細胞膜破裂細胞分為一個個小體胞漿外溢被周圍細胞吞噬，無炎癥反應；引起周圍炎癥反應

細胞凋亡細胞壞死

ApoptosisNecrosis當前第18頁\共有50頁\編于星期四\16點三、細胞凋亡的分子調(diào)控機理●線蟲(C.elegans)凋亡研究發(fā)現(xiàn)ced3,ced4基因促進細胞凋亡，ced9基因阻止ced3/ced4的激活，抑制細胞凋亡。Ced3哺乳類同源物是ICE(Interleukin-1-convertingenzyme)，即Caspase1 ●Caspase家族與凋亡 ●Bcl-2家族、線粒體與細胞凋亡

●p53與細胞凋亡●細胞凋亡的信號轉(zhuǎn)導當前第19頁\共有50頁\編于星期四\16點1.Caspase家族與凋亡

◆Caspase家族·Caspase活性位點是半胱氨酸(Cysteine)，裂解靶蛋白位點是天冬氨酸殘基后的肽鍵，因此稱為Cysteineasparticacicspecificprotease，即Caspase◆Caspase活化◆Caspase活化途徑◆胞外信號分子誘導的細胞凋亡途徑當前第20頁\共有50頁\編于星期四\16點caspase超家族成員及其相應底物當前第21頁\共有50頁\編于星期四\16點Caspase活化caspase的活化則需在兩個亞基的連接區(qū)的天冬氨酸位點進行切割，結(jié)果產(chǎn)生了由兩個亞基組成的異二聚體，此即具有活性的酶。目前認為細胞凋亡的起始者(Caspase2，8，9，10，11)和執(zhí)行者(Caspase3，6和7)之間存在著上下游關系，即起始者活化執(zhí)行者。細胞凋亡活化因子：Apaf1、Apaf2、Apaf3。當前第22頁\共有50頁\編于星期四\16點ThecaspasecascadeinvolvedinapoptosisProcaspaseactivationbyproteolyticcleavage.Caspasecascade當前第23頁\共有50頁\編于星期四\16點Thetargetproteinsofcaspase蛋白激酶：FAK,PKC,Raf1；破壞細胞黏著細胞支架蛋白:Lamins，IF,actin,gelsilin核酸內(nèi)切酶：CA（CaspaseactivatedDnase）核內(nèi)DNA降解參與DNA修復的酶：喪失修復活性當前第24頁\共有50頁\編于星期四\16點2.ExtrinsicpathwayandIntrinsicpathwayCaspase3Caspase3Bid當前第25頁\共有50頁\編于星期四\16點非依賴Caspase途徑線粒體內(nèi)生凋亡途徑：Endo-GAIF當前第26頁\共有50頁\編于星期四\16點（1）胞外信號分子誘導的細胞凋亡途徑·凋亡信號通路當細胞接受凋亡信號分子(Fas,TNF等)后，凋亡細胞表面信號分子受體相互聚集并與細胞內(nèi)的銜接蛋白(Adaptorprotein)結(jié)合，這些銜接蛋白又募集Procaspases聚集在受體部位，Procaspase相互活化并產(chǎn)生級聯(lián)反應，使細胞凋亡·下游Caspases活化后，作用底物：裂解核纖層蛋白，導致細胞核形成凋亡小體；裂解DNase結(jié)合蛋白，使DNase釋放，降解DNA形成DNALadder;

裂解參與細胞連接或附著的骨架和其他蛋白，使凋亡細胞皺縮、脫落，便于細胞吞噬；導致膜脂PS重排，便于吞噬細胞識別并吞噬。當前第27頁\共有50頁\編于星期四\16點胞外信號分子誘導的細胞凋亡途徑當前第28頁\共有50頁\編于星期四\16點(2)IntrinsicpathwayThemitochondria-mediatedpathwayofapoptosisVarioustypesofcellularstressBcl-2family:BadorBaxtobecomeinsertedintoOMofMitReleaseofcytochromecfromI-OspaceofMit.Formamultisubunitcomplex;andCaspaseCascade,…促凋亡因子Bad/Bax當前第29頁\共有50頁\編于星期四\16點(2).Bcl-2家族、線粒體與細胞凋亡◆Bcl-2是一種原癌基因，能延長細胞的生存，而不是促進細胞的增殖，是ced-9在哺乳類中的同源物，能抑制細胞凋亡。Bcl-2家族以不同的調(diào)節(jié)方式調(diào)節(jié)細胞凋亡。

◆Bcl-2、線粒體與細胞凋亡◆Bcl-2與線粒體及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜相結(jié)合，Bcl-2蛋白的羧基末端有一穿膜的結(jié)構(gòu)域；導致細胞色素C釋放。CytC與胞質(zhì)中Apaf-1(凋亡蛋白酶活化因子)結(jié)合并活化Apaf-1，活化的Apaf-1再活化Procaspase9，最后引起細胞凋亡。當前第30頁\共有50頁\編于星期四\16點BCL-2家族成員當前第31頁\共有50頁\編于星期四\16點細胞凋亡的程序——總結(jié)當前第32頁\共有50頁\編于星期四\16點Caspase抑制劑痘病毒蛋白CrmA和桿病毒蛋白p35是天然的caspase抑制劑。CrmA能有效地抑制caspase1和8，P35caspase對大多數(shù)有較強的抑制作用。在哺乳動物中的內(nèi)源caspase抑制劑是編程性死亡抑制因子（inhibitorofapoptosis,IAP）。V－FLIP和FLIP，受體介導的細胞凋亡的抑制劑。當前第33頁\共有50頁\編于星期四\16點生死抉擇——凋亡信號系統(tǒng)當前第34頁\共有50頁\編于星期四\16點在依賴于p53蛋白的細胞凋亡中，p53基因是通過調(diào)節(jié)Bcl2和Bax基因的表達來影響細胞凋亡的.p53蛋白能特異地抑制Bcl2的表達，相反對Bax的表達則有明顯的促進作用。研究表明，p53蛋白是Bax基因的直接的轉(zhuǎn)錄活化因子,在這些細胞中，p53蛋白的積累和活動引起了細胞凋亡。線粒體凋亡信號來自轉(zhuǎn)錄因子p53.所有腫瘤均表現(xiàn)為p53突變。3.p53蛋白——線粒體凋亡途徑當前第35頁\共有50頁\編于星期四\16點第二節(jié)細胞衰老

(cellularaging或cellsenescence)●Hayflick界限(HayflickLimitation）●細胞在體內(nèi)條件下的衰老●衰老細胞結(jié)構(gòu)的變化●細胞衰老的分子機理當前第36頁\共有50頁\編于星期四\16點一、Hayflick界限(HayflickLimitation）●概念：關于細胞增殖能力和壽命是有限的觀點。細胞，至少是培養(yǎng)的二倍體細胞，不是不死的，而是有一定的壽命；它們的增殖能力不是無限的，而是有一定的界限，這就是Hayflick界限 ◆癌細胞或培養(yǎng)的細胞系是不正常細胞，其染色體數(shù)目或形態(tài) 已經(jīng)不同于原先的細胞◆細胞的增殖能力與供體年齡有關◆物種壽命與培養(yǎng)細胞壽命之間存在著一定的關系 ●二倍體細胞的衰老是由細胞本身決定的 ◆決定細胞衰老的因素在細胞內(nèi)部，而不是外部的環(huán)境 ◆是細胞核而不是細胞質(zhì)決定了細胞衰老當前第37頁\共有50頁\編于星期四\16點細胞來源人胚肺成纖維細胞中年人成纖維細胞老年人成纖維細胞可增殖代數(shù)

40-60

20

2-4不同年齡來源的人成纖維細胞的增殖代數(shù)當前第38頁\共有50頁\編于星期四\16點二、細胞在體內(nèi)條件下的衰老●在機體內(nèi)，細胞的衰老和死亡是常見的現(xiàn)象，甚至在個體發(fā)育的早期也會發(fā)生;●正常情況下終生保持分裂的細胞，其分裂能力是否隨著有機體年齡的增高而下降？它們會不會衰老？◆衰老動物體內(nèi)，細胞分裂速度顯著減慢，其原因主要是G1期明顯延長;◆衰老個體內(nèi)的環(huán)境因素影響了細胞的增殖和衰老; ◆骨髓干細胞移植實驗說明隨著年齡的增加，干細胞增殖速度也趨緩慢.當前第39頁\共有50頁\編于星期四\16點三、衰老細胞結(jié)構(gòu)的變化

●細胞核的變化：細胞核隨著細胞分裂次數(shù)的增加不斷增大細胞核的核膜內(nèi)折、染色質(zhì)固縮化?！駜?nèi)質(zhì)網(wǎng)的變化:衰老動物內(nèi)質(zhì)網(wǎng)成分彌散性地分散于核周胞質(zhì)中，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的總量似乎是減少了●線粒體的變化:細胞中線粒體的數(shù)量隨齡減少，而其體積則隨齡增大●致密體的生成：脂褐質(zhì)，血褐質(zhì)，脂色素等●膜系統(tǒng)的變化：

衰老的細胞，其膜流動性降低、韌性減小衰老細胞間間隙連接;

細胞膜內(nèi)（P面）顆粒的分布也發(fā)生變化當前第40頁\共有50頁\編于星期四\16點細胞核的變化◆體外培養(yǎng)的二倍體細胞，細胞核隨著細胞分裂次數(shù)的增加不斷增大細胞核的核膜內(nèi)折、染色質(zhì)固縮化

當前第41頁\共有50頁\編于星期四\16點四、細胞衰老的分子機理●氧化性損傷學說：代謝過程中產(chǎn)生的活性氧基團或分子（ROS---.O2，.OH，

H2O2

），引發(fā)的氧化性損傷的積累，最終導致衰老。脅迫誘導早熟性衰老?！穸肆Ｅc衰老：發(fā)現(xiàn)端粒長度確實與衰老有著密切的關系，提出細胞衰老的“有絲分裂鐘”學說（Harley,1990）。復制衰老。單細胞生物的衰老：●

rDNA與衰老:酵母染色體外rDNA

環(huán)（ERC）的積累，導致細胞衰老?！?/p>

沉默信息調(diào)節(jié)蛋白復合物（Sircomplex）與衰老：Sircomplex存在于異染色質(zhì)區(qū)，其作用在于阻斷所在位點DNA轉(zhuǎn)錄?！?/p>

SGS1基因和WRN基因與衰老：SGS1基因和WRN基因同源,編碼解旋酶;

酵母sgs1突變體壽命明顯短于野生型（平均9.5代:24.5代）;wrn突變引發(fā)早老癥.●

發(fā)育程序與衰老:●

線粒體DNA與衰老:Sen-DNA(80年代);mtDNA突變積累與細胞衰老有關.

當前第42頁\共有50頁\編于星期四\16點1.自由基理論：氧化性損傷學說最初是由Harman于1956年提出來的,該理論認為：在生物氧化過程中會產(chǎn)生一些活性氧基團或分子，它們可以導致細胞結(jié)構(gòu)和功能的改變，最終導致細胞衰老，這就是所說的自由基理論。自由基是指那些在原子核外層軌道上具有不成對電子的分子或原子基團。通常所說的自由基是指氧自由基，如O2-、OH-、H2O2等。

氧代謝中很多酶促反應都可能產(chǎn)生自由基，如黃嘌呤（次黃嘌呤）氧化為尿酸。線粒體呼吸鏈電子傳遞系統(tǒng)會引發(fā)氧自由基O2－·和羥自由基OH·。當前第43頁\共有50頁\編于星期四\16點

細胞中的自由基若不能及時除去，過多的自由基對許多細胞造成損傷：使質(zhì)膜中的不飽和脂肪酸氧化；使蛋白質(zhì)中的疏基氧化造成蛋白質(zhì)交聯(lián)，變性和酶鈍化；使糖類化合物降解；使DNA鏈斷裂、交聯(lián)，堿基羥基化和堿基切除等等。同時還能抑制蛋白質(zhì)、核酸和脂肪酸的生物合成。其中可能對磷脂的氧化和對DNA造成損傷是主要的，也是很致命的。

當前第44頁\共有50頁\編于星期四\16點細胞內(nèi)清除自由基的機制細胞內(nèi)部自身隔離:如線粒體保護性的酶:細胞內(nèi)具有多種抗氧化酶和抗氧化物質(zhì)存在，它們都是自由基反應的有效終止劑。如超氧化物歧化酶（SOD），過氧化氫酶（CAT）以及谷胱甘肽過氧化物酶（GHS－PX）?？寡趸肿尤缇S生素E、維生素C

當前第45頁\共有50頁\編于星期四\16點2.端粒與衰老1990年Harley等人用人工合成的(TTAGGG)作為探針，對胎兒、新小兒、青年人及老年人的成纖維細胞的端粒長度進行測定，發(fā)現(xiàn)端粒長度隨年齡增長下降。在體外培養(yǎng)的成纖維細胞中，端粒長度則隨著分裂次數(shù)的增加而下降。在這些研究的基礎上，提出了細胞衰老的“有絲分裂鐘”學說，該學說認為，隨著細胞的每次分裂，端粒不斷縮短；當端粒長度縮短達到一個閾值時，細胞就進入衰老。當前第46頁\共有50頁\