植物源農(nóng)藥殺蟲(chóng)與抑制幾丁質(zhì)酶活性的測(cè)定

植物源農(nóng)藥殺蟲(chóng)與抑制幾丁質(zhì)酶活性的測(cè)定【摘要】目的研究青蒿葉、桉樹(shù)葉、紅樹(shù)植物白骨壤葉乙醇提取物對(duì)大蠟螟蟲(chóng)的毒殺作用以及對(duì)蟲(chóng)體幾丁質(zhì)酶活性的抑制作用。方法采用室內(nèi)藥液噴蟲(chóng)法測(cè)定3種植物乙醇提取物的殺蟲(chóng)活性與抑制幾丁質(zhì)酶活性。結(jié)果青蒿、桉樹(shù)、紅樹(shù)植物白骨壤葉乙醇提取物對(duì)大蠟螟24h的校正死亡率分別為(69.00±3.87)%，(53.47±11.63)%，(18.60±6.70)%。對(duì)大蠟螟幾丁質(zhì)酶的抑制率分別為(20.33±1.42)%，(20.59±1.72)%，(13.56±1.58)%。結(jié)論青蒿葉與桉樹(shù)葉植物乙醇提取物的殺蟲(chóng)活性與抑制幾丁質(zhì)酶活性顯著高于紅樹(shù)植物白骨壤葉乙醇提取物(P0.05)。【關(guān)鍵詞】植物源農(nóng)藥;大蠟螟;殺蟲(chóng)活性;幾丁質(zhì)酶Abstrat：bjetiveTstudytheeffetsfsutherndleaves,eualyptusleavesandangrveavienniaarinaleavesethanlextratsntheinsetiidalativityandhitinaseinhibitryativityagainstGalleriaellnella.ethdsTheinsetiidalativityandhitinaseinhibitryativityfthethreeplantethanlextratseretestedfrindrntattxiitybyusingsprinklingethd.ResultsTheresultsshedthatafter24htreatent,therreteddeathratisfsuthernd,eualyptusandangrveavienniaarinaleavesethanlextratere(69.00±3.87)%,(53.47±11.63)%,(18.60±6.70)%andtheinhibitinratisfhitinaseere(20.33±1.42)%,(20.59±1.72)%,(13.56±1.58)%,respetively.nlusinTheinsetiidalativityandhitinaseinhibitryativityfsutherndandeualyptusleavesethanlextraterehigherthanangrveavienniaarinaleavesethanlextratarkedly.Keyrds：BtanialPestiides;Galleriaellnella;Insetiidalativity;hitinase21世紀(jì)全球農(nóng)業(yè)開(kāi)展的一個(gè)重要趨勢(shì)是更加注重農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量平安性,倡導(dǎo)平安優(yōu)質(zhì)綠色食品[1，2]，從天然植物中提取殺蟲(chóng)活性物質(zhì)防治農(nóng)林害蟲(chóng),已成為研究熱點(diǎn),并對(duì)現(xiàn)代農(nóng)藥研究具有重要意義。幾丁質(zhì)酶(hitinase)可以水解昆蟲(chóng)體壁和中腸中的幾丁質(zhì)，在昆蟲(chóng)變態(tài)發(fā)育過(guò)程中扮演重要角色。幾丁質(zhì)酶抑制劑通過(guò)抑制幾丁質(zhì)酶活性干擾昆蟲(chóng)正常變態(tài)發(fā)育過(guò)程而到達(dá)殺蟲(chóng)的目的。由于動(dòng)植物機(jī)體不含幾丁質(zhì)，故以幾丁質(zhì)酶作為靶標(biāo)的新型生物農(nóng)藥具有平安無(wú)害的優(yōu)點(diǎn)[3，4]。目前已挑選出近十種不同來(lái)源的幾丁質(zhì)酶抑制劑,包括糖類(lèi)與肽類(lèi)幾丁質(zhì)酶抑制劑[4]。而有關(guān)青蒿葉、桉樹(shù)葉、紅樹(shù)植物白骨壤葉來(lái)源的幾丁質(zhì)酶抑制劑未見(jiàn)報(bào)道。大蠟螟(Galleriaellnella)屬螟蛾科蠟螟亞科,是養(yǎng)蜂業(yè)的主要害蟲(chóng)。由于大蠟螟易于人工飼養(yǎng)，在農(nóng)藥學(xué)上可作為生測(cè)試蟲(chóng)[5]。本研究以大蠟螟為測(cè)試對(duì)象，研究青蒿葉、桉樹(shù)、紅樹(shù)植物白骨壤葉乙醇提取物對(duì)它的毒殺作用以及對(duì)蟲(chóng)體幾丁質(zhì)酶活性的抑制作用，為開(kāi)發(fā)新型平安植物源農(nóng)藥提供參考。1材料大蠟螟蟲(chóng)(廣西甘蔗研究所提供)。青蒿葉、桉樹(shù)葉、紅樹(shù)植物白骨壤葉采自廣西藥用植物園、廣西防城港等地。2方法2.1植物源農(nóng)藥提取物的制備稱(chēng)取10g青蒿葉、桉樹(shù)葉、紅樹(shù)植物白骨壤葉枯燥粉末，參加20l50%乙醇，超聲萃取20in，過(guò)濾，濾液減壓蒸餾，搜集膏狀物并稱(chēng)重，用95%的乙醇溶解，配制成濃度為100g/l的植物提取物母液備用。2.2殺蟲(chóng)實(shí)驗(yàn)選擇蟲(chóng)齡與蟲(chóng)體大小根本一致的試蟲(chóng)20只，置于墊有中性濾紙的90保濕玻璃培養(yǎng)皿中,將植物提取物母液稀釋為1.5%的濃度(內(nèi)含1%的吐溫80)，作為供試藥液。采用小型噴霧器噴霧法對(duì)準(zhǔn)蟲(chóng)噴霧,每皿噴藥液約1l。對(duì)照組用95%的乙醇代替供試藥液，將培養(yǎng)皿放置于26℃的人工氣候培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h(晝夜比16∶8)。24h后檢查死蟲(chóng)數(shù)，計(jì)算死亡率與校正死亡率。死亡率(%)=(死亡的蟲(chóng)子/蟲(chóng)子總數(shù))×100%，校正死亡率(%)=[(死亡率-對(duì)照組死亡率)/(1-對(duì)照組死亡率)]×100%。測(cè)定活蟲(chóng)體幾丁質(zhì)酶活力，計(jì)算酶活抑制率。每處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。2.3蟲(chóng)體蛋白質(zhì)含量的測(cè)定考馬斯亮藍(lán)G-250法測(cè)定大蠟螟蟲(chóng)勻漿液中蛋白質(zhì)含量[6]。2.4N-乙酰氨基葡萄糖復(fù)原糖的測(cè)定3，5-二硝基水楊酸(DNS)比色法測(cè)定[6]。2.5幾丁質(zhì)酶液的提取與活性測(cè)定取1g蟲(chóng)體，冰浴研磨勻漿,制成10%勻漿液，離心(3500r/in)20in取上清用于酶活的測(cè)定。取0.5l上清液參加ll磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液(pH6.6)，0.5l1.5%膠體幾丁質(zhì)，于37℃水浴振蕩酶反響30in，立即沸水浴10in終止酶反響后離心(4000r/in)5in后取上清液0.5l，采用DNS法測(cè)定酶反響過(guò)程中產(chǎn)生的N-乙酰氨基葡萄糖復(fù)原糖的量。酶活力單位(U)以在上述反響條件下,每1in產(chǎn)生1μlN-乙酰氨基葡萄糖復(fù)原糖所需的酶量計(jì)算。酶比活力以單位蟲(chóng)體蛋白質(zhì)的酶活力表示。3結(jié)果與分析3.1植物源農(nóng)藥提取物的殺蟲(chóng)活性見(jiàn)表1。由表1可知，3種植物源農(nóng)藥提取物均表現(xiàn)出一定的殺蟲(chóng)活性。其中青蒿葉與桉樹(shù)葉乙醇提取物對(duì)大蠟螟的校正死亡率較高，兩者之間無(wú)顯著性差異(P0.05)。校正死亡率最低的為紅樹(shù)植物白骨壤葉乙醇提取物，與青蒿葉、桉樹(shù)葉乙醇提取物相比差異到達(dá)顯著程度(P0.05)。表1植物源農(nóng)藥提取物的殺蟲(chóng)活性表中同列數(shù)據(jù)不同小寫(xiě)字母表示在P0.05程度上有顯著差異3.2大蠟螟幾丁質(zhì)酶活性的測(cè)定根據(jù)牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線(Y=0.04131X–0.03356，R2=0.9992)求出大蠟螟蟲(chóng)勻漿液中蛋白質(zhì)含量為33.7ug/g鮮重。N-乙酰氨基葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=1.264X-0.0193，R2=0.9933，K=1.264。通過(guò)測(cè)定D540并計(jì)算大蠟螟單位蟲(chóng)體蛋白的幾丁質(zhì)酶比活力。見(jiàn)表2。表2大蠟螟幾丁質(zhì)酶活性測(cè)定轉(zhuǎn)貼于論文聯(lián)盟.ll.幾丁質(zhì)酶在昆蟲(chóng)生長(zhǎng)的每一階段都必須維持在一定的程度,過(guò)量或缺乏都將對(duì)昆蟲(chóng)造成致命的影響。通過(guò)調(diào)節(jié)昆蟲(chóng)表皮和圍食膜中幾丁質(zhì)酶的活性是很好的害蟲(chóng)防治策略。本研究中測(cè)得正常大蠟螟幾丁質(zhì)酶平均比活力為99.2U/g蛋白。這一測(cè)定值代表了沒(méi)有經(jīng)過(guò)藥液處理的大蠟螟蟲(chóng)體幾丁質(zhì)酶活總體程度。3.3植物源農(nóng)藥提取物對(duì)大蠟螟幾丁質(zhì)酶活性的抑制由表3可知，3種植物源農(nóng)藥乙醇提取物對(duì)大蠟螟幾丁質(zhì)酶活力均表現(xiàn)出不同程度的抑制作用。其中青蒿葉與桉樹(shù)葉乙醇提取物對(duì)大蠟螟幾丁質(zhì)酶活性抑制作用最強(qiáng)，兩者之間無(wú)顯著性差異(P0.05)。而對(duì)幾丁質(zhì)酶活性抑制作用最弱的為紅樹(shù)植物白骨壤葉乙醇提取物，與青蒿葉、桉樹(shù)葉乙醇提取物相比差異到達(dá)顯著程度(P0.05)。表3不同植物提取物對(duì)大蠟螟幾丁質(zhì)酶的抑制作用表中同列數(shù)據(jù)不同小寫(xiě)字母表示在P0.05程度上有顯著差異以上3種植物源農(nóng)藥乙醇提取物對(duì)大蠟螟幾丁質(zhì)酶活力的抑制作用類(lèi)型與機(jī)理以及對(duì)大蠟螟幾丁質(zhì)代謝系統(tǒng)的影響等方面還需深化研究。4討論青蒿別名黃花蒿、臭蒿,一年生草本植物，為菊科篙屬植物，研究報(bào)道證明青蒿除具有抗菌活性外,還具有殺蟲(chóng)活性。姚安慶等[7]研究了黃花篙的乙醇、氟仿、石油浸提物對(duì)菜粉蝶幼蟲(chóng)的拒食作用、觸殺作用，結(jié)果說(shuō)明黃花篙乙醇浸提物的活性較好，48h拒食率為72.11%。aggi等[8]報(bào)道黃花篙地上局部的乙醇提取物對(duì)南部灰翅夜蛾的取食抑制率為87%。李云壽等[9]報(bào)道青蒿乙醇提取物對(duì)菜青蟲(chóng)5齡幼蟲(chóng)24h校正死亡率為63.33%。本研究中青蒿葉乙醇提取物對(duì)大蠟螟24h的校正死亡率為(69.0±3.87)%。說(shuō)明青蒿葉乙醇提取物有較好的殺螟蟲(chóng)活性。桉樹(shù)植物系屬桃金娘科喬木，是廣西引種最廣泛的樹(shù)種之一。有研究發(fā)現(xiàn)桉樹(shù)葉的水提劑、乙醇提取物對(duì)釘螺具有較好的殺滅作用[10]。本研究中桉樹(shù)葉乙醇提取物對(duì)大蠟螟24h的校正死亡率為(53.47±11.63)%，具有較好的殺螟活性。紅樹(shù)植物是生長(zhǎng)在熱帶和亞熱帶海岸潮間帶的一種特殊的常綠植物群落，由于其所處的特殊生態(tài)環(huán)境，會(huì)產(chǎn)生許多其他陸生植物所不具備的特殊次生物質(zhì)，鄧業(yè)成等[11]報(bào)道采用葉片殘毒法測(cè)定了16種紅樹(shù)植物甲醇提取物對(duì)柑橘紅蜘蛛的殺螨活性，其中白骨壤枝葉甲醇提取物對(duì)柑橘紅蜘蛛卵的校正死亡率達(dá)(83.29±2.73)%。而本研究中白骨壤葉乙醇提取物對(duì)螟蟲(chóng)的校正死亡率為(18.6±6.70)%，殺螟蟲(chóng)活性較低。這可能與所采用的溶劑不同、試蟲(chóng)不同等因素有關(guān)。青蒿葉、桉樹(shù)葉、紅樹(shù)植物白骨壤葉3種植物源農(nóng)藥乙醇提取物對(duì)大蠟螟的殺蟲(chóng)活性與抑制幾丁質(zhì)酶活性相一致。說(shuō)明幾丁質(zhì)酶可能是以上3種植物源農(nóng)藥的作用靶標(biāo)酶。青蒿葉與桉樹(shù)葉乙醇提取物具有較高的殺蟲(chóng)活性與抑制幾丁質(zhì)酶活性,可作為以幾丁質(zhì)酶為新靶點(diǎn)的生物農(nóng)藥。由于以幾丁質(zhì)酶作為靶標(biāo)的新型生物農(nóng)藥具有對(duì)人、畜無(wú)害的優(yōu)點(diǎn)，因此圍繞幾丁質(zhì)酶設(shè)計(jì)開(kāi)發(fā)新型農(nóng)藥品種,其運(yùn)用前景極為廣闊。而關(guān)于這幾種植物殺蟲(chóng)活性成分的活性跟蹤、提娶別離和挑選以及高活性的殺蟲(chóng)植物的直接利用方法,還有待于進(jìn)一步的研究?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】[1]錢(qián)允輝,張雪峰，王志強(qiáng).常用蔬菜農(nóng)藥殘留速測(cè)方法的應(yīng)用效果研究[J].中國(guó)測(cè)試技術(shù),2022,32(3):122.[2]陳志杰,張淑蓮,梁銀麗,等.設(shè)施蔬菜病蟲(chóng)綠色防治技術(shù)初探[J].西北植物學(xué)報(bào),2022,23(8):1452.[3]張福麗,王志英,王占斌,等.昆蟲(chóng)幾丁質(zhì)酶及其在植物害蟲(chóng)防治中的應(yīng)用前景[J].農(nóng)藥市場(chǎng)信息，2022，22(20):1.[4]謝潔，周澤揚(yáng).幾丁質(zhì)酶抑制化合物研究進(jìn)展[J].中國(guó)抗生素雜志，2022，31(12)：705.[5]VeyA,QuitJ,azetI,etal.TxiityandpathlgyfrudebrthfiltrateprduedbyHirsutellathpsniivar.thpsniiinshakeulture[J].JInvertebrPathl,1993,61(2):131.[6]趙亞華,高向陽(yáng).生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)教程[].廣州：華南理工大學(xué)出版社,2022：15.[7]姚安慶，梁德華.樟樹(shù)和黃花篙浸提物對(duì)菜粉蝶幼蟲(chóng)的生物活性[J].現(xiàn)代農(nóng)藥，2022，3(2):28，39.[8]aggi.E.,angeaudA.,arpinella..,etal.LabratryevaluatinfArteisiaannuaL.extratandarteisininativityagainstEpilah