病毒學(xué)實驗技術(shù)

病毒學(xué)實驗技術(shù)1第一頁，共一百七十四頁，編輯于2023年，星期一virusesareusually

detectedbyindirectmethods(i)multiplicationinasuitableculturesystemanddetectionofthevirusbytheeffectsitcauses;

(ii)serology,whichmakesuseoftheinteractionbetweenavirusandantibodydirectedspecificallyagainstit;

(iii)detectionofviralnucleicacid.2第二頁，共一百七十四頁，編輯于2023年，星期一SamplingInjectioninanimalmodels(diseases),oreggsViruscultureinmosquitoormammaliancellsDetectionofvirusreplicationCytopathiceffect(syncitia,inclusionbodies,cellrounding,apoptosis,microarrays)HemadsorptionAntigendetection(immunocapture,Dot-blot,Westernblot,Immunofluorescence, Immunohistochemistry,ELISAElectronmicroscopyGenomedetection(Electrophoresis,insituormembraneHybridization,RT-PCR,` multiplexorrealtimePCR,NASBA,HybridRNA-DNA,microarrays,Sequencing, substractionsequencing,randomamplification-cloning-highthroughput sequencing-blast)Reportergeneingeneticallyengineeredcelllines3第三頁，共一百七十四頁，編輯于2023年，星期一Specimens:Blood:serum,plasma,PBMCSwabs:Tracheal,nasopharyngeal,cutaneous…Fluids:CSF,urine,bronchoalveolarlavage, trachealaspirate,tears…Tissues:Organs,skin…4第四頁，共一百七十四頁，編輯于2023年，星期一SamplingInjectioninanimalmodels(diseases),oreggsViruscultureinmosquitoormammaliancellsDetectionofvirusreplicationCytopathiceffect(syncitia,inclusionbodies,cellrounding,apoptosis,microarrays)HemadsorptionAntigendetection(immunocapture,Dot-blot,Westernblot,Immunofluorescence, Immunohistochemistry,ELISAElectronmicroscopyGenomedetection(Electrophoresis,insituormembraneHybridization,RT-PCR,` multiplexorrealtimePCR,NASBA,HybridRNA-DNA,microarrays,Sequencing, substractionsequencing,randomamplification-cloning-highthroughput sequencing-blast)Reportergeneingeneticallyengineeredcelllines5第五頁，共一百七十四頁，編輯于2023年，星期一Choosingaculturesystemforanimalviruses6第六頁，共一百七十四頁，編輯于2023年，星期一病毒的培養(yǎng)動物（Animals）雞胚（Embryonatedeggs）組織培養(yǎng)（Organandtissueculture）

Organculture

胚胎Embryoculture Cellculture:原代細胞傳代細胞 雙倍體細胞7第七頁，共一百七十四頁，編輯于2023年，星期一trachealorganculturesSectionsthroughtrachealorgancultures:(a)uninfected;(b)infectedwitharhinovirusfor36hours.Notethedisorganizationoftheciliatedcells(uppermostlayer)afterinfection.(CourtesyofBertilHoorn.)8第八頁，共一百七十四頁，編輯于2023年，星期一GrowingvirusesinthelabNormalcellsVirusinfectedcellsEmbryonatedegginoculation9第九頁，共一百七十四頁，編輯于2023年，星期一Cellculture10第十頁，共一百七十四頁，編輯于2023年，星期一AnimalvirusplaquesinacellculturePlaquesformedbyporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusinacellcultureFromLeeandYoo(2005)JournalofGeneralVirology,86,3091.11第十一頁，共一百七十四頁，編輯于2023年，星期一PhageplaquesinalawnofbacterialcellsPlaquesformedbyphageMS2inEscherichiacolicellsCourtesyofKathrynNewton.12第十二頁，共一百七十四頁，編輯于2023年，星期一Plaquesformedbyaphageinabacteriallawn.Thecontrolplateontheleftwasinoculatedwithonlythebacterialhost.Theplateontherightwasinoculatedwithphageandbacterialhost.13第十三頁，共一百七十四頁，編輯于2023年，星期一14QuantificationofvirusesPlaqueassaytechniqueforquantificationofbacterialviruses.第十四頁，共一百七十四頁，編輯于2023年，星期一PlaquesformedbyWestNilevirusinacellmonolayerBothflaskswereinoculatedwithvirus.PlaqueformationintheflaskontherighthasbeeninhibitedbyWestNilevirus-specificantibody.CourtesyofDr.ElieenOstlund,NationalVeterinaryServicesLaboratories,USDepartmentofAgriculture.Acellmonolayerisinoculatedwithvirusandoverlaidwithagarose.15

第十五頁，共一百七十四頁，編輯于2023年，星期一Plaquesofviruses(a)PlaquesofabacteriophageonalawnofEscherichiacoli.(c)Plaquesofinfluenzavirusonamonolayercultureofchickembryofibroblastcells.(b)LocallesionsonaleafofNicotianacausedbytobaccomosaicvirus16第十六頁，共一百七十四頁，編輯于2023年，星期一17Quantificationofanimalviruses第十七頁，共一百七十四頁，編輯于2023年，星期一18EfficiencyofPlatingPlaqueassayhaslowefficiency:Withbacteriophages:>50%Withanimalvirues:0.1-1%Therefore,toquantifyvirus,itisaccuratetoexpresstheconcentration(calledtiter)ofthevirussuspensionnotastheabsolutenumberofvirionunits,butasthenumberofplaque-formingunits.第十八頁，共一百七十四頁，編輯于2023年，星期一19PrinciplesofvirusinfectionMultiplicityofinfection(defectiveparticles)TimeandtemperatureofINCUBATIONSubpassagesCytopathiceffect(roundcells,lysis,fusion,inclusionbodiesinnucleus orcytoplasm)pHofculturemediumVirusrecoveryViruscongelationVirustitration第十九頁，共一百七十四頁，編輯于2023年，星期一plaqueassaySerial10-folddilutionsofHSVtodeterminethetiterofvirusinastocksolution.20第二十頁，共一百七十四頁，編輯于2023年，星期一Aplaquereductionneutralizationtestshowingtheabilityofatestantibodytoreducetheinfectivityofthevirus(forconvenienceofillustration,10PFUareshown,althoughalargerinoculumisusuallyemployed).The50%endpointiscalculatedasthedilutionofantibodythatwouldreducetheplaquecountfromthecontrollevelof10to5PFU.Inthisexampletheendpointis1/3750.plaquereductionneutralizationtest21第二十一頁，共一百七十四頁，編輯于2023年，星期一Outcomesofvirusinfectionofahost22第二十二頁，共一百七十四頁，編輯于2023年，星期一23SitesofvirusmorphogenesisNucleusCytoplasmRERGolgiMembraneIncorporationofnucleicacidmaterialPost-assemblymodificationsandvirusreleaseFacilitationofreleaseandpreventiontoreinfection(downregulationofreceptors)第二十三頁，共一百七十四頁，編輯于2023年，星期一CytopathiceffectscausedbyreplicationofpoliovirusandherpessimplexvirusinculturesofVero(monkeykidney)cells.(a)UninfectedVerocells.(b)Infectedwithpoliovirus.(c),(d)Infectedwithherpessimplexvirus.(a),(b)and(d)wereviewedat×400magnification;(c)wasviewedat×100magnification.Thecellswerestainedwithhaematoxylinandeosin.24第二十四頁，共一百七十四頁，編輯于2023年，星期一Herpesvirus CMV RSVCytopathiceffectoncelllines25第二十五頁，共一百七十四頁，編輯于2023年，星期一Purkinjecell-NegribodiesJacksonetal.(NEJM1996)26第二十六頁，共一百七十四頁，編輯于2023年，星期一FusionactivityofNipahvirusinVerocells27第二十七頁，共一百七十四頁，編輯于2023年，星期一AB2000pb1000pb500pb300pbMarqueurdePMMock17DAsibiMI0.1MI117DAsibi150pbYFV17DinducesapoptosisinhepatomaHepG2cells2dayspost-infectionYFV17DinducesapoptotisLefeuvreetal.,200628第二十八頁，共一百七十四頁，編輯于2023年，星期一Hippocampus(CA1)CerebralCortexRabiesvirusinmice29第二十九頁，共一百七十四頁，編輯于2023年，星期一30第三十頁，共一百七十四頁，編輯于2023年，星期一CPEcausedbyaninfluenzaAvirusandhumanrespiratorysyncytialvirus(HRSV)inconfluentcellmonolayers(a)(b)31第三十一頁，共一百七十四頁，編輯于2023年，星期一HSV-inducedchangesinthepropertiesofactinmicrofilamentsofaculturedmonkeyfibroblastUninfectedcellsHSVinfectedcellsThecellwasstainedwithafluorescentdyethatreactswithactinfiberssothattheycanbevisualizedinultravioletlight.Theleftpanelshowsparallelarrangementofthemicrofibrilsintheuninfectedcell,whileHSVinfection(rightpanel)resultsindisassociationofthefibrilsanddiffusionoftheactinthroughoutthecytoplasm.Atthesametime,thecelllosesitsspindle-shapedmorphologyandbecomesrounded.ThearrowsindicatejunctionsbetweencellsthatarealsorichinactinfibrilsandarenotdisruptedbyHSVinfectionatthistime32第三十二頁，共一百七十四頁，編輯于2023年，星期一常用的細胞培養(yǎng)33細胞病變(Cytopathiceffect,CPE)包涵體（InclusionBodies）第三十三頁，共一百七十四頁，編輯于2023年，星期一34檢測病毒正常細胞病變細胞

第三十四頁，共一百七十四頁，編輯于2023年，星期一狂犬病毒包涵體（Negribody）35第三十五頁，共一百七十四頁，編輯于2023年，星期一巨細胞病毒包涵體36第三十六頁，共一百七十四頁，編輯于2023年，星期一one-stepgrowthcurveofbacteriophageDuringtheeclipsephase(1),theinfectivityofthecell-associated,infectingvirusislostasituncoats;duringthematurationphase(2)infectiousvirusisassembledinsidecells(cell-associatedvirus),butnotyetreleased;andthelatentphase(3)measurestheperiodbeforeinfectiousvirusisreleasedfromcellsintothemedium.Totalvirusisthesumofcell-associatedvirus+releasedvirus.Cell-associatedvirusdecreasesascellsarelysed.Thisclassicexperimentshowsthatphagesdevelopintracellularly.37第三十七頁，共一百七十四頁，編輯于2023年，星期一38第三十八頁，共一百七十四頁，編輯于2023年，星期一39

第三十九頁，共一百七十四頁，編輯于2023年，星期一ExampleofaTCID50assay40第四十頁，共一百七十四頁，編輯于2023年，星期一41第四十一頁，共一百七十四頁，編輯于2023年，星期一Aliquotsoftheindicatedstockvirusdilutionswerepipettedintotheculturesandtheplatewasincubatedfor48hoursandthendevelopedwithastainthatindicatesblackforvirus-infectedcells.Anywellthatreceivedatleast1PFUofvirusstainedblack(twoseparateexperimentsareshown).Thepercentageofpositive(infected)wellsisshownateachdilution.Quantal(endpointdilution)assayofHSVintissueculturewells.42第四十二頁，共一百七十四頁，編輯于2023年，星期一Inthegraph,onecanestimatethatadilutionatwhich50%ofthewellswouldbeinfectedisabout4×103;therefore,theTCID50was4×103intheoriginalsample.MoreaccuratemeasuresoftheID50ofavirusstockcanbeobtainedbyusingstatisticalmethodssuchasthemethodofReedandMuench,whichisdescribedinavarietyofbasicstatisticaltexts.AlthoughID50isameasureofdilution,anID50unitisdirectlyrelatedtoPFU;1ID50unitmeasuresadilutionrequiredtoensurethat50%ofthealiquotsinthatdilutionhaveinfectiousvirusinthem.Thiswillonlyoccurifthereare0.7PFU(average)peraliquot,or7PFUsin10mlintheaboveexample.43第四十三頁，共一百七十四頁，編輯于2023年，星期一44第四十四頁，共一百七十四頁，編輯于2023年，星期一45第四十五頁，共一百七十四頁，編輯于2023年，星期一病毒數(shù)量和感染性測定1、蝕斑試驗2、ID50

或TCID50

病毒感染雞胚、動物或細胞后，引起50%發(fā)生死亡或病變的最小量。

病毒感染單層細胞后，產(chǎn)生的局限性病灶，稱蝕斑，蝕斑是由一個感染性病毒體復(fù)制形成的，稱蝕斑形成單位，病毒懸液中的感染性病毒量以每毫升的蝕斑形成單位PFU來表示。46第四十六頁，共一百七十四頁，編輯于2023年，星期一neutralizationtestVirusAlosesitsinfectivityaftercombiningwithA-specificantibody(itisneutralized).A-specificantibodydoesnotbindtovirusB,soinfectivityofvirusBisunaffected.Thecompletetestrequiresthereciprocalreactions.47第四十七頁，共一百七十四頁，編輯于2023年，星期一HemagglutinationtitrationHereaninfluenzavirusisseriallydilutedfromlefttorightinwellsinaplasticplate.Redbloodcells(RBCs)arethenaddedto0.5%v/vandmixedwitheachdilutionofvirus.Wherethereislittleornovirus,RBCssettletoabutton(from1/128)indistinguishablefromRBCstowhichnoviruswasadded(row3).Wheresufficientvirusispresent(upto1/64),cellsagglutinateandsettleinadiffusepattern.(PhotographbyAndyCarver.)48第四十八頁，共一百七十四頁，編輯于2023年，星期一Assayofinfluenzavirusbyhemagglutination49第四十九頁，共一百七十四頁，編輯于2023年，星期一hemagglutination–inhibitiontestInthehemagglutination–inhibitiontest,antibodyisdilutedfromlefttoright.Fourhemagglutinationunits(HAUs)ofaninfluenzavirusareaddedtoeachwell.Theantibody–virusreactiongoestocompletionin1hourat20°C.Redbloodcellsarethenaddedtodetectvirusthathasnotboundantibody.Inthistest,hemagglutinationisinhibiteduptoanantibodydilutionof1/3200.(PhotographbyAndyCarver.)50第五十頁，共一百七十四頁，編輯于2023年，星期一FluorescentantibodystainingAnantibody

covalentlyboundtoafluorescentdyehasbeenusedto

detectanantigenpresentmainlyinthenucleus(arrows)ofinfluenzavirus-infectedcells.51第五十一頁，共一百七十四頁，編輯于2023年，星期一(A)Nonvirusinfected,methanol-fixedwholeMRC-5cellsimmunofluorescence-labeledfortubulinfibers.Originalmagnification×25.

(B)Permeabilized,HSV-1-infectedwholeMRC-5cellsimmunofluorescence-labeledforgCsituatedincytoplasmicvesicles,inaGolgi-likeregion(arrow)closetothenucleusandincellularadhesionareas(arrowhead).Originalmagnification×25.52第五十二頁，共一百七十四頁，編輯于2023年，星期一IdentificationofanunknownvirusbyELISAwith

aspecificantiserum.Theunknownviruswouldbeusedin

parallelwithacontrolviruspreparationthatisknownto

reactwiththeantibody.Theunknownvirusispositively

identifiedwhentheantibodyreactionisidenticaltothatusing

thecontrolvirus.53第五十三頁，共一百七十四頁，編輯于2023年，星期一54第五十四頁，共一百七十四頁，編輯于2023年，星期一55中國病毒學(xué)自由學(xué)術(shù)論壇第五十五頁，共一百七十四頁，編輯于2023年，星期一Detectionofhumanpapillomavirus(HPV)16E6/E7mRNAsbyRT-PCR.Atypicalsquamouscellsofundeterminedsignificance(lane1),cervicalcancers(lanes2and5),high-gradesquamousintraepitheliallesion(lane3),low-gradesquamousintraepitheliallesion(lane4),andnormalcervicaltissue(lane6).56第五十六頁，共一百七十四頁，編輯于2023年，星期一Detectionofvirusreplicationincelllines57第五十七頁，共一百七十四頁，編輯于2023年，星期一Antigendetectiontests:TypeAreactiveEnzymeImmunoassaykitsAonly(DirectigenFluA)A+B(doesnotdifferentiate)(e.g.QuickVueInfluenzatest)DifferentiatesAfromB(DirectigenFluA+B;QuickVueInfluenzaA+Betc.)

58第五十八頁，共一百七十四頁，編輯于2023年，星期一ImmunedetectionofsolubleNS1protein59第五十九頁，共一百七十四頁，編輯于2023年，星期一DNAMicroarrayTechniqueforDetectionandIdentificationofVirusesPrincipleofthemicroarrayassayforvirusdetectionandidentification.60第六十頁，共一百七十四頁，編輯于2023年，星期一61第六十一頁，共一百七十四頁，編輯于2023年，星期一Hantavirusmicroarrayconstructedwith500-nucleotidefragmentprobes.

CloselyrelatedstrainsofPuumalaviruscouldbeidentifiedanddistinguished.62第六十二頁，共一百七十四頁，編輯于2023年，星期一Theresponseofperipheralbloodmononuclearcellsinmonkeysinfectedwithvariolavirus.Usingmicroarraytoidentifytheexpressionofalargenumberofhostgenesthatparticipateintheinnateimmuneresponsetothisacuteinfection.Microarraystoidentifygenesthatareup-ordown-regulatedandtheapplicationofbioinformaticstoidentifypatternsofgeneexpression63第六十三頁，共一百七十四頁，編輯于2023年，星期一ElectronmicroscopyRabiesvirusParamyxovirus64第六十四頁，共一百七十四頁，編輯于2023年，星期一Electronmicrographoftherotavirus.65第六十五頁，共一百七十四頁，編輯于2023年，星期一66TransmissionelectronmicrographofurinesedimentfromthesamepatientasinFigure4-73,showingintranuclearicosahedralviralcapsids.(A,×15,500;B,×39,000).(ElectronphotomicrographscourtesyofJulieWen.)中國病毒學(xué)自由學(xué)術(shù)論壇第六十六頁，共一百七十四頁，編輯于2023年，星期一2010002468110100100010.000#ofdeathspfu/animal(i.p.)LD50=102,32DaysInfectionofgoldenhamsterswithNipahvirus67第六十七頁，共一百七十四頁，編輯于2023年，星期一HowtopreventcarryovercontaminationinRT-PCR(falsepositive)?UseofdUTPandUracil-N-glycosylaseUseoffuocoumarin(psoralens)andUVTipwithfilters,pluggedtipsCleaningofthemicropipettesUVirradiationafterwork

UsesmallworkingaliquotsCleaningofequipmentandlaboratorysurfaceswith10%bleachPhysicalseparationofthelaboratories 1.Treatmentofthespecimen(NAextraction) 2.Preparationofthereactiontubes 3.RT-PCRreaction 4.TubeopeninganddetectionofamplificationproductsChangelabcoat(overshoes)inthedetectionlab.68第六十八頁，共一百七十四頁，編輯于2023年，星期一TranscriptionassaySpecificPCRMultiplexPCRQuantitative(competitive)PCRReal-timePCR-Fluorogenic5’exonucleaseassay(Taqman):theprobe containsafluorescentdyeatits5’(reporter),and3’ (quencher)extremities.-Hybridizationprobeassay:fluorescenceresonanceenergy transferusingtwooligoslabeledat5’(accepter)or3’ (donor)ends-SYBRgreenassay(discriminationbasedonmeltingpoint)Useofmultiplefluorescentdyes(Cy3,Cy5,Texasred…)69第六十九頁，共一百七十四頁，編輯于2023年，星期一DetectionofamplifiedproductsAgarosegelandBetAgarosegelandhybridizationusinglabeledprobes5’-labeledprimer(P32,Biotine…)BranchedchainDNAassayHybridcaptureassay70第七十頁，共一百七十四頁，編輯于2023年，星期一One-tubemultiplexPCR71第七十一頁，共一百七十四頁，編輯于2023年，星期一BranchedchainDNAassay72第七十二頁，共一百七十四頁，編輯于2023年，星期一Hybridcaptureassay73第七十三頁，共一百七十四頁，編輯于2023年，星期一DetectionofviralmaterialRapiddetectionidentificationandquantificationofviralRNAbyrealtimePCR.

Inserum,PBMCandotherbiologicalsamples.Samesensitivitythanvirusquantification,butlowerthannested-PCR..1,2.105pfuperreaction1,2

pfuperreaction0,12

pfuperreactionGroup-specificprimersforRTandamplification.Type-specificitydeterminedbyhighlyspecifichybridizationorspecificmeltingtemperature.74第七十四頁，共一百七十四頁，編輯于2023年，星期一75第七十五頁，共一百七十四頁，編輯于2023年，星期一IdentificationofnewvirusesRepresentationaldifferenceanalysis(RDA) -Substractivehybridationbydifferenceenrichmentand identificationofthesequencesfromthegenomesof unknownvirus(N.A.Lisitsyn,TIG,1995)Systematicscreening -TreatmentofthesamplewithDNaseI -Genomeextraction -Randomprimingwithtagedexanucleotide -Klenowdigestion -AmplificationTaqpo -EcoRVdigestion -Cloning -Highthroughputsequencing76第七十六頁，共一百七十四頁，編輯于2023年，星期一SerologyDetectionofantibodies>ELISA(colorimetric,radiometric,fluorescent…).IgM,IgG,IgA>Indirecthistology(immunofluorescenceorimmunohistochemistry)>Hemagglutinationinhibition>Complementfixation>Immunochromatography>Neutralizingantibodies(PRNT,DCID50,useofpp)>WesternblotDIAGNOSTIC(cont.)CellactivationprofileTranscriptomeorproteomeofinfectedcells77第七十七頁，共一百七十四頁，編輯于2023年，星期一Viralisolation.

OnVeroE6,inoculationwithbiologicalsamples.Methodofreference,buttedious(whenimmunodetection),andrequiresaBSL-4containmentSerumofapatientinfectedwithEbo-Z(Immunodetection)-1 -2 -3-4 -5 -6-1 -2 -3-4 -5 -6VirustitrationonVeroE6cells(dilutions10-1à10-6)UrineofahamsterinfectedwithNipahvirus(methylenebluestaining)Detectionofviralmaterial(1)78第七十八頁，共一百七十四頁，編輯于2023年，星期一InfectionAnti-H1AbAnti-H5AbHIV-H5ppXDetectionHighthroughputspecificneutralizationtestLuciferasegeneInfectionDetection79第七十九頁，共一百七十四頁，編輯于2023年，星期一病毒感染的檢查方法與防治原則

病毒感染的檢查方法1、 本采集與送檢：用于分離培養(yǎng)的標本：采取采取急性期、防止病毒滅活血清學(xué)診斷的標本：雙份血清80第八十頁，共一百七十四頁，編輯于2023年，星期一2、常規(guī)分離與鑒定動物接種雞胚接種組織培養(yǎng)器官培養(yǎng)移植培養(yǎng)

細胞培養(yǎng)

原代細胞培養(yǎng)二倍體細胞培養(yǎng)傳代細胞培養(yǎng)三大培養(yǎng)方法81第八十一頁，共一百七十四頁，編輯于2023年，星期一病毒在細胞內(nèi)增殖的指標1、CPE2、紅細胞吸附正常細胞病變細胞82第八十二頁，共一百七十四頁，編輯于2023年，星期一83Theidentificationofmicroorganismsinbiopsysamplesisenhancedbytheselectiveapplicationofwidelyavailablehistochemicalstains.Pathologistsshouldbeawareofthespectrumofhistochemicalstainingbymicroorganismsandknowledgeablewithrespecttohowtoformulatecombinationsofstainstoenhancediagnosticspecificity.HistochemicalStainingCharacteristics第八十三頁，共一百七十四頁，編輯于2023年，星期一

細胞的變化有些病毒在細胞內(nèi)增殖時可引起特有的細胞病變，稱為細胞病變效應(yīng)(CPE)。常見的變化有細胞變圓、聚集、壞死、溶解或脫落等。有些病毒如麻疹病毒、CMV、RSV等作用于細胞膜，可使鄰近的細胞相互融合，形成多核巨細胞或稱融合細胞。有些病毒(如狂犬病病毒、麻疹病毒等)可在培養(yǎng)細胞中形成胞漿或核內(nèi)的包涵體。病毒在培養(yǎng)細胞中增殖的指標84第八十四頁，共一百七十四頁，編輯于2023年，星期一2.紅細胞吸附(hemadsorption,HAd)流感或副流感病毒等感染細胞后，由于細胞膜上出現(xiàn)了血凝素(haemagglutinin,HA)，具有吸附脊椎動物(豚鼠、雞、猴等)紅細胞的能力，這一現(xiàn)象稱紅細胞吸附，常用來測定具有HA的粘病毒與副粘病毒的增殖。若有相應(yīng)的抗血清，則能中和細胞膜上的HA，HAd不再發(fā)生，稱紅細胞吸附抑制試驗。85第八十五頁，共一百七十四頁，編輯于2023年，星期一3.干擾現(xiàn)象(interference)

某些病毒感染細胞時不出現(xiàn)CPE或其他易于測出的變化(如HAd)，但能干擾在其后感染的另一病毒的增殖。如風(fēng)疹病毒感染Vero細胞時CPE不明顯，但它能干擾后感染的埃可病毒(ECHOV)的增殖，從而阻抑后者所特有的CPE。864.細胞代謝的改變

病毒感染細胞的結(jié)果可使培養(yǎng)液的pH值改變，說明細胞的代謝在病毒感染后發(fā)生了變化。這種培養(yǎng)環(huán)境的生化改變也可作為判斷病毒增殖的指標。第八十六頁，共一百七十四頁，編輯于2023年，星期一病毒數(shù)量和感染性測定1、蝕斑試驗2、ID50

或TCID50

病毒感染雞胚動物或細胞后，引起50%發(fā)生死亡或病變的最小量

病毒感染單層細胞后，產(chǎn)生的局限性病灶，稱蝕斑，蝕斑是由一個感染性病毒體復(fù)制形成的，稱蝕斑形成單位，病毒懸液中的感染性病毒量以每毫升的蝕斑形成單位來表示87第八十七頁，共一百七十四頁，編輯于2023年，星期一病毒的快速診斷光鏡-----包涵體電鏡免疫熒光ELISA分子生物學(xué)技術(shù)雜交SouthernblotPCRNorthernblot88第八十八頁，共一百七十四頁，編輯于2023年，星期一

病毒的血清學(xué)診斷中和試驗補體結(jié)合試驗血凝抑制試驗免疫擴散等89第八十九頁，共一百七十四頁，編輯于2023年，星期一病毒感染的快速診斷

快速診斷主要是指從含有病毒標本及感染機體的血清中檢測病毒顆粒、蛋白抗原、IgM抗體和核酸等，往往在數(shù)小時內(nèi)即可得出結(jié)果。90第九十頁，共一百七十四頁，編輯于2023年，星期一(一)形態(tài)學(xué)檢查1.電鏡和免疫電鏡檢查2.普通光學(xué)顯微鏡檢查有些病毒在宿主細胞內(nèi)增殖后，在細胞的一定部位(胞核、胞漿或兩者兼有)出現(xiàn)一個或數(shù)個、圓形或橢圓形、嗜酸性或嗜堿性的結(jié)構(gòu)，即包涵體。包涵體對病毒感染的診斷有一定價值。91第九十一頁，共一百七十四頁，編輯于2023年，星期一(二)病毒蛋白抗原檢查

用熒光素、放射性同位素、過氧化物酶等標記抗體，采用免疫學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)，檢測標本中的病毒蛋白抗原，具有敏感、特異、快速等優(yōu)點。1.免疫熒光技術(shù)(immunofluorescence,IF)2.固相放射免疫測定(solid-phaseradioimmunoassay,SPRIA)3.酶免疫技術(shù)(enzymeimmunoassay,EIA)此法可檢測多種病毒及其抗體，主要是酶免疫組化法和酶聯(lián)免疫吸附試驗法(ELISA)。92第九十二頁，共一百七十四頁，編輯于2023年，星期一(三)特異性IgM抗體的檢測

檢測病毒特異性IgM抗體可診斷急性感染，特別是對證實孕婦感染風(fēng)疹病毒尤為重要，但應(yīng)注意類風(fēng)濕因子(IgM)的干擾。另外，檢測早期抗原的抗體是快速診斷的另一途徑。如檢測針對EBV的早期抗原(EA)、核心抗原(EANA)和衣殼抗原(VCA)等的抗體，可以區(qū)別急性或慢性EBV感染。此外，分子生物學(xué)檢測技術(shù)、氣相色譜技術(shù)等，均可用來分析和鑒定病毒感染。93第九十三頁，共一百七十四頁，編輯于2023年，星期一(四)檢測病毒核酸

1.核酸雜交技術(shù)用于病毒檢測的有斑點雜交、細胞內(nèi)原位雜交、DNA印跡雜交、RNA印跡雜交等。2.核酸擴增法目前多數(shù)病毒基因已通過分子克隆技術(shù)被明確了核苷酸序列，使得DNA擴增技術(shù)逐步發(fā)展為常規(guī)診斷技術(shù)之一。3.基因芯片技術(shù)94第九十四頁，共一百七十四頁，編輯于2023年，星期一基因芯片又稱DNA芯片、生物芯片（biochip）。其原理是：將已知的生物分子探針或基因探針，大規(guī)模或有序排布于小塊硅片等載體上，與待測樣品中的生物分子或基因序列相互作用和并行反應(yīng)，在激光的激發(fā)下，產(chǎn)生的熒光譜信號被接受器收集，計算機自動分析處理數(shù)據(jù)并報告結(jié)果。其優(yōu)點是：可以一次性完成大量樣品DNA序列的檢測和分析，解決了傳統(tǒng)核酸雜交技術(shù)的許多不足。芯片技術(shù)在病毒等微生物學(xué)診斷和流行病學(xué)調(diào)查方面有著廣闊的應(yīng)用前景。95第九十五頁，共一百七十四頁，編輯于2023年，星期一96

第九十六頁，共一百七十四頁，編輯于2023年，星期一97任務(wù)1

病毒的動物培養(yǎng)技術(shù)動物的選擇

應(yīng)當(dāng)選擇SPF動物。選擇動物的條件下：①選用對病毒易感性高。②動物健康、體重、年齡盡可能一致，符合培養(yǎng)病毒要求。③遺傳特性相似，實驗結(jié)果具有一致性、準確性和可比性。④外購動物要了解當(dāng)?shù)貏游锶航】?，飼養(yǎng)及免疫接種情況，接前要經(jīng)過健康觀察，以免誤用帶有病原體動物。

第九十七頁，共一百七十四頁，編輯于2023年，星期一981.皮內(nèi)接種2.皮下接種3.肌肉接種4.靜脈接種5.腹腔接種動物接種途徑和方法第九十八頁，共一百七十四頁，編輯于2023年，星期一99

動物接種后的飼養(yǎng)管理與收獲病毒

1.接種病毒后的動物,每天觀察和檢查規(guī)定的各項指標，主要有精神、食欲、糞便、尿液、被毛狀態(tài)、活動情況和接種部位的局部反應(yīng)，每天測體溫1次，做好記錄。

2.出現(xiàn)反應(yīng)癥候動物，按規(guī)定方法剖殺，采取含病毒高的組織臟器。第九十九頁，共一百七十四頁，編輯于2023年，星期一100任務(wù)2

病毒的禽胚培養(yǎng)技術(shù)

能力目標：能夠運用此項技術(shù)完成對特定病毒的培養(yǎng)。工序過程：如何完成此項任務(wù)？選擇禽胚前孵育接種后孵育收獲病毒任務(wù)導(dǎo)入禽胚的特點第一百頁，共一百七十四頁，編輯于2023年，星期一101工序3

禽胚的接種途徑各工序操作要點痘病毒和皰疹病毒，10～13日齡

流感、新城疫、傳支等，9～11日齡鸚鵡熱衣原體和立克次氏體等，6～8日齡正粘病毒和副粘病毒，10～11日齡第一百零一頁，共一百七十四頁，編輯于2023年，星期一102工序4禽胚的接種后孵育

接種后，蠟淚封孔，置37℃下孵化，每天照蛋2次以上，通過禽胚的病變初步確定病毒的存在及增殖情況，淘汰24h內(nèi)死胚。各工序操作要點病毒感染指征：死亡充血、出血或出現(xiàn)壞死灶畸形出現(xiàn)痘斑第一百零二頁，共一百七十四頁，編輯于2023年，星期一103工序5病毒的收獲

各工序操作要點

絨毛尿囊膜接種

尿囊膜接種卵黃囊接種羊膜腔接種第一百零三頁，共一百七十四頁，編輯于2023年，星期一104照蛋任務(wù)實例—病毒的尿囊腔接種培養(yǎng)技術(shù)第一百零四頁，共一百七十四頁，編輯于2023年，星期一105尿囊腔接種法獸用生物制品技術(shù)第一百零五頁，共一百七十四頁，編輯于2023年，星期一106接種部位消毒任務(wù)實例—病毒的尿囊腔接種培養(yǎng)技術(shù)第一百零六頁，共一百七十四頁，編輯于2023年，星期一107尿囊腔接種任務(wù)實例—病毒的尿囊腔接種培養(yǎng)技術(shù)第一百零七頁，共一百七十四頁，編輯于2023年，星期一108收獲尿囊液—每枚雞胚收獲尿囊液6～8ml任務(wù)實例—病毒的尿囊腔接種培養(yǎng)技術(shù)第一百零八頁，共一百七十四頁，編輯于2023年，星期一109影響禽胚培養(yǎng)病毒的因素㈠種蛋質(zhì)量

1.病原微生物；2.母源抗體；3.抗生素㈡孵化技術(shù)

1.溫度控制在37～39.5℃。有些病毒對溫度比較敏感，如雞胚接種傳染性支氣管炎病毒后，不應(yīng)超過37℃；

2.濕度雞胚孵化濕度標準為53%～57%，水禽胚孵化濕度比雞胚高5%～10%；

3.通風(fēng)禽胚發(fā)育是需氧量較大，加強通風(fēng)換氣；

4.翻蛋及時翻動促進發(fā)育等，但因地制宜。㈢接種技術(shù)通常雞胚發(fā)育到13～14日齡，鴨胚發(fā)育至15～16日齡，尿囊液含量最高，平均6～8ml，羊水1～2ml。第一百零九頁，共一百七十四頁，編輯于2023年，星期一110任務(wù)3病毒的細胞培養(yǎng)技術(shù)子任務(wù)1細胞培養(yǎng)技術(shù)培養(yǎng)常用的細胞上皮細胞、成纖維細胞細胞培養(yǎng)的方式原代培養(yǎng)：從直接取自生物體細胞、組織或器官開始的培養(yǎng)。

次代培養(yǎng)：將原代細胞培養(yǎng)物輕微消化后，再洗下分裝至含新鮮培養(yǎng)液的培養(yǎng)管中繼續(xù)培養(yǎng)。傳代培養(yǎng)：將培養(yǎng)細胞以一個培養(yǎng)瓶轉(zhuǎn)移或移植到另一個培養(yǎng)瓶中進行培養(yǎng)。

第一百一十頁，共一百七十四頁，編輯于2023年，星期一111任務(wù)3病毒的細胞培養(yǎng)技術(shù)子任務(wù)1細胞培養(yǎng)技術(shù)培養(yǎng)常用的細胞上皮細胞、成纖維細胞細胞培養(yǎng)的方式原代培養(yǎng)：從直接取自生物體細胞、組織或器官開始的培養(yǎng)。

次代培養(yǎng)：將原代細胞培養(yǎng)物輕微消化后，再洗下分裝至含新鮮培養(yǎng)液的培養(yǎng)管中繼續(xù)培養(yǎng)。傳代培養(yǎng)：將培養(yǎng)細胞以一個培養(yǎng)瓶轉(zhuǎn)移或移植到另一個培養(yǎng)瓶中進行培養(yǎng)。

第一百一十一頁，共一百七十四頁，編輯于2023年，星期一112細胞培養(yǎng)技術(shù)（cellculture)

細胞培養(yǎng)技術(shù)是選用各種細胞的最佳生存條件對活細胞進行培養(yǎng)和研究的技術(shù)。即：利用機械、酶或化學(xué)方法使活體動物組織或傳代細胞分散成單個乃至2～4個細胞團懸液的培養(yǎng)，使之能繼續(xù)生存、生長、增殖的一種方法。廣義上:還包括組織培養(yǎng)、器官培養(yǎng)。第一百一十二頁，共一百七十四頁，編輯于2023年，星期一113培養(yǎng)常用的細胞

上皮細胞、成纖維細胞根據(jù)培養(yǎng)細胞的染色體和繁殖特性，可分為：⑴原代細胞

直接利用新鮮動物組織經(jīng)胰蛋白酶消化、分散，獲得單個細胞，如雞胚成纖維細胞，此細胞對病毒的檢測最為敏感，但制備和應(yīng)用不方便。

⑵二倍體細胞（細胞株）

由原代細胞或次代細胞選育出具有特殊生物學(xué)性質(zhì)和標記的細胞，如豬腎細胞株（PK-15）和乳倉鼠腎細胞株（BHK-21）等。適用于病毒性生物制品的制備，常用于疫苗生產(chǎn)，安全可靠。

⑶傳代細胞（非二倍體細胞系、異倍體細胞）

指不再保持原來細胞的二倍體細胞數(shù)，在體外可以無限傳代的細胞，如人子宮癌細胞（HeLa細胞）和鼠腎腺癌細胞（RAG細胞）等。有致癌性，不能用于疫苗生產(chǎn)，多用于病毒的分離鑒定。

第一百一十三頁，共一百七十四頁，編輯于2023年，星期一1141.培養(yǎng)液：生長液、維持液，Eagle氏液、RPMI-1640、199、DMEM、MEM等營養(yǎng)液

。

2.細胞接種量:適宜。

3.pH：一般為7.0～7.4因細胞種類不同而略有差異。

4.溫度：一般為37～38℃。

5.氣體：氧氣和二氧化碳。

6.無菌條件：培養(yǎng)的全過程都要求嚴格的無菌條件。細胞培養(yǎng)的基本條件第一百一十四頁，共一百七十四頁，編輯于2023年，星期一115

各種組織是靠細胞間質(zhì)黏合而成的，要獲得分散的細胞，必須破壞細胞間質(zhì)。分散細胞的方法的三種：⑴機械分散法：適用于細胞間連接較松的組織，如禽胚組織。

⑵酶消化法：此法適用于原代細胞的制備及細胞的傳代培養(yǎng)。

⑶螯合劑分散法：一般只用于單層細胞的分散。

第一百一十五頁，共一百七十四頁，編輯于2023年，星期一116

1.單層細胞培養(yǎng)法

用胰酶將剪碎的組織或傳代細胞分散成2～6個成團的細胞，接種到培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板上，讓細胞貼壁生長，靜置培養(yǎng)或轉(zhuǎn)瓶生長培養(yǎng)。

2.懸浮細胞培養(yǎng)法（攪拌培養(yǎng)）

通過振蕩或轉(zhuǎn)動裝置使細胞始終分散懸浮于培養(yǎng)液內(nèi)的培養(yǎng)方法。

3.微載體培養(yǎng)通過攪拌懸浮在培養(yǎng)液內(nèi)，使微小細胞在載體表面繁殖成單層的一種細胞培養(yǎng)技術(shù)，兼有單層和懸浮細胞培養(yǎng)的優(yōu)點。

細胞培養(yǎng)方法第一百一十六頁，共一百七十四頁，編輯于2023年，星期一117犢牛肝臟單層細胞第一百一十七頁，共一百七十四頁，編輯于2023年，星期一118雞胚成纖維細胞培養(yǎng)—雞胚的處理9-11日齡的雞胚第一百一十八頁，共一百七十四頁，編輯于2023年，星期一119雞胚成纖維細胞培養(yǎng)—雞胚的處理9日齡雞胚11日齡雞胚第一百一十九頁，共一百七十四頁，編輯于2023年，星期一120雞胚成纖維細胞培養(yǎng)—雞胚的處理第一百二十頁，共一百七十四頁，編輯于2023年，星期一121雞胚成纖維細胞培養(yǎng)—雞胚的處理第一百二十一頁，共一百七十四頁，編輯于2023年，星期一122子任務(wù)2病毒培養(yǎng)技術(shù)細胞的選擇選擇相應(yīng)易感動物的組織細胞。細胞培養(yǎng)病毒條件⒈血清：促進細胞生長和貼壁的成分。

⒉溫度：多數(shù)為37℃

。⒊pH值：pH在7.6～7.8

⒋接毒量與接毒方法：一般按維持液的1～10%接入。

第一百二十二頁，共一百七十四頁，編輯于2023年，星期一123病毒增值指標與收獲

多數(shù)病毒在敏感細胞增殖可引起細胞代謝等方面的變化，發(fā)生形態(tài)改變，即細胞病變（CPE）。通常用CPE作為判定病毒毒力的指標，即計算病毒的TCID50。

CPE顯微鏡下主要表現(xiàn)為：①細胞圓縮②細胞融合形成合胞體③輕微病變

有些病毒在細胞上增殖并不產(chǎn)生CPE，可檢查包涵體和血凝性作為病毒增殖的指標。第一百二十三頁，共一百七十四頁，編輯于2023年，星期一（一）、選擇采標本的時間：1、病毒分離鑒定一般取發(fā)病初期或急性期標本；2、血清學(xué)診斷取患者早期（測IgM)和恢復(fù)期雙份血液。（二）不同病毒感染采不同標本：呼吸道感染——采鼻咽分泌物；肺部感染——采痰液腸道感染——采糞便；病毒血癥——采血液神經(jīng)系統(tǒng)感染——采腦脊液。一、標本的采集與送檢：一、病毒感染的檢查方法124第一百二十四頁，共一百七十四頁，編輯于2023年，星期一標本送檢：

1、標本采集后應(yīng)盡快送檢；

2、如不能及時檢查，標本宜置冰壺內(nèi)保存，病變組織可置于50%甘油鹽水中低溫保存；

3、標本的長期保存應(yīng)置于-70℃低溫冰箱，或-196℃液氮罐中。125第一百二十五頁，共一百七十四頁，編輯于2023年，星期一病毒的分離培養(yǎng)和鑒定：（一）細胞培養(yǎng)（最常用）：標本原代細胞傳代細胞細胞病變血細胞吸附PH值改變等特異性抗體鑒定126第一百二十六頁，共一百七十四頁，編輯于2023年，星期一（二）雞胚接種尿囊腔接種羊膜腔接種流感病毒流感病毒尿液羊水血凝及血凝抑制試驗鑒定病毒（三）動物培養(yǎng)（少用）流感病毒+紅細胞血凝流感病毒+特異抗體血凝被抑制127第一百二十七頁，共一百七十四頁，編輯于2023年，星期一二、病毒感染的快速檢查方法：（一）測抗原：標本+熒光標記抗體（已知）酶標記抗體（已知）熒光顯微鏡觀察加底物后觀察ELISA法：乳膠凝集法：128第一百二十八頁，共一百七十四頁，編輯于2023年，星期一檢查病毒抗原1、免疫熒光技術(shù)：直接法：標本+熒光標記抗體→熒光顯微鏡觀察間接法：標本+抗體+熒光標記二抗→熒光顯微鏡觀察2、酶免疫技術(shù)：酶免疫組化法：標本+酶標抗體+酶的底物→光學(xué)顯微鏡觀察顏色變化

ELISA法：抗體或抗原（反應(yīng)板）+待檢抗原或抗體+酶標抗體或抗原

+底物→比色計測底物顏色129第一百二十九頁，共一百七十四頁，編輯于2023年，星期一測抗體（多用ELISA法）：IgM型抗體：早期診斷價值；

IgG型抗體：應(yīng)用早期及恢復(fù)期雙份血清，后者抗體效價是前者的4倍以上時，有輔助診斷價值；

IgG型抗體（感染后期）：隨訪測抗體效價，如有4倍降低，有輔助診斷價值。130第一百三十頁，共一百七十四頁，編輯于2023年，星期一病毒感染的血清學(xué)診斷（雙份血清）

１、中和試驗病毒+待檢血清（系列稀釋）→組織細胞→觀察CPE

２、血凝抑制試驗病毒＋紅細胞（雞、人等）→血凝現(xiàn)象病毒＋待檢血清＋紅細胞（雞、人等）→血凝現(xiàn)象消失131第一百三十一頁，共一百七十四頁，編輯于2023年，星期一病毒核酸的測定：（一）病毒基因探針法：1、標本

病毒基因探針（標記）+雜交

放射自顯影生物素-親和素系統(tǒng)2、Southern印跡法標本DNA凝膠電泳轉(zhuǎn)移至膜上+病毒探針分析標本中核酸情況132第一百三十二頁，共一百七十四頁，編輯于2023年，星期一多聚酶鏈反應(yīng)（PCR）：敏感度極高標本提取核酸DNA+耐熱DNA多聚酶RNA轉(zhuǎn)錄DNADNA擴增電泳基因片段觀察133第一百三十三頁，共一百七十四頁，編輯于2023年，星期一DiagnosticMethodsinVirology1.DirectEx