激發(fā)與發(fā)射光譜

激發(fā)與發(fā)射光譜第一頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期日激發(fā)光譜與發(fā)射光譜的關(guān)系a.Stokes位移激發(fā)光譜與發(fā)射光譜之間的波長差值。發(fā)射光譜的波長比激發(fā)光譜的長，振動弛豫消耗了能量。b.發(fā)射光譜的形狀與激發(fā)波長無關(guān)電子躍遷到不同激發(fā)態(tài)能級，吸收不同波長的能量(如能級圖2,1)，產(chǎn)生不同吸收帶，但均回到第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動能級再躍遷回到基態(tài)，產(chǎn)生波長一定的熒光(如‘2)。

c.

鏡像規(guī)則通常熒光發(fā)射光譜與它的吸收光譜（與激發(fā)光譜形狀類似）成鏡像對稱關(guān)系。第二頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期日吸收譜與激發(fā)譜吸收譜

化合物的吸收光強與入射光波長的關(guān)系曲線。吸收譜反映出的是物質(zhì)的基態(tài)能級與激發(fā)態(tài)能級之間所有的允許躍遷。通常狀態(tài)下的物質(zhì)的表觀顏色大部分時候取決于其吸收特性激發(fā)光譜

固定發(fā)射波長(一般將其固定于發(fā)射波段中感興趣的峰位),掃描出的化合物的發(fā)射光強(熒光/磷光)與入射光波長的關(guān)系曲線。激發(fā)光譜則反映的是基態(tài)與所有與該熒光發(fā)射有關(guān)的上能級之間的躍遷。其所呈現(xiàn)的關(guān)系比吸收譜要有選擇性，但有時候有不如吸收譜來的直接。S3S0吸收發(fā)射熒光l1l0l

0S2S4S5l4l3第三頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期日一、熒光光譜與磷光光譜熒光光譜

固定激發(fā)光波長(一般將其固定于激發(fā)波段中感興趣的峰位),物質(zhì)發(fā)射的熒光強度與發(fā)射光波長關(guān)系曲線，如右圖中曲線II。熒光本身則是由電子在兩能級間不發(fā)生自旋反轉(zhuǎn)的輻射躍遷過程中所產(chǎn)生的光。磷光光譜

固定激發(fā)光波長(一般將其固定于激發(fā)波段中感興趣的峰位),物質(zhì)發(fā)射的磷光強度與發(fā)射光波長關(guān)系曲線，如右圖中曲線III。磷光本身則是由電子在兩能級間發(fā)生自旋反轉(zhuǎn)的輻射躍遷過程中所產(chǎn)生的光。第四頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期日S2S1S0T1吸收發(fā)射熒光發(fā)射磷光系間跨越內(nèi)轉(zhuǎn)換振動弛豫能量l2l1l

3

外轉(zhuǎn)換l

2T2內(nèi)轉(zhuǎn)換振動弛豫Stokes能級圖第五頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期日0.熒光與磷光的產(chǎn)生過程由分子結(jié)構(gòu)理論，主要討論熒光及磷光的產(chǎn)生機理。1.分子能級與躍遷分子能級比原子能級復(fù)雜；在每個電子能級上，都存在振動、轉(zhuǎn)動能級；

基態(tài)(S0)→激發(fā)態(tài)(S1、S2、激發(fā)態(tài)振動能級)：吸收特定頻率的輻射；量子化；躍遷一次到位；激發(fā)態(tài)→基態(tài)：多種途徑和方式(見能級圖)；速度最快、激發(fā)態(tài)壽命最短的途徑占優(yōu)勢；第一、第二、…電子激發(fā)單重態(tài)S1、S2…

；第一、第二、…電子激發(fā)三重態(tài)T1、T2…

；第六頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期日1.電子激發(fā)態(tài)的多重度

電子激發(fā)態(tài)的多重度：M=2S+1

S為電子自旋量子數(shù)的代數(shù)和(0或1)；平行自旋比成對自旋穩(wěn)定(洪特規(guī)則)，三重態(tài)能級比相應(yīng)單重態(tài)能級低；大多數(shù)有機分子的基態(tài)處于單重態(tài)；

S0→T1禁阻躍遷；通過其他途徑進(jìn)入(見能級圖)；進(jìn)入的幾率小；

第七頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期日2.鏡像規(guī)則的解釋

基態(tài)上的各振動能級分布與第一激發(fā)態(tài)上的各振動能級分布類似；基態(tài)上的零振動能級與第一激發(fā)態(tài)的二振動能級之間的躍遷幾率最大，相反躍遷也然。

第八頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期日3.激發(fā)態(tài)→基態(tài)的能量傳遞途徑

電子處于激發(fā)態(tài)是不穩(wěn)定狀態(tài)，返回基態(tài)時，通過輻射躍遷(發(fā)光)和無輻射躍遷等方式失去能量；傳遞途徑輻射躍遷熒光延遲熒光磷光內(nèi)轉(zhuǎn)移外轉(zhuǎn)移系間跨越振動弛預(yù)無輻射躍遷激發(fā)態(tài)停留時間短、返回速度快的途徑，發(fā)生的幾率大，發(fā)光強度相對大；熒光：10-7～10-9s,第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動能級→基態(tài)；磷光：10-4～10s；第一激發(fā)三重態(tài)的最低振動能級→基態(tài)；第九頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期日4.非輻射能量傳遞過程

振動弛豫：同一電子能級內(nèi)以熱能量交換形式由高振動能級至低相鄰振動能級間的躍遷。發(fā)生振動弛豫的時間10-12s。

內(nèi)轉(zhuǎn)換：同多重度電子能級中,等能級間的無輻射能級交換。通過內(nèi)轉(zhuǎn)換和振動弛豫，高激發(fā)單重態(tài)的電子躍回第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動能級。

外轉(zhuǎn)換：激發(fā)分子與溶劑或其他分子之間產(chǎn)生相互作用而轉(zhuǎn)移能量的非輻射躍遷；外轉(zhuǎn)換使熒光或磷光減弱或“猝滅”。系間跨越：不同多重態(tài),有重疊的轉(zhuǎn)動能級間的非輻射躍遷。改變電子自旋，禁阻躍遷，通過自旋—軌道耦合進(jìn)行。第十頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期日5.輻射能量傳遞過程

熒光發(fā)射：電子由第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動能級→基態(tài)（多為S1→S0躍遷），發(fā)射波長為‘2的熒光；10-7～10-9s。由圖可見，發(fā)射熒光的能量比分子吸收的能量小，波長長；‘2>2>1；磷光發(fā)射：電子由第一激發(fā)三重態(tài)的最低振動能級→基態(tài)（T1→S0躍遷）；電子由S0進(jìn)入T1的可能過程：（S0→T1禁阻躍遷）

S0→激發(fā)→振動弛豫→內(nèi)轉(zhuǎn)移→系間跨越→振動弛豫→T1發(fā)光速度很慢：10-4～100s。光照停止后，可持續(xù)一段時間。第十一頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期日第十二頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期日200250300350400450500熒光激發(fā)光譜熒光發(fā)射光譜nm蒽的激發(fā)光譜和熒光光譜第十三頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期日二、熒光的產(chǎn)生與分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系1.分子產(chǎn)生熒光必須具備的條件（1）具有合適的結(jié)構(gòu)；（2）具有一定的熒光量子產(chǎn)率。熒光量子產(chǎn)率（）：熒光量子產(chǎn)率與激發(fā)態(tài)能量釋放各過程的速率常數(shù)有關(guān)，如外轉(zhuǎn)換過程速度快，不出現(xiàn)熒光發(fā)射；第十四頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期日2.化合物的結(jié)構(gòu)與熒光（1）躍遷類型：*→的熒光效率高，系間跨越過程的速率常數(shù)小，有利于熒光的產(chǎn)生；（2）共軛效應(yīng)：提高共軛度有利于增加熒光效率并產(chǎn)生紅移（3）剛性平面結(jié)構(gòu)：可降低分子振動，減少與溶劑的相互作用，故具有很強的熒光。如熒光素和酚酞有相似結(jié)構(gòu)，熒光素有很強的熒光，酚酞卻沒有。（4）取代基效應(yīng)：芳環(huán)上有供電基，使熒光增強。第十五頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期日第十六頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期日三、影響熒光強度的因素

影響熒光強度的外部因素1.溶劑的影響除一般溶劑效應(yīng)外，溶劑的極性、氫鍵、配位鍵的形成都將使化合物的熒光發(fā)生變化；2.溫度的影響熒光強度對溫度變化敏感，溫度增加，外轉(zhuǎn)換去活的幾率增加。3.溶液pH對酸堿化合物，溶液pH的影響較大，需要嚴(yán)格控制；第十七頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期日4.內(nèi)濾光作用和自吸現(xiàn)象

自吸現(xiàn)象：化合物的熒光發(fā)射光譜的短波長端與其吸收光譜的長波長端重疊，產(chǎn)生自吸收；如蒽化合物。內(nèi)濾光作用：溶液中含有能吸收激發(fā)光或熒光物質(zhì)發(fā)射的熒光，如色胺酸中的重鉻酸鉀；第十八頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期日5.溶液熒光的猝滅碰撞猝滅；氧的熄滅作用等。第十九頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期日紅外熒光——紅外熒光的特點及應(yīng)用第二十頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期日所內(nèi)紅外熒光領(lǐng)域的研究分布近紅外激光晶體稀土離子摻雜的激光晶體過渡族離子摻雜的激光晶體紅外熒光探針過渡金屬配合物第二十一頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期日稀土離子摻雜的激光晶體第二十二頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期日稀土離子能級簡圖第二十三頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期日荷蘭的R.T.Wegh等利用德國DESY同步輻射裝置對稀土離子VUV波段的激發(fā)譜做了細(xì)致研究，并對比理論計算對VUV譜區(qū)4f能級的預(yù)測，成功地將Dieke圖擴(kuò)展到了70000cm-1的能量范圍。他們選擇高純LiYF4作為稀土摻雜的基質(zhì)，因為在這種氟化物晶格中，有可能與稀土離子高能區(qū)的4fn能級相互干擾的4fn-15d和電荷遷移態(tài)（CTS）能級都處于盡可能高的能區(qū)，故與4fn能級易于區(qū)分開來，更便于理論與實驗上對能級的指認(rèn)研究。

擴(kuò)展Dieke圖第二十四頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期日第二十五頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期日第二十六頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期日第二十七頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期日第二十八頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期日熒光圖例第二十九頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期日Nd3+第三十頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期日Nd3+第三十一頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期日Yb3+第三十二頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期日Yb3+第三十三頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期日Er3+第三十四頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期日Er3+第三十五頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期日Pr3+第三十六頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期日Pr3+第三十七頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期日Tm3+第三十八頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期日Tm3+第三十九頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期日Ho3+第四十頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期日Eu3+第四十一頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期日Sm3+第四十二頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期日Tb3+第四十三頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期日過渡族離子摻雜的激光晶體第四十四頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期日第四十五頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期日第四十六頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期日熒光圖例第四十七頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期日相關(guān)參考第四十八頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期日過渡金屬配合物第四十九頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期日過渡金屬配合物熒光探針過渡金屬配合物的特點很多過渡族金屬與配體配合時能夠形成新的能級結(jié)構(gòu)（HOMO/LUMO），基態(tài)與這些能級的躍遷往往被歸結(jié)為MLCT或LMCT。這種新的躍遷機制，較容易導(dǎo)致量子產(chǎn)率相對于配體的顯著增強，同時可以通過改變配位中心或配體結(jié)構(gòu)在很寬的波段內(nèi)調(diào)控其發(fā)射波段，所以從幾十年前就開始研究了。第五十頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期日過渡金屬配合物熒光探針應(yīng)用參考在其在生命科學(xué)中的應(yīng)用方面位于Maryland的CFS作了諸多工作。綜述EmergingBiomedicalApplicationsofTime-ResolvedFluorescenceSpectroscopy.Lakowicz,J.R.(1994)In:TopicsinFluorescenceSpectroscopy,Vol.4:ProbeDesignandChemicalSensing(J.R.Lakowicz,Ed.),PlenumPress,1-19.RecentDevelopmentsinFluorescenceSpectroscopy(1996).Lakowicz,J.R.,Terpetschnig,E.,Szmacinski,H.,Malak,H.,Kusba,J.andGryczynski,I.,.In:AnalyticalUseofFluorescentProbesinOncology.(Kohen,E.,andHirschberg,J.G.,Eds.),PlenumPress,NewYork.pp.65-79.Long-LifetimeMetal-LigandComplexesasProbesinBiophysicsandClinicalChemistry(1997).Terpetschnig,E.,Szmacinski,H.,andLakowicz,J.R.In:MethodsinEnzymology,Vol.278.AcademicPress,pp.295-321.RecentDevelopmentsinFluorescenceSpectroscopy.Long-LivedMetal-LigandProbes,Three-PhotonExcitation,Two-ColorTwo-PhotonExcitationandOpticalControlofExcitedStatePopulation.Lakowicz,J.R.,Gryczynski,I.,andSzmacinski,H.(1998).FluorescenceMicroscopyandFluorescentProbes,Vol.2(J.Slavik,Ed.),PlenumPress,NewYork,pp.1-12.應(yīng)用進(jìn)展Long-lifetimeLipidRheniumMetal-LigandComplexforProbingMembraneDynamicsontheMicrosecondTimescale.Li,L.,Castellano,F.N.,Gryczynski,I.,andLakowicz,J.R.(1999).Chem.PhysicsLipids99:1-9.

SynthesisandCharacterizationofaSulfhydryl-ReactiveRheniumMetal-LigandComplex.Dattelbaum,J.D.,Abugo,O.O.,andLakowicz,J.R.(2000).BioconjugateChem.11:533-536.

SpectralPropertiesofFluorophoresCombiningtheBoronicAcidGroupwithElectronDonororWithdrawingGroups.ImplicationintheDevelopmentofFluorescenceProbesforSaccharides,N.DiCesareandJ.R.Lakowicz(2001).J.Phys.Chem.A.,105(28):6834-6840.

第五十一頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期日過渡金屬配合物熒光探針前景過渡金屬配合物很多能實現(xiàn)較強的紅外波段寬帶發(fā)射，可以有效避開組織體的吸收，可以穿透組織體實現(xiàn)紅外成像，克服同位素原子示蹤對人體的傷害；壽命處于us量級，可以用于較大分子的形變和轉(zhuǎn)動擴(kuò)散研究，當(dāng)然，結(jié)合其特有的發(fā)射波段也能對活體環(huán)境中的許多擴(kuò)散和轉(zhuǎn)變過程進(jìn)行研究。第五十二頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期日第五十三頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期日過渡金屬配合物圖例第五十四頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期日熒光探針細(xì)胞活性探針細(xì)胞活性和細(xì)胞毒性試劑盒活細(xì)胞探針?biāo)兰?xì)胞探針測定活細(xì)胞中巰基和谷光甘肽的探針膜熒光探針膜流動性熒光探針熒光基團(tuán)標(biāo)記的磷脂陰離子型膜探針陽離子型膜探針中性膜探針細(xì)胞器探針線粒體探針溶酶體探針內(nèi)質(zhì)問探針高爾基復(fù)合體探針位點特異性熒光探針受體特異性熒光探針細(xì)胞骨架探針研究鈣調(diào)節(jié)及活性的熒光探針核酸熒光探針第五十五頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期日熒光探針胞內(nèi)離子探針鈣離子探針胞內(nèi)pH值熒光探針其他離子探針電位敏感性探針快響應(yīng)探針慢響應(yīng)探針籠鎖化合物探針底物熒光探針核昔酸擬生物及寡核昔吱熒光探針LacZ基因表達(dá)的底物熒光探針GM基因表達(dá)的底物熒光探針Luc基因表達(dá)的底物熒光探針脫輔水母蛋白基因表達(dá)的底物熒光探針氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(cAT)的底物熒光探針HIv蛋白酶的底物熒光探針人腎素底物熒光探針第五十六頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期日稀土元素探針稀土離子也是一類核酸探針的檢測試劑。在水溶液中僅有Tb(Ⅲ)和Eu(Ⅲ)發(fā)出熒光，與DNA配合后仍保留熒光性能，可特異識別核苷酸。Tb(Ⅲ)和Eu(Ⅲ)與一些小分子配體配合，由于配體本身性質(zhì)、中心離子-配體成鍵及溶劑等因素影響，使配合物的激發(fā)態(tài)壽命達(dá)到ms級，并發(fā)出窄而強的熒光。Tb(Ⅲ)和Eu(Ⅲ)與小分子的配合物探針通過共價鍵與靶DNA共價結(jié)合后多用于實時定量熒光PCR反應(yīng)產(chǎn)物的分析及雜交測試。該類探針要求稀土配合物易于合成并且足夠穩(wěn)定，同時熒光發(fā)射強度大。Nurmi等用Tb(Ⅲ)和Eu(Ⅲ)標(biāo)記的探針進(jìn)行實時同步擴(kuò)增及前列腺特異抗原的測定，信噪比要高于傳統(tǒng)的TaqMan探針，而循環(huán)閾值則降低。第五十七頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期日量子點熒光探針量子點熒光探針是由Ⅱ-Ⅳ族和Ⅲ-Ⅴ族元素組成的半導(dǎo)體納米顆粒，將核酸連接到量子點的表面，做成探針，通過體外雜交常規(guī)熒光(FISH)分析，發(fā)現(xiàn)染色體的異常及變異，可取代一些有機熒光染料進(jìn)行生物分子檢測。研究較多的有CdSe、CdTe、ZnS等。量子點探針可以在有機溶劑中制備，但須經(jīng)過一定的化學(xué)修飾，使其表面具有一定的水溶性基團(tuán)，同時又具備一些與生物分子偶連的活性基團(tuán)，因而反應(yīng)條件苛刻，步驟復(fù)雜，成本較高。盡管在水溶液中制備的成本低，但量子點的熒光產(chǎn)率低，尺寸分布較大。目前較多采用在有機溶劑中合成。在強激光下易發(fā)生光漂白，是有機類熒光染料最普遍的缺陷。量子點探針較傳統(tǒng)的有機熒光染料具有一定的優(yōu)越性。首先，熒光光譜范圍寬，通過改變納米晶體材料和尺寸，獲得的激光誘導(dǎo)熒光光譜范圍在400nm～2μm；其次，熒光光譜范圍可調(diào)，穩(wěn)定性好，熒光壽命長，且可用單一波長的激發(fā)光源同時激發(fā)不同大小尺寸的量子點，得到不同熒光發(fā)射波長的檢測信號，相對于有機熒光染料的單一光源激發(fā)得到單一熒光發(fā)射信號，降低了實驗成本并簡化了分析步驟。1998年，Bruchez等[44]制備了CdSe-ZnS核-殼結(jié)構(gòu)的納米晶體，之后又增加了SiO2層，使其具有水溶性，同時SiO2經(jīng)過修飾后可以與生物分子結(jié)合，量子產(chǎn)率高且穩(wěn)定。Nie等將量子點的表面連接上巰基乙酸，使量子點不僅具有水溶性，同時可與